秦豐偉, 焦鋒, 張兆飛, 黃荷, 唐望

廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)骨三科(廣東廣州 510800)

脊髓損傷(spinal cord injury)發(fā)生率高、治療困難，已經(jīng)成為世界性醫(yī)療難題。干細(xì)胞移植治療脊髓損傷是目前臨床上最有效的方法之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)自我更新能力強(qiáng)，具有促進(jìn)組織修復(fù)、抗炎、免疫抑制及神經(jīng)保護(hù)等作用，廣泛應(yīng)用于組織損傷的治療[1-3]。早期單純BMSCs移植治療脊髓損傷有致瘤的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)BMSCs特性與“腎主骨”存在相關(guān)性，骨生髓，髓養(yǎng)骨，腎氣充足與否可以影響B(tài)MSCs功能的發(fā)揮。我們的前期試驗(yàn)已證實(shí)了補(bǔ)腎中藥單體淫羊藿苷(Icariin,ICA)能促進(jìn)BMSCs的增殖和遷移能力[4]，2018年6月至2019年7月，本研究嘗試通過補(bǔ)腎中藥單體ICA影響干細(xì)胞的生物學(xué)特性，以此來減輕脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，為補(bǔ)腎中藥聯(lián)合干細(xì)胞技術(shù)治療脊髓損傷提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 1月齡清潔級雄性SD大鼠5只，用于提取BMSCs。2月齡清潔級雄性SD大鼠40只，體重(245±14)g，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)器材 鼠BMSCs專用培養(yǎng)基(Cyagen公司，RBXMX-90011)、ICA(Sigma公司，I1286)、含0.25%EDTA的胰酶(Cyagen公司，TEDTA-10001-100)、戊巴比妥鈉(美國Gibco公司，69020100)等。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs培養(yǎng)及細(xì)胞活性檢測 按照前期實(shí)驗(yàn)的方法提取鼠BMSCs培養(yǎng)至第3代細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞活性檢測[4]。取第三代BMSCs，以5×103的密度接種于96孔板，共6塊，每塊板6個(gè)組，各有5個(gè)復(fù)孔，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的ICA進(jìn)行干預(yù)，分為0、0.01、0.1、1.0、10、100 μmol/L ICA組，各組分別干預(yù)12、24、36、48、72、96 h后，每孔加入10 μL CCK-8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育40 min，于酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測各組細(xì)胞吸光度值。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 將剩余40只鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、BMSCs組、BMSCs+ICA組，各10只。

1.2.3 脊髓損傷模型的建立 參照文獻(xiàn)采用Allen′s打擊法，選用致傷能量5 g×10 cm(5 g重物從10 cm高度自由落下)建立鼠脊髓損傷模型[5]。空白組鼠僅暴露硬脊膜，不損傷脊髓。

1.2.4 干細(xì)胞移植及標(biāo)本的收集 建立脊髓損傷小鼠模型，術(shù)后靜息30 min，通過靜脈注射移植干細(xì)胞。BMSCs組：常規(guī)細(xì)胞消化、離心得混懸液，調(diào)整細(xì)胞最終濃度為5×104·mL-1，取0.2 mL尾靜脈注射；BMSCs+ICA組：ICA與BMSCs共育液，細(xì)胞最終濃度為5×104·mL-1，取0.2 mL尾靜脈注射。對照組和模型組注射等量培養(yǎng)液。

1.2.5 觀測指標(biāo)及測定 在移植后48 h，取脊髓組織提取蛋白，采用液相芯片技術(shù)定量分析腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)的含量，具體步驟按R&D Systems公司提供的檢測試劑盒說明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 ICA對BMSCs活性的影響 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.01、0.1、1.0、10 μmol/L劑量的ICA都可以提高BMSCs的活性，最佳作用時(shí)間都是48 h，其中1 μmol/L的ICA可以更加明顯地提高BMSCs活性，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。但是當(dāng)ICA劑量達(dá)到100 μmol/L時(shí)，可以抑制BMSCs活性。

圖1 不同濃度的ICA干預(yù)不同時(shí)間對BMSCs細(xì)胞生物活性的影響

2.2 治療前后TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-10、IL-4水平變化情況 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后與模型組相比，BMSCs和BMSCs+ICA組TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6均下降，而IL-10、IL-4升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且BMSCs+ICA組改善幅度明顯優(yōu)于BMSCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

項(xiàng)目空白組模型組BMSCs組BMSCs+ICA組TNF-α 治療前302.6±30.15789.2±45.75759.0±43.05771.4±47.25 治療后304.2±26.10776.8±45.90205.2±12.85?146.8±16.90?△IFN-γ 治療前21.85±4.375.6±6.880.4±5.974.6±5.7 治療后23.25±4.477.1±7.936.5±4.7?18.4±4.8?△MCP-1 治療前437.0±86.01 512.0±136.01 608.0±118.01 492.0±114.0 治療后465.0±88.01 542.0±159.6860.0±93.4?368.0±97.0?△IL-6 治療前133.6±19.4330.4±31.8314.4±34.4310.0±28.4 治療后143.0±20.4268.6±27.0104.0±21.3?85.6±19.5?△IL-10 治療前40.92±4.2345.87±2.1244.24±2.5445.25±2.52 治療后40.04±3.2551.24±3.4256.12±4.15?65.52±2.54?△IL-4 治療前12.15±1.8513.26±2.1213.45±2.5413.76±2.52 治療后12.35±1.6513.43±2.3515.67±2.56?17.35±2.25?△

注：*與模型組比較P<0.05；△與BMSCs組比較P<0.05

3 討論

3.1 ICA與BMSCs的關(guān)系 近年來，干細(xì)胞領(lǐng)域的快速發(fā)展為脊髓損傷等難治性疾病帶來了希望，尤其是BMSCs的相關(guān)研究最受關(guān)注，通過中藥復(fù)方或有效成分干預(yù)可以促進(jìn)BMSCs的增殖、分化和遷移，提高其生物活性，這也為解決BMSCs移植面臨的諸多問題提供了新的思路。ICA是中藥淫羊藿的主要有效成分，其藥理作用十分廣泛。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的ICA可提高BMSCs的活性，但是高濃度的ICA對BMSCs的增殖有抑制作用，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論[6]基本一致，而且我們的前期研究結(jié)果也得到類似結(jié)論[4]。

3.2 TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-10、IL-4在脊髓損傷病理過程中的作用 脊髓損傷后，機(jī)體內(nèi)會產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6等一大批炎癥細(xì)胞因子，其通過募集白細(xì)胞、激活巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，增加細(xì)胞毒性，加速炎癥反應(yīng)，從而加重神經(jīng)組織損傷，上述這些炎癥因子也就成為治療脊髓損傷的潛在靶點(diǎn)。脊髓損傷后巨噬細(xì)胞受到局部微環(huán)境中某些炎癥因子的刺激可以轉(zhuǎn)化為M1和M2型活化狀態(tài)。其中M1型巨噬細(xì)胞可以分泌TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥因子，進(jìn)而加重脊髓損傷程度。諸多研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓損傷后，TNF-α、IL-1等促炎性細(xì)胞因子水平顯著升高，細(xì)胞凋亡加速[7-10]。本研究結(jié)果與上述結(jié)論類似，模型組和BMSCs組、BMSCs+ICA組TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6的含量明顯高于空白組(P<0.05)，說明脊髓損傷后，促炎癥因子高度表達(dá)，誘發(fā)更加嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。而M2型巨噬細(xì)胞可以分泌IL-10和IL-4等有助于清除壞死組織、促進(jìn)血管再生、組織重建和修復(fù)的炎癥因子。

3.3 BMSCs治療脊髓損傷 目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可以促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)[11-13]，但是有關(guān)其中的作用機(jī)制目前還并不明確。本次研究也發(fā)現(xiàn)，采用BMSCs移植可以有效改善脊髓損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。目前雖然已經(jīng)采用BMSCs移植治療脊髓損傷，但是致瘤風(fēng)險(xiǎn)依然存在，有關(guān)這一難題依然沒有得到有效解決。既然機(jī)體自身的間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化演變，從而修復(fù)已經(jīng)損傷的脊髓組織，只是這一過程極其復(fù)雜，影響因素眾多。那么我們可以大膽地推測，是否存在一種特殊的媒介或者“催化劑”，可以增強(qiáng)干細(xì)胞的活性，促進(jìn)干細(xì)胞定向分化，使脊髓損傷修復(fù)的過程得到有效控制呢？這也是目前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

3.4 ICA與脊髓損傷的關(guān)系 ICA是祖國傳統(tǒng)中藥淫羊藿的主要活性成分，而中藥淫羊藿是中醫(yī)治療脊髓損傷組方中至關(guān)重要的一味草藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體ICA具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤、抗衰老、促進(jìn)骨代謝、抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)免疫功能、改善心腦血管功能等多種藥理學(xué)作用[14]。目前已有研究證明，ICA可以有效抑制TNF-α、IL-6等促炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)損傷的恢復(fù)[15-16]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， BMSCs+ICA組TNF-α、IL-6等促炎癥因子的表達(dá)水平顯著低于其他各組(P<0.05)，但I(xiàn)L-10和IL-4等促進(jìn)脊髓修復(fù)的炎癥因子表達(dá)水平均高于其他各組(P<0.05)。這就說明適當(dāng)劑量的ICA可以顯著提高BMSCs的活性，抑制脊髓損傷后促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，改善脊髓損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)。雖然本次研究證實(shí)了經(jīng)過適當(dāng)劑量ICA干預(yù)后的BMSCs可以有效減輕脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，但是有關(guān)脊髓損傷修復(fù)的病理機(jī)制十分復(fù)雜，影響因素諸多，其中的作用機(jī)制或者作用靶點(diǎn)仍然不明確。此外，如何確保BMSCs能夠在脊髓損傷區(qū)域停留并存活也至關(guān)重要。上述這些問題都將是我們下一步研究的重點(diǎn)和關(guān)鍵。

綜上所述，適當(dāng)劑量的ICA可以顯著提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性；ICA與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用，不僅可以抑制脊髓損傷后TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6等促炎癥因子的表達(dá)，還可以提高IL-10和IL-4等促進(jìn)脊髓修復(fù)炎癥因子的表達(dá)水平。依此推斷ICA通過提高BMSCs活性，改善脊髓損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)脊髓損傷區(qū)域紊亂的微環(huán)境，從而促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。BMSCs聯(lián)合中藥單體ICA有望成為治療脊髓損傷的有效方案。