李可心，潘其迪，衣艷嬌，楊倩，賈麗娜，徐慧

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州061000）

藜麥?zhǔn)且环N營(yíng)養(yǎng)豐富的糧食作物，其種子含有豐富的必需氨基酸、礦物質(zhì)和不飽和脂肪酸[1-4]。1989 年美國(guó)國(guó)家科學(xué)院將藜麥作為植物王國(guó)中最好的蛋白質(zhì)來(lái)源[5]。藜麥中蛋白質(zhì)含量高達(dá)12%～23%[6-7]，超過(guò)了小麥、大麥等主流谷物中的蛋白質(zhì)含量[8]。基于其豐富的蛋白質(zhì)含量，對(duì)于多肽的制備具有開(kāi)發(fā)的潛力。多肽具有良好的營(yíng)養(yǎng)特性，易消化吸收[9]，對(duì)降低膽固醇、降血壓、促進(jìn)脂肪代謝、抗疲勞、增強(qiáng)人體免疫力、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能具有輔助治療作用[10-13]。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，藜麥中含有具有抗氧化肽功能的活性肽[14]。田旭靜[15]研究發(fā)現(xiàn)藜麥多肽含有18 種氨基酸，其還原能力為0.644，對(duì)超氧陰離子和羥基自由基具有較好的清除能力。胡潔[16]、黃金[17]等研究結(jié)果表明，藜麥在萌芽過(guò)程中生物活性成分會(huì)顯著增加。目前對(duì)于藜麥多肽相關(guān)功能性食品、功能性添加劑開(kāi)發(fā)較少[18]，藜麥多肽相關(guān)產(chǎn)品在市場(chǎng)上仍是一個(gè)空缺[4]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化藜麥芽培養(yǎng)工藝條件，培養(yǎng)出富含多肽、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的多肽藜麥芽，制備多肽藜麥芽粉，并在此基礎(chǔ)上研究多肽藜麥芽粉在飲料中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥：山東老鄉(xiāng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；氯化鈉、硫酸錳、氯化鈣、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（分析純，純度：98%）：賽國(guó)生物試劑公司。

UV-1200 紫外分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；JRJ300-SH 均質(zhì)機(jī)：上海標(biāo)本模廠；SC-04 離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HH-8 電子恒溫水浴鍋：沃信科技有限公司；HSP-80B 恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海秉越電子儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藜麥芽的培養(yǎng)

樣品預(yù)處理：取3 g 藜麥，經(jīng)超純水清洗后于1%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，達(dá)到殺菌目的，然后用超純水清洗至pH 值為中性。

藜麥芽培養(yǎng)：課題組前期工作已確定藜麥芽培養(yǎng)液各組分濃度為硫酸錳1.32 mmol/L，氯化鈉3.26 mmol/L，氯化鈣1.09 mmol/L。取浸泡好的藜麥置于放有上述培養(yǎng)液的燒杯中，于一定溫度下水浴一段時(shí)間。將藜麥取出平鋪入放有雙層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（相對(duì)濕度為80%～90%）25 ℃避光培養(yǎng)一段時(shí)間，每12 h 噴灑一次超純水（達(dá)到濾紙飽和為宜），以保持藜麥濕潤(rùn)。

儲(chǔ)存：將藜麥芽取出用超純水清洗，置于-80 ℃冰箱，并在試驗(yàn)期間取出。

1.2.2 多肽含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品配置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液加4 mL 雙縮脲試劑，充分搖勻后37 ℃水浴20 min 后于540 nm 波長(zhǎng)下比色測(cè)定。

1.2.2.2 樣品多肽含量的測(cè)定

參考溫?zé)ū骩19]檢測(cè)方法進(jìn)行。取1 g 藜麥芽于研缽中，加入5 mL 超純水研磨，4 000 r/min 下離心15 min，棄去沉淀得上清液①。取上清液①2 mL 加入2 mL 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）12 000 r/min 離心 15 min，棄去沉淀得上清液②，取1 mL 上清液②加入4 mL 雙縮脲試劑，充分搖勻后37 ℃水浴20 min 后于540 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。

1.2.2.3 計(jì)算公式

樣品中多肽含量/（mg/g）=2 CV/m

式中：C 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為加入超純水體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g；2 為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)探討浸泡溫度、浸泡時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間3 個(gè)因素對(duì)藜麥芽中多肽含量的影響。

固定浸泡時(shí)間為4 h，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，浸泡溫度分別為 20、25、30、35、40 ℃，培養(yǎng)藜麥芽。

固定培養(yǎng)時(shí)間為48 h，浸泡溫度為25 ℃，浸泡時(shí)間分別為 2、4、6、8、10 h，培養(yǎng)藜麥芽。

固定浸泡溫度為25 ℃，浸泡時(shí)間為4 h，培養(yǎng)時(shí)間分別為 24、48、72、96、120 h，培養(yǎng)藜麥芽。

1.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素的基礎(chǔ)上，以培養(yǎng)時(shí)間、浸泡時(shí)間、浸泡溫度為影響因素，進(jìn)行三因素三水平正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.5 多肽藜麥芽粉的制備

取多肽藜麥芽按料水比1 ∶12（g/mL）進(jìn)行低溫打漿（水溫4 ℃），然后進(jìn)行冷凍干燥，收集冷凍干燥產(chǎn)物并進(jìn)行粉碎得到多肽藜麥芽粉。

1.2.6 多肽藜麥芽粉在飲料中的應(yīng)用

將1.2.5 中制備得到的多肽藜麥芽粉按一定質(zhì)量體積比與純凈水調(diào)配得到多肽藜麥芽飲料，對(duì)多肽藜麥芽粉不同添加量的多肽藜麥芽飲料進(jìn)行初步感官評(píng)價(jià)。

1.2.7 質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)

參考GB/T15672-2009《食用菌中總糖含量的測(cè)定》[20]測(cè)定總糖含量；參考雙縮脲比色法測(cè)定多肽含量；參考GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[21]檢測(cè)菌落總數(shù)；參考GB 4789.3-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[22]檢測(cè)大腸菌群；參考GB 29921-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》[23]檢測(cè)致病菌。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品進(jìn)行重復(fù)3 次平行試驗(yàn)，匯總數(shù)據(jù)并計(jì)算平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，單因素試驗(yàn)內(nèi)計(jì)算組內(nèi)差異顯著性。運(yùn)用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25 進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

分別配制 20、30、40、50、60、70 mg/mL 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2.1 的方法測(cè)定吸光度。牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度為縱坐標(biāo)y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，所得回歸方程y=0.009 5x+0.250 5，R2=0.987 4。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

浸泡溫度對(duì)多肽含量的影響見(jiàn)表1。

表1 浸泡溫度對(duì)多肽含量的影響Table 1 Effect of soaking temperature on peptide content

由表1 可知，浸泡溫度對(duì)多肽含量的影響顯著（p＜0.05）。隨浸泡溫度的升高，多肽含量先升高后降低。多肽富集最佳浸泡溫度范圍為20 ℃～30 ℃。這可能是由于溫度過(guò)高抑制種子呼吸，氧氣進(jìn)入種子緩慢使許多耗氧反應(yīng)受抑制，新陳代謝緩慢，生命活動(dòng)所需的中間物質(zhì)的形成受抑制，表現(xiàn)為多肽含量下降。溫?zé)ū骩19]研究發(fā)現(xiàn)，合適的浸泡溫度有利于提高藜麥芽生命活力從而提高蛋白酶活力。當(dāng)溫度在25 ℃前后時(shí)，對(duì)于藜麥芽萌發(fā)較適宜，此時(shí)可能蛋白酶活力較高，有利于蛋白質(zhì)向多肽的轉(zhuǎn)變，利于多肽的富集。浸泡時(shí)間對(duì)多肽含量的影響見(jiàn)表2。

表2 浸泡時(shí)間對(duì)多肽含量的影響Table 2 Effect of soaking time on peptide content

從表2 可以看出，隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽含量先增加后降低。當(dāng)浸泡時(shí)間在2 h～4 h 范圍內(nèi)時(shí)，隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽含量顯著增加，浸泡時(shí)間對(duì)多肽含量影響在4 h～6 h 范圍內(nèi)不顯著，隨浸泡時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，多肽含量呈下降趨勢(shì)。浸泡時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致種子吸水不充分，發(fā)芽過(guò)程中容易失水，而長(zhǎng)時(shí)間的浸泡易造成種子腐爛，經(jīng)試驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，浸泡時(shí)間超過(guò)6 h～8 h，種子表面開(kāi)始有滑膩感，藜麥種子較小，吸水較快，不適合長(zhǎng)時(shí)間浸泡。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多肽含量的影響見(jiàn)表3。

表3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多肽含量的影響Table 3 Effect of culture time on peptide content

由表3 可知，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽含量先增加后降低，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多肽含量的變化影響顯著（p＜0.05）。藜麥芽萌發(fā)初期種子活化，耗能較少，開(kāi)始進(jìn)入萌發(fā)階段胚芽長(zhǎng)出，形成新的芽體組織，芽體急速生長(zhǎng)，細(xì)胞大量形成，伴隨著蛋白質(zhì)的參與，為了維持這些新形成的細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)，儲(chǔ)能大分子物質(zhì)大量轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物，所以檢測(cè)到的多肽含量升高，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)行物質(zhì)的合成消耗已形成的中間產(chǎn)物導(dǎo)致多肽含量降低，在培養(yǎng)時(shí)間為48 h 時(shí)，多肽含量達(dá)到最大值。

2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test plan and test results

由表4 可知，以多肽含量為指標(biāo)，各因素的影響依次為C＞B＞A，即培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多肽含量的影響最大，其次是浸泡時(shí)間，浸泡溫度對(duì)藜麥芽多肽含量的影響最小。由正交試驗(yàn)結(jié)果分析確定最佳培養(yǎng)條件：A2B2C2，即培養(yǎng)時(shí)間為48 h，浸泡時(shí)間為4 h，浸泡溫度為25 ℃。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)所得結(jié)果的可靠性，在上述最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)并測(cè)定藜麥芽中多肽含量。經(jīng)測(cè)定，所得藜麥芽中多肽含量為（12.4±1.13）mg/g，大于（11.45±0.88）mg/g，所以最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間為48 h，浸泡時(shí)間為4 h，浸泡溫度為25 ℃。

2.5 多肽藜麥芽粉質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

微生物檢驗(yàn)結(jié)果如表5 所示。

表5 微生物檢驗(yàn)結(jié)果Table 5 Microbiological test results

多肽藜麥芽粉中菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、霉菌數(shù)均為0 CFU/mL，沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌均未檢出，說(shuō)明本產(chǎn)品符合國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 6 Test results of nutritional indicators

2.6 多肽藜麥芽粉在飲料中的應(yīng)用

料水比對(duì)感官評(píng)定的影響見(jiàn)表7。

表7 料水比對(duì)感官評(píng)定的影響Table 7 Effect of water-to-water ratio on sensory evaluation

由2.5 檢測(cè)結(jié)果得出多肽藜麥芽粉末可以添加到飲料中作為營(yíng)養(yǎng)型添加劑，從表7 中可以看出，料水比為10 g/100 mL 時(shí)達(dá)到較好的溶解度，口感順滑，添加量過(guò)少或者過(guò)多都會(huì)影響飲料的狀態(tài)和口感。

3 結(jié)論

多肽的營(yíng)養(yǎng)功能性受到消費(fèi)者的日益矚目，相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)具有良好的應(yīng)用前景。本研究以白藜麥為原料，藜麥萌發(fā)過(guò)程中蛋白質(zhì)向多肽的轉(zhuǎn)變，制備多肽藜麥芽，優(yōu)化得到最佳多肽藜麥芽制備工藝為浸泡溫度25 ℃，浸泡時(shí)間4 h，培養(yǎng)時(shí)間48 h。在此工藝條件下，得到藜麥芽中多肽含量為（12.4±1.13）mg/g。將多肽藜麥芽制成多肽藜麥芽粉，作為營(yíng)養(yǎng)型添加劑添加到食品中，可以提高食品中多肽含量，提高食品的營(yíng)養(yǎng)功能性。