周思敏， 郭麗萍， 張 君， 周 璐， 王邦茂

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 消化科， 天津 300052

肝臟巨噬細(xì)胞在維持免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，巨噬細(xì)胞的程序性壞死過程與其免疫功能密切相關(guān)。受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)家族為程序性壞死通路中的關(guān)鍵蛋白。其中，RIP1的泛素化狀態(tài)是決定傳遞巨噬細(xì)胞存活或死亡信號(hào)的關(guān)鍵[1]，RIP3為決定巨噬細(xì)胞走向程序性壞死或凋亡的轉(zhuǎn)換器，是介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的關(guān)鍵分子[2]。抑制程序性壞死對(duì)免疫性肝損傷有保護(hù)作用[3]，程序性壞死信號(hào)通路或?yàn)槊庖咝愿螕p傷的潛在治療靶點(diǎn)。

1 巨噬細(xì)胞在肝臟免疫穩(wěn)態(tài)中的作用

巨噬細(xì)胞在肝臟免疫穩(wěn)態(tài)中的重要作用已得到越來越廣泛的關(guān)注。Kupffer細(xì)胞是定居在肝臟的巨噬細(xì)胞，排列于肝血竇上皮之間構(gòu)成巨噬細(xì)胞屏障，在免疫耐受的形成和維持中具有重要作用[4]。定居在肝臟的Kupffer細(xì)胞表面表達(dá)多個(gè)Toll 樣受體(toll-like receptor，TLR)，在調(diào)控Kupffer細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的比例中具有重要作用[5]。當(dāng)這些細(xì)胞因子比例失調(diào)時(shí)，自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞活化，在自身免疫性肝炎(AIH)發(fā)病中發(fā)揮重要作用[6]。AIH是由于機(jī)體對(duì)自身肝細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性肝臟炎性疾病。AIH患者單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)處于過度活化狀態(tài)[7]，肝組織可見大量的巨噬細(xì)胞浸潤[8]，巨噬細(xì)胞持續(xù)浸潤與肝臟慢性炎癥的發(fā)生甚至纖維化的發(fā)生有十分密切的關(guān)系[9]。Zhang等[10]研究指出AIH患者肝組織大量浸潤的巨噬細(xì)胞高表達(dá)RIP3，RIP3信號(hào)通路可以調(diào)控多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)而介導(dǎo)炎性反應(yīng)，尤其對(duì)IL-6的調(diào)控作用最為顯著，進(jìn)一步支持了巨噬細(xì)胞程序性壞死在AIH致病過程中的重要作用。

在刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)誘導(dǎo)的免疫性肝損傷中，腹腔巨噬細(xì)胞活性減弱為導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)存在的重要原因[11]，選擇性抑制程序性壞死可顯著緩解ConA造成的肝損傷，其作用與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β等細(xì)胞因子減少有關(guān)[12]。固有免疫是導(dǎo)致自身免疫性肝損傷發(fā)病的重要因素，單核-巨噬細(xì)胞功能在固有免疫中的作用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。AIH小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面抗原遞呈分子及其協(xié)同刺激分子表達(dá)減低，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞抗原遞呈功能減低，可能是發(fā)病中的重要一環(huán)[11]。

2 程序性壞死參與巨噬細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)

巨噬細(xì)胞在肝臟免疫穩(wěn)態(tài)的維持中具有重要作用，而程序性壞死通路為調(diào)控巨噬細(xì)胞功能和死亡的關(guān)鍵通路。當(dāng)外界抗原如脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激巨噬細(xì)胞表面的TLR3或者TLR4時(shí)，可引起TIR結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)接蛋白(TIR domain containing adapter inducing interferon-β，TRIF)的募集，TRIF隨即與RIP1及RIP3通過RIP同型結(jié)構(gòu)域(RIP homotypic interaction motif, RHIM)相互作用。在Caspase相關(guān)分子被抑制的情況下，TRIF/RIP3可以導(dǎo)致下游活性氧(ROS)的異常積累，引起不依賴NF-κB活性的程序性壞死[13]。LPS刺激巨噬細(xì)胞后IL-33的釋放明顯增加，應(yīng)用Nec-1后則可明顯抑制IL-33的釋放[14]，提示了LPS刺激巨噬細(xì)胞后細(xì)胞因子的分泌過程由程序性壞死介導(dǎo)[15]。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)表達(dá)缺失的小鼠表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激增強(qiáng)，且發(fā)生程序性壞死的巨噬細(xì)胞增多[16]，提示MIF可能在調(diào)控程序性壞死過程中發(fā)揮重要作用。Yang等[17]對(duì)腦皮質(zhì)缺血的研究指出，通過對(duì)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，Myd88)信號(hào)通路的調(diào)控，RIP3的剔除可以使巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。RIP3可與單核-巨噬細(xì)胞能量代謝通路中的多種酶作用并增加其活性，促進(jìn)線粒體產(chǎn)生過多ROS，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，進(jìn)而使細(xì)胞谷氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖代謝增強(qiáng)[18]。

混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL)是程序性壞死的執(zhí)行者，是存在激酶結(jié)構(gòu)域但缺乏激酶活性的假激酶，是目前發(fā)現(xiàn)的程序性壞死最重要的下游效應(yīng)器。激活的RIP3可磷酸化MLKL的Thr357和Ser358位點(diǎn)，促進(jìn)程序性壞死的發(fā)生，而這兩個(gè)位點(diǎn)的突變能阻止MLKL與RIP3的結(jié)合，進(jìn)而阻斷程序性壞死進(jìn)程[19]。磷酸化的MLKL由單體狀態(tài)向寡聚體狀態(tài)轉(zhuǎn)化，從而結(jié)合磷酸肌醇和心肌磷脂，使整個(gè)復(fù)合體從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞膜或細(xì)胞器膜上，并形成通透性孔道，最終細(xì)胞膜發(fā)生破裂[20]。MLKL還可以促進(jìn)線粒體分裂因子磷酸甘油酸變位酶5(phosphoglycerate mutase family member 5，PGAM5)募集到壞死復(fù)合體上，進(jìn)而募集線粒體分裂因子1(dynamin-related protein 1，Drp1)。PGAM5通過促進(jìn)Drp1的673位點(diǎn)絲氨酸去磷酸化激活Drp1的GTPase活性，最終導(dǎo)致線粒體碎片化[21]。壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)容物DNA片段、ATP、促炎因子等損傷相關(guān)模式分子(damage associate molecular pattern molecule，DAMP)會(huì)被模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)識(shí)別，從而激活周圍細(xì)胞的免疫應(yīng)答，清除死亡細(xì)胞[22]。程序性壞死發(fā)生后，大量細(xì)胞內(nèi)容物溢出，是導(dǎo)致炎癥發(fā)生的重要原因，而RIP3或者M(jìn)LKL的缺失能阻止細(xì)胞的死亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[23]。DAMP還可以協(xié)同觸發(fā)生長因子，以持續(xù)性地放大炎癥效應(yīng)[24]。RIP3敲除的小鼠，細(xì)胞質(zhì)中的DAMP明顯降低，均表明程序性壞死有促炎作用[24]。Ni等[25]指出，ConA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要為程序性壞死，而不是細(xì)胞凋亡，因此程序性壞死在免疫性肝損傷中扮演了重要作用。

3 IKK復(fù)合物調(diào)控程序性壞死和凋亡通路的轉(zhuǎn)換

3.1 細(xì)胞死亡通路的啟動(dòng) 復(fù)合體Ⅰ的形成：程序性壞死通常在凋亡被抑制的情況下發(fā)生，當(dāng)細(xì)胞凋亡不能正常發(fā)生而細(xì)胞必須死亡時(shí)，程序性壞死作為凋亡的替補(bǔ)形式被激活[26]。能誘導(dǎo)程序性壞死和凋亡的因素非常多，目前研究最廣泛的模式是由TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖1)。TNFα與細(xì)胞膜上的性泛素鏈組合體復(fù)合物；IκBα-SR，不可降解的IκBα；Act.D，轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D；CHX，翻譯抑制劑環(huán)己酰亞胺。

注：A，當(dāng)抑制去泛素化酶CYLD活性時(shí)，cIAP1/2及LUBAC可以將Ub鏈偶聯(lián)到RIP1上，促進(jìn)RIP1的泛素化進(jìn)而調(diào)控IKK復(fù)合物的活化，激活NF-κB通路促進(jìn)細(xì)胞生存。IKK復(fù)合物可以直接磷酸化RIP1，進(jìn)而抑制RIP1的活性及RIP1介導(dǎo)的程序性壞死及凋亡。此外，F(xiàn)as凋亡抑制分子3也可以調(diào)控RIP1的泛素化；B，當(dāng)在IKK復(fù)合物下游抑制NF-κB通路的活性時(shí)(IκBα-SR、Act.D、CHX等)，RIPK1泛素化完成，有活性的IKK復(fù)合物仍然抑制RIP1的活性，復(fù)合體Ⅱ a活化，此過程為不依賴于RIP1的凋亡過程；C，cIAP1/2及LUBAC缺失既可以導(dǎo)致依賴RIP1激酶活性的凋亡，又可以誘導(dǎo)依賴RIP1激酶活性的程序性壞死。當(dāng)在IKK復(fù)合物上游抑制NF-κB通路的活性時(shí)(如cIAP1/2及LUBAC缺失時(shí))，RIP1泛素化被抑制，IKK復(fù)合物活性被抑制，IKK復(fù)合物對(duì)RIP1的抑制被解除。活化的RIP1促進(jìn)復(fù)合體Ⅱ b的形成，此即為依賴RIP1的凋亡過程；如果Caspase-8被抑制或者RIP3、MLKL表達(dá)被上調(diào)，則形成壞死復(fù)合物，細(xì)胞通過依賴RIP1的程序性壞死過程死亡。CYLD，頭帕腫瘤綜合征蛋白；cIAP，細(xì)胞凋亡抑制蛋白；LUBAC，線

圖1TNF-R1介導(dǎo)的程序性壞死與凋亡的交互調(diào)控

TNFR1受體結(jié)合后，受體迅速發(fā)生構(gòu)象變化，并通過質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的死亡結(jié)構(gòu)域募集多種蛋白參與這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，包括：RIP1、TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(TNFR1-associated death domain，TRADD)、TNF受體相關(guān)因子2(TNFR -associated factor 2，TRAF2)、LUBAC及cIAP等，它們一起形成“復(fù)合體Ⅰ”[27]，RIP1的泛素化狀態(tài)是決定傳遞巨噬細(xì)胞存活或死亡信號(hào)的關(guān)鍵[1]。cIAP1/2是重要的泛素化E3酶，可以產(chǎn)生K63連接的泛素鏈，這是RIP1的聚泛素化過程所必需的。此外，由cIAP產(chǎn)生的K63泛素鏈可募集到LUBAC，該復(fù)合物可產(chǎn)生M1連接的泛素鏈。

3.2 去泛素化酶及NF-κB通路對(duì)細(xì)胞存活及死亡的調(diào)節(jié) 目前為止，CYLD是最為明確的調(diào)節(jié)RIP1去泛素化的酶，可通過特異性去除RIP1上的K63多聚泛素鏈抑制NF-κB通路的活性進(jìn)而使細(xì)胞走向死亡[28]，而RIP1的K63聚泛素化修飾可起到激活NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而促存活的作用。CYLD的一個(gè)重要的特點(diǎn)是具有與TRAF2及NF-κB必需調(diào)節(jié)分子(NF-κB essential modulator，NEMO)結(jié)合的特異性位點(diǎn)[29-30]。CYLD對(duì)于TLR介導(dǎo)的程序性壞死是必要的，轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)CYLD可以使巨噬細(xì)胞不發(fā)生程序性壞死[31]。Legarda等[32]指出，當(dāng)巨噬細(xì)胞中TLR4活化時(shí)，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8(cysteinyl aspartate specific proteinase 8，Caspase-8)可以在D215 位剪切 CYLD，進(jìn)而抑制程序性壞死的發(fā)生。采用質(zhì)粒構(gòu)建的方法，CYLD在D215位點(diǎn)突變或者使用Caspase 抑制劑zVAD-FMK(benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone)時(shí)，CYLD不能被Caspase-8剪切，導(dǎo)致RIP1發(fā)生去泛素化并與RIP3 結(jié)合，促進(jìn)巨噬細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生。Caspase-8可以切割 RIP1、RIP3及CYLD 來抑制程序性壞死[33]，其抑制劑zVAD對(duì)于RIP1/RIP3復(fù)合體的形成是必要的[34]。CYLD還可以調(diào)節(jié)壞死復(fù)合體中RIP1的去泛素化從而促進(jìn)壞死復(fù)合體的活化，促進(jìn)程序性壞死的發(fā)生，此外，CYLD還可以調(diào)控程序性壞死中ROS的產(chǎn)生[35]。

3.3 IKK復(fù)合物調(diào)控程序性壞死和凋亡通路的轉(zhuǎn)換 IKK復(fù)合物是否受到抑制是決定細(xì)胞通過程序性壞死通路死亡或者通過凋亡通路死亡的關(guān)鍵因素。IKK亞基二聚化可以導(dǎo)致其激酶區(qū)域的磷酸化，若此過程伴隨IKK亞基C末端的非磷酸化，則IKK處于高活性狀態(tài)從而發(fā)揮作用[28]。此外，IKK復(fù)合物的活性還取決于RIP1的泛素化狀態(tài)[1]，cIAP1/2及LUBAC可以將Ub鏈偶聯(lián)到RIP1上進(jìn)而促進(jìn)RIP1的泛素化，進(jìn)而募集NEMO及 TAK結(jié)合蛋白2/3(TAK1-binding protein 2/3，TAB2/3)。一方面，NEMO起到穩(wěn)固IKK復(fù)合體與泛素化鏈的作用，它的缺失可以導(dǎo)致IKK在此通路的作用消失，從而誘導(dǎo)程序性壞死。另一方面，TAB2/3可以激活轉(zhuǎn)化生長因子激酶1(transforming growth factor activated kinase-1，TAK1)，進(jìn)而磷酸化并激活I(lǐng)KKβ，促進(jìn)細(xì)胞存活[36]。

當(dāng)從IKK復(fù)合物的上游或者下游抑制此通路時(shí)，細(xì)胞將通過不同的方式死亡。當(dāng)在IKK復(fù)合物下游抑制NF-κB通路的活性時(shí)，如應(yīng)用IκBα-SR、Act. D 或者CHX，此時(shí)RIPK1泛素化完成，有活性的IKK復(fù)合物不能使得蛋白酶體IκBα降解，但可以通過磷酸化RIP1進(jìn)而抑制RIP1的活性及RIP1介導(dǎo)的程序性壞死及凋亡[37]，復(fù)合體Ⅰ變得不穩(wěn)定，導(dǎo)致RIP1從細(xì)胞膜上解離，形成由TRADD、Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas-associated with death domain protein，F(xiàn)ADD)、Caspase-8組成的復(fù)合體Ⅱa。細(xì)胞通過不依賴RIP1的凋亡途徑死亡[38]；當(dāng)在IKK復(fù)合物上游抑制NF-κB通路的活性時(shí)(如cIAP1/2及LUBAC缺失時(shí))，Ub鏈不能偶聯(lián)到RIP1上，RIP1的泛素化則被抑制，IKK復(fù)合物的活性亦被抑制，IKK復(fù)合物對(duì)RIP1磷酸化的作用被抑制，細(xì)胞通過依賴RIP1的凋亡或程序性壞死途徑死亡[39]?；罨腞IP1可以促進(jìn)由RIP1、RIP3、FADD、Caspase-8組成的復(fù)合體Ⅱb的形成，此即為依賴RIP1的凋亡過程；當(dāng)RIP3和MLKL的表達(dá)水平足夠高或Caspase-8活性降低甚至缺失時(shí)，復(fù)合體Ⅱb則促進(jìn)壞死復(fù)合體的形成，激活依賴RIP1的程序性壞死通路[37]。

此外，RIP3在細(xì)胞凋亡中也起一定的作用。RIP3激酶位點(diǎn)點(diǎn)突變后，可以通過激活Caspase-8引起致死性的細(xì)胞凋亡；而剔除RIP3則不會(huì)激活Caspase-8，小鼠可以存活下來[40-41]。同樣地，MLKL的剔除可以引起RIP3的異常積累，導(dǎo)致Caspase-8的激活，進(jìn)而引起致死性的細(xì)胞死亡，但在RIP3被剔除后上述情況則不會(huì)發(fā)生[42]。Newton等[40]在RIP3的161位點(diǎn)用天冬酰胺替換天冬氨酸，從而構(gòu)建了喪失RIP3酶活性的遺傳工程小鼠(RIP3-D161N)。RIP3被完全剔除的小鼠能存活，而RIP3-D161N小鼠可以誘發(fā)依賴Caspase-8的致命性細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起小鼠卵黃囊血管異常。

4 程序性壞死與肝Kupffer細(xì)胞對(duì)肝外抗原的免疫應(yīng)答

Kupffer細(xì)胞在肝外抗原誘發(fā)的免疫性肝臟損傷中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Kupffer細(xì)胞表面可以表達(dá)PRR，使其能夠?qū)Π↙PS在內(nèi)的腸源性細(xì)菌產(chǎn)物作出應(yīng)答[43]。腸道菌群失調(diào)及肝臟PRR缺陷可導(dǎo)致肝臟共生菌群的紊亂，進(jìn)而引發(fā)肝臟免疫系統(tǒng)的異常激活。降低肝臟Kupffer細(xì)胞PRR信號(hào)的閾值，使其對(duì)腸源性細(xì)菌代謝產(chǎn)物敏感性增加，可以引發(fā)肝臟炎癥[44]。

無菌小鼠能抵抗ConA誘導(dǎo)的肝損傷[45]，提示了腸道菌群在啟動(dòng)免疫介導(dǎo)的肝臟炎癥中的重要作用。Manfredo等[46]研究發(fā)現(xiàn)，AIH患者腸屏障功能異常，且肝組織中可測(cè)得腸道鶉雞腸球菌的 DNA，提示特定的腸源性細(xì)菌在腸肝免疫對(duì)話中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Blériot等[47]指出腸道單核細(xì)胞增多性李斯特菌和腸道沙門氏菌的感染可以導(dǎo)致肝臟Kupffer細(xì)胞的程序性壞死，隨后單核細(xì)胞起源的巨噬細(xì)胞募集到肝臟從而取代壞死的Kupffer細(xì)胞。Pamer等[48]也指出李斯特菌對(duì)肝臟固有免疫和適應(yīng)性免疫都有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。通過調(diào)控DAMP激活的PRR信號(hào)通路，程序性壞死在LPS介導(dǎo)的免疫性肝損傷中起關(guān)鍵作用[15]。TLR信號(hào)通路也可激活巨噬細(xì)胞的程序性死亡。TLR3 被雙鏈RNA激活或TLR4被LPS激活后可募集TRIF，LPS聯(lián)合zVAD刺激小鼠巨噬細(xì)胞會(huì)引起巨噬細(xì)胞TRIF與RIP3相互作用，進(jìn)而發(fā)生程序性壞死，且此過程與LPS誘導(dǎo)的ROS系統(tǒng)活化有關(guān)[49]。Ma等[50]也在人巨噬細(xì)胞中得出同樣的結(jié)論。上述研究提示，程序性壞死在巨噬細(xì)胞對(duì)腸道抗原等外來抗原的免疫應(yīng)答中具有重要作用。

5 小結(jié)

綜上所述，程序性壞死通路是調(diào)控巨噬細(xì)胞功能和死亡的關(guān)鍵通路，研究程序性壞死和凋亡的具體分子機(jī)制,進(jìn)而分析在免疫性肝損傷過程中兩者的交互調(diào)控具有十分重要的意義。靶向調(diào)控IKK復(fù)合物的活性或?qū)?duì)免疫性肝病的治療提供廣闊的治療前景。該方向的進(jìn)一步研究將為闡明自身免疫性肝病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，并為自身免疫性肝病開創(chuàng)新的治療靶點(diǎn)。