高曉敏，鄒曉英，岳 林

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，牙體牙髓科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100081)

外泌體是機體內(nèi)大部分細胞都能分泌的一種直徑在30～150 nm的微囊泡[1]。20世紀80年代發(fā)現(xiàn)外泌體時，最初認為它是細胞為了維持自身穩(wěn)定狀態(tài)向外排泄廢物的途徑[2]。20世紀90年代末，Raposo等[3]發(fā)現(xiàn)，人和鼠來源的B淋巴細胞外泌體含有組織相容復(fù)合體-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ)分子，可以誘發(fā)T淋巴細胞的免疫反應(yīng), 提示外泌體在信號傳導(dǎo)方面具有重要意義。2007年，Valadi等[4]通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，小鼠MC/9細胞來源的外泌體內(nèi)含有RNA成分，能夠轉(zhuǎn)運至受體細胞中表達產(chǎn)生蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)由于外泌體存在膜包被，外泌體的RNA成分能夠抵抗RNA消化酶的降解作用,這進一步說明外泌體介導(dǎo)細胞間信號信息傳導(dǎo)的重要作用。

隨著組織再生工程學(xué)的發(fā)現(xiàn)，人們逐漸注意到外泌體所攜帶的信號分子有助于干細胞的定向分化。2016年Huang等[5]發(fā)現(xiàn)，牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)和骨髓間充質(zhì)干細胞可以攝取DPSCs外泌體，外泌體可以促進二者向成牙本質(zhì)向分化。2018年，Xian等[6]的研究發(fā)現(xiàn)人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞同樣可以攝取DPSCs外泌體，且外泌體可促進人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞的增殖、促血管生成因子的表達以及增強其小管的形成，提示牙髓干細胞外泌體在促進牙髓再生方面具有潛能。2014年，Liu等[7]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞衍生因子可以促進根尖牙乳頭干細胞(stem cells from apical papilla, SCAP)的遷移，為誘導(dǎo)根尖組織的干細胞進入根管內(nèi)提供了新的方案,但如何誘導(dǎo)SCAP向成牙本質(zhì)向定向分化仍是實現(xiàn)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生的關(guān)鍵問題，SCAP能否攝取DPSCs外泌體并利用其信號實現(xiàn)定向分化尚不明確。

本研究目的是探討SCAP對DPSCs外泌體的攝取作用及攝取的介導(dǎo)途徑，為揭示其內(nèi)吞外泌體的機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 DPSCs外泌體的提取與鑒定

1.1.1分離培養(yǎng)DPSCs、SCAP 收集北京大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科門診因阻生或正畸需要而拔除的前磨牙或第三磨牙。本研究獲得北京大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(PKUSSIRB-201412020)。離體牙納入標準：患者18～25歲，牙齒完整、無齲損、無牙髓或根尖周炎癥、無牙周疾病，供者身體健康，自愿簽署知情同意書。本研究選用根尖牙乳頭干細胞供者為18歲男性左下第三磨牙、21歲女性右下第三磨牙、22歲男性右下第三磨牙；牙髓干細胞供者為24歲女性左下第二前磨牙、18歲男性右下第一前磨牙、20歲女性右上第二前磨牙。于超凈臺中切取離體牙根尖的牙乳頭組織，使用咬骨鉗鉗碎患牙并取出牙髓組織。將上述組織分別切碎至1 mm×1 mm×1 mm，用3 g/L的Ⅰ型膠原酶(Worthington公司，美國)和4 g/L 分離酶(Sigma公司，美國)，37 ℃ 消化30～40 min。將消化后的細胞懸液過70 μm 細胞篩，以獲得單細胞懸液。將單細胞懸液加入6 孔板(Corning公司，美國)中，加入含有15%(體積分數(shù))胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%(體積分數(shù))L-谷氨酰胺及1%(體積分數(shù))青-鏈霉素(Gibco公司, 美國)、88% αMEM(α minimum Eagle’s medium，Hyclone公司, 美國)的普通培養(yǎng)基，置于5%(體積分數(shù))CO2，37 ℃ 培養(yǎng)。待細胞長滿至75%時，將原代細胞按照1 ∶3 傳代，至第3～4 代細胞備用。

1.1.2提取DPSCs外泌體 將胎牛血清在4 ℃條件下100 000×g超速離心12 h以去除胎牛血清中的外泌體。取第3代DPSCs細胞以1×107個細胞/孔接種于175 cm2培養(yǎng)瓶中，采用含有10%(體積分數(shù))胎牛血清的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)至5 d后，棄去上清，更換為不含外泌體的細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，收集上清液。將收集好的上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管。以下離心步驟均在4 ℃條件下完成：以300 ×g轉(zhuǎn)速離心10 min(除去上清液中的細胞)；將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL潔凈離心管，以2 000 ×g的轉(zhuǎn)速離心10 min(除去上清液中的死細胞)；將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL潔凈離心管，以10 000 ×g的轉(zhuǎn)速離心30 min(去除上清液中的細胞碎片)后收集上清液。采用相對分子質(zhì)量10 000 的孔徑超濾管(Millipore，sigma公司，美國)對離心后的上清液進行超濾濃縮，將濃縮后的上清液加入超速離心機(Optima XPN-10，Backman公司，美國)配套的離心管，100 000×g超速離心70 min。離心結(jié)束后，棄去上清液，加入0.5 mL PBS重懸沉淀，獲得提取物懸液，置于-80 ℃保存。

1.1.3DPSCs外泌體的鑒定 透射電鏡觀察提取物形態(tài)：將10 μL提取物懸液，用50 μL 2%(體積分數(shù))多聚甲醛室溫固定30 min，取上述混合液8 μL，滴加至碳涂層銅網(wǎng)格上，風(fēng)干10 min，再用1%(體積分數(shù))醋酸雙氧鈾染色兩次，每次6 min。將銅網(wǎng)裝入透射電鏡(JEM-1400，JEOL公司，日本)， 電壓設(shè)置為120 kV，觀察提取物形態(tài)。粒徑分布：取1 mL 提取物懸液，采用納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)用于確定粒徑分布。使用納米粒子跟蹤分析儀(NS3000，Malvern公司，英國)記錄布朗運動下外泌體的運動軌跡，并通過NTA分析軟件進行分析。Western blot檢測外泌體標志蛋白：取50 μL提取物懸液，加入20 μL的1%(質(zhì)量分數(shù))Triton裂解液，冰上裂解30 min，超聲破碎1 min。4 ℃ 12 000 r/min離心30 min提取蛋白，BCA蛋白試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)檢測蛋白濃度，記錄結(jié)果。100 ℃ 水浴 5 min，配膠(12% SDS-PAGE，碧云天公司，中國)， 15 μL蛋白上樣，蛋白分離2 h (電泳電壓為125 V)， 切膠；1.5 h后蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜(Millipore Corporation公司，美國)上(轉(zhuǎn)膜電壓為100 V)；脫脂牛奶封閉1 h；加入一抗CD63(1 ∶500，ab68418，Abcam公司，美國)/TSG101(1 ∶500，14497-1-AP，Proteintech公司，美國)/GAPDH(1 ∶500，10494-1-AP，Proteintech公司，美國) 4 ℃ 孵育過夜；用TBST 洗膜3次，每次10 min；用抗兔IgG抗體(1 ∶1 000，10285-1-AP，Proteintech公司，美國)孵育1 h； TBST 洗膜3次，每次10 min；應(yīng)用學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Proteintech公司, 美國), 凝膠成像系統(tǒng)(Vilber Lourmat公司, 美國)曝光。

1.2 SCAP對DPSCs外泌體的攝取

1.2.1PKH-26標記DPSCs外泌體 采取PKH-26(一種親脂性染料，可以穩(wěn)定地與細胞膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合并發(fā)出熒光)膜標記技術(shù)標記DPSCs外泌體。將1 mL 10 mg/L(根據(jù)第1.1.3小節(jié)測定的蛋白濃度稀釋)的外泌體重懸液加入1 mL 稀釋液C(Sigma公司，美國)中，同時將4 μL的PKH-26(Sigma公司，美國)加入1 mL的稀釋液C中，將兩份溶液混合，共孵育4 min，而后加入2 mL 0.5% (質(zhì)量分數(shù))BSA中和未結(jié)合的染液，采用 0.5% BSA溶液中和未標記外泌體的PKH-26染料作為陰性對照組。將標記好的外泌體加入PBS中，100 000×g轉(zhuǎn)速下離心70 min(4 ℃)，棄去上清液，將沉淀用PBS重懸。

1.2.2SCAP對DPSCs外泌體的攝取作用 取第3代細胞以5×103個細胞/孔接種于圓形蓋玻片，待細胞培養(yǎng)至80%匯合時，將第1.2.1小節(jié)中獲得的重懸液加入SCAP的培養(yǎng)基中，分別在37 ℃和4 ℃與SCAP共培養(yǎng)6 h。6 h后收集樣本，PBS沖洗兩遍，加入4%(體積分數(shù))多聚甲醛固定液(Solabrio公司，中國)固定10 min，PBS沖洗3遍。加入含有4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(4’,6-diamino-2-phenylindole，DAPI，Sigma公司，美國)的封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察SCAP內(nèi)PKH-26的表達情況。

1.3 攝取過程依賴的胞吞途徑

1.3.1分組 采用不同胞吞抑制劑分別抑制網(wǎng)格蛋白依賴、小窩蛋白介導(dǎo)和巨胞飲依賴途徑。(1)氯丙嗪(chlorpromazine，CPZ)組：采用10 μmol/L 網(wǎng)格蛋白依賴胞吞途徑抑制劑CPZ處理SCAP。(2)Genistein組：采用200 μmol /L 小窩蛋白介導(dǎo)胞吞途徑抑制劑genistein處理SCAP。(3)LY294002組：采用50 μmol /L 巨胞飲依賴胞吞途徑抑制劑LY294002處理SCAP。(4)溶劑對照組：采用與抑制劑組等量的溶劑DMSO處理SCAP作為對照。

1.3.2免疫熒光染色 取第3代細胞以5×103個細胞/孔接種于圓形蓋玻片上，待細胞培養(yǎng)至80%匯合時，按照上述分組，各組采用相應(yīng)培養(yǎng)液預(yù)處理SCAP 30 min(后續(xù)實驗一直存在于培養(yǎng)液中)， 將PKH-26標記好的DPSCs外泌體(10 mg/L)加入各組SCAP的培養(yǎng)基中。37 ℃共培養(yǎng)6 h后收集樣本，采用PBS沖洗3遍，加入4%(體積分數(shù))多聚甲醛固定液固定10 min，PBS沖洗3遍。加入含有DAPI的封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察SCAP內(nèi)紅色熒光表達。

1.3.3流式細胞分析術(shù) 取第3代細胞以5×104個細胞/孔接種于6孔板，待細胞培養(yǎng)至80%匯合時，按照上述分組，各組采用相應(yīng)培養(yǎng)液預(yù)處理SCAP 30 min(后續(xù)實驗一直存在于培養(yǎng)液中)，將PKH-26標記好的DPSCs外泌體(10 mg/L)加入各組SCAP的培養(yǎng)基中。37 ℃共培養(yǎng)6 h后收集樣本，將SCAP消化下來后PBS沖洗3遍，離心棄上清液，采用0.5%(質(zhì)量分數(shù)) BSA溶液重懸細胞，300 μm細胞篩過濾細胞形成單細胞懸液，應(yīng)用流式細胞儀(Aria Sorp，Becton, Dickinson公司，美國)檢測紅色熒光標記的根尖牙乳頭干細胞百分比。

2 結(jié)果

2.1 人DPSCs、SCAP的形態(tài)特征

經(jīng)酶消化法體外分離培養(yǎng)的人DPSCs、根尖牙乳頭細胞生長良好，呈梭形、多角形等典型的成纖維細胞樣形態(tài)，細胞大小基本一致(圖1)。原代培養(yǎng)約5 d后DPSCs(圖1A)、SCAP(圖1C)可見克隆集落形成，待各集落細胞逐漸匯合后可見DPSCs(圖1B)、SCAP(圖1D)排列整齊，呈漩渦狀生長。

2.2 DPSCs來源外泌體的特征

采用多步離心法結(jié)合超濾法提取細胞上清液中的外泌體，透射電鏡下可以觀察到DPSCs外泌體呈茶托樣，具有雙層膜結(jié)構(gòu)圖(圖2A、B)。納米粒子示蹤分析技術(shù)檢測DPSCs外泌體粒徑峰值為 144nm(圖2C)。Western Blot檢測DPSCs外泌體表達外泌體特征標志膜結(jié)合蛋白TSG101和四跨膜蛋白超家族CD63，不表達細胞內(nèi)參蛋白GAPDH(圖2D)。

2.3 SCAP對DPSCs外泌體的攝取

將PKH-26標記后的DPSCs外泌體與SCAP共培養(yǎng)后采用激光共聚焦顯微鏡觀察SCAP對DPSCs外泌體的攝取作用,可見藍色標記的是細胞核。陽性組在37 ℃條件下共培養(yǎng)6 h后可見大量紅色熒光(PKH-26)圍繞在細胞核周圍(圖3)，而4 ℃條件下共培養(yǎng)6 h后SCAP則未見明顯紅色熒光(PKH-26)標記(圖3),同時未添加外泌體的陰性對照組未見紅色熒光(PKH-26)標記(圖3)。

2.4 SCAP攝取DPSCs外泌體的介導(dǎo)途徑

為考察SCAP攝取外泌體的介導(dǎo)途徑，本研究設(shè)計了三種胞吞抑制劑CPZ、Genistein和LY294002，抑制SCAP的胞吞過程后進一步觀察不同的胞吞途徑對SCAP攝取外泌體的影響，代表性染色結(jié)果見圖4。溶劑對照組SCAP細胞核周圍存在大量紅色熒光(PKH-26)標記(圖4)，與陽性組(圖3)基本一致，而采用胞吞抑制劑對SCAP進行處理后，將PKH-26標記的DPSCs外泌體與SCAP共培養(yǎng)6 h后，CPZ組、Genistein組細胞核周圍紅色熒光(PKH-26)標記量明顯下降， LY294002組細胞核周圍紅色熒光(PKH-26)標記量有少量下降(圖4)。流式細胞分析結(jié)果(圖5)顯示陽性對照組中攝取外泌體的SCAP占35%，陰性對照組中有紅色熒光標記的SCAP占比0.5%。溶劑對照組中有紅色熒光標記的SCAP占比 29.7%，而CPZ、Genistein、LY294002處理SCAP后，紅色熒光標記的SCAP占比分別下降至13.7%、16.6%、20.9%，與上述免疫熒光染色的結(jié)果趨勢是一致的。

3 討論

采用酶消化法分別從根尖牙乳頭組織、牙髓組織中提取培養(yǎng)SCAP、DPSCs，經(jīng)劉敬一等[8]采用流式細胞鑒定顯示，分離培養(yǎng)的DPSCs、SCAP均表達間充質(zhì)干細胞特征標志STRO-1、CD146、CD105、CD90，不表達血管內(nèi)皮細胞標志CD45，符合間充質(zhì)干細胞特征。

3.1 DPSCs外泌體的特征

本研究經(jīng)超速離心法結(jié)合超濾法于DPSCs上清液獲得的提取物，符合國際細胞外囊泡學(xué)會2014年指導(dǎo)性聲明中的外泌體特征[9]。

對于外泌體粒徑分布，本研究通過納米粒子跟蹤分析法顯示DPSCs上清液提取物直徑峰值為144 nm。2015年，Pivoraite 等[10]采用動態(tài)激光散射技術(shù)對脫落乳牙DPSCs外泌體的直徑觀察發(fā)現(xiàn)，其直徑在30～70 nm范圍內(nèi)。Xian等[6]采用納米粒子跟蹤分析法對DPSCs外泌體的粒徑分布檢測結(jié)果為87～143 nm，與本研究結(jié)果相近。外泌體尺寸間的差異可能與其來源的細胞以及觀察方法不同有關(guān)。Sokolova 等[11]通過對人胚腎細胞293T、內(nèi)皮克隆形成細胞、間充質(zhì)干細胞三種不同類型的細胞的外泌體分別采用納米粒子分析技術(shù)和動態(tài)激光散射技術(shù)分析粒徑分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用相同技術(shù)分析不同細胞的外泌體直徑之間存在差異；對同一種細胞來源的外泌體采用不同方法分析其粒徑分布，結(jié)果也不同，本研究采用的是納米粒子跟蹤分析技術(shù)，它是分析顆粒在溶液中動態(tài)運動過程的流體動力學(xué)直徑，粒徑較大的顆粒會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，會造成粒徑結(jié)果略偏大。

3.2 SCAP對外泌體的攝取作用

本研究觀察到將DPSCs外泌體與SCAP在37 ℃共培養(yǎng)6 h后SCAP能夠攝取DPSCs外泌體，而在4 ℃培養(yǎng)條件下SCAP則沒有攝取外泌體。雖然4 ℃培養(yǎng)條件下DPSCs處于較低代謝狀態(tài)，但低溫抑制該攝取提示SCAP對DPSCs的攝取是一個主動的過程，而非外泌體隨機擴散進入SCAP。2012年，Tian等[12]采用實時熒光顯微鏡對PC12細胞對十八烷基羅丹明B氯化物(R18，一種親脂性陽離子染料，可以作為膜探針標記胞吞過程)標記的外泌體的攝取作用進行了觀察，發(fā)現(xiàn)PC12細胞對外泌體的攝取作用依賴胞吞途徑，而胞吞過程具有溫度依賴性，采用低溫孵育細胞的方法能夠抑制溫度依賴的胞吞途徑[13]。2016年，Kusuma 等[14]發(fā)現(xiàn)在4 ℃條件下，人血管內(nèi)皮細胞對于外泌體的攝取作用下降80%。Huang 等[5]采用37 ℃和4 ℃兩種條件下將DPSCs和骨髓間充質(zhì)干細胞與DPSCs外泌體進行共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 ℃條件下，兩者對DPSCs外泌體的攝取能力明顯下降，與本研究的結(jié)果一致。

3.3 SCAP攝取外泌體的介導(dǎo)途徑

本研究發(fā)現(xiàn)采用胞吞抑制劑CPZ、Genistein、LY294002處理SCAP后，SCAP對DPSCs外泌體的攝取能力有明顯下降。細胞胞吞途徑主要有以下4種，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑、小窩蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑、巨胞飲作用和吞噬作用，其中吞噬作用主要是一些具有特殊功能的細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞才會表達的生物學(xué)行為，因此本研究主要采用CPZ、Genistein、LY294002三種胞吞抑制劑抑制上述除吞噬作用外的三條胞吞途徑，研究SCAP攝取DPSCs外泌體的介導(dǎo)途徑。本研究選取的CPZ(10 μmol/L)、Genistein(200 μmol/L)、LY294002(50 μmol/L)經(jīng)過Tian等[12]采用鈣黃綠素細胞活性分析法檢測發(fā)現(xiàn)三者對細胞活性無明顯影響。2014年，Tian等[15]對PC12細胞攝取外泌體的機制的研究發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑和巨胞飲作用在PC12細胞攝取外泌體的過程中有重要作用，但該過程不依賴小窩蛋白依賴的胞吞途徑。2016年Huang等[5]經(jīng)體外研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs對DPSCs外泌體的攝取依賴小窩蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑，而不依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑。上述研究與本研究的結(jié)果不完全一致，這可能與不同的細胞對外泌體的攝取機制不同有關(guān)。2018年，Horibe 等[16]對人非小細胞肺癌細胞系(A549)、人結(jié)腸癌細胞(HCT116、COLO205)等細胞對同為A549細胞來源的外泌體的吞噬過程的研究發(fā)現(xiàn)，抑制胞吞途徑可以抑制細胞對外泌體的攝取作用，且COLO205細胞吞噬外泌體同時依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑和小窩蛋白依賴的胞吞途徑，HCT116細胞則僅依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑，而A549不依賴上述兩條途徑，提示即使外泌體來源相同，不同細胞攝取外泌體時依賴的胞吞途徑也可能存在差異。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SCAP能夠攝取DPSCs外泌體，低溫環(huán)境可影響該攝取過程，SCAP攝取外泌體主要依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑、小窩蛋白依賴的胞吞途徑和巨胞飲途徑，為進一步研究DPSCs外泌體對SCAP的作用提供了實驗依據(jù)。