徐仁慶，李建飛，陸松花，郁 霖

(1.蘇州技師學(xué)院，江蘇 蘇州 215000； 2.佐竹機(jī)械(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 215000)

谷物作為人類食物與魚禽畜飼料的重要來源，從種植管理到儲藏及加工的各個環(huán)節(jié)，其安全品質(zhì)不可避免的會受到各種不利因素的影響，如環(huán)境污染因素、農(nóng)藥與化肥濫施因素、糧食的儲存不當(dāng)因素等。如今，谷物的品質(zhì)安全早已成為全人類所面臨的共同問題。我國作為產(chǎn)糧大國，谷物的品質(zhì)安全問題更是不容忽視。相關(guān)報(bào)道指出，當(dāng)前我國谷物的品質(zhì)安全隱患重點(diǎn)存在于以下3個方面：一是真菌污染率高且污染情況復(fù)雜；二是一些污灌區(qū)或礦區(qū)較為突出的重金屬超標(biāo)問題；三是種植與管理過程中的農(nóng)藥殘留問題[1]。近些年來的谷物安全相關(guān)調(diào)查結(jié)果也反映出，國內(nèi)谷物及其制品的安全問題不容樂觀。如宮春波等在2014-2017年間對煙臺市市售4類225種谷物及其制品進(jìn)行隨機(jī)抽樣，檢測得出玉米、小麥及其制品真菌毒素污染情況普遍存在，且檢出率均達(dá)到50%以上(55.2%與53.85%)[2]。許嘉等對北京市市售谷物制品進(jìn)行真菌毒素與重金屬檢測發(fā)現(xiàn)，大米、小麥粉、玉米、玉米面均受到不同程度的真菌毒素污染[3]；玉米面與小麥粉受到不同程度的鎘污染和鉛污染[4]。楊柳等[5]對河北省的雞類飼料原料進(jìn)行重金屬分析，結(jié)果表明絕大部分飼料原料中鎘超標(biāo)；谷物及其多數(shù)加工制品、膨化大豆和棉籽粕中鉛超標(biāo)；小部分飼料的鎘與砷超標(biāo)。吳雨珊等[6]對國內(nèi)奶牛飼料進(jìn)行調(diào)查分析顯示，敵敵畏和氟氯氰菊酯在玉米飼料中的檢出率均達(dá)到100%，溴氰菊酯在玉米飼料和精料補(bǔ)充料中的檢出率均超過80%。目前，國內(nèi)對于谷物及其制品的安全品質(zhì)指標(biāo)檢測多采用色譜法及色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法等，該類方法雖然較為權(quán)威，但由于設(shè)備價格與設(shè)備維護(hù)費(fèi)用昂貴，且對操作人員的專業(yè)能力要求高，因此具有很大局限性。近些年來，為滿足市場對于低成本與快速檢測的需求，生物傳感器作為農(nóng)產(chǎn)品安全品質(zhì)快速檢測的新型技術(shù)得到了快速發(fā)展。

1 生物傳感器概述

生物傳感器是一種結(jié)合了生物識別機(jī)制和物理轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的分子傳感器[7]。其工作原理是待測物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入分子識別元件(生物活性材料)，經(jīng)分子識別作用與分子識別元件特異性結(jié)合，發(fā)生生化反應(yīng)，所產(chǎn)生的生物學(xué)信息通過相應(yīng)信號轉(zhuǎn)換元件轉(zhuǎn)換為可以定量處理的光信號或電信號，最后經(jīng)電子測量儀的放大、處理與輸出，即可實(shí)現(xiàn)對待測物質(zhì)濃度進(jìn)行檢測分析的目的[8]。按照生物活性材料的種類進(jìn)行劃分，可分為微生物型傳感器、免疫型傳感器、酶傳感器、細(xì)胞傳感器、組織傳感器及DNA傳感器等。按照信號轉(zhuǎn)換元件的不同進(jìn)行劃分，又可分為電化學(xué)生物傳感器、介體生物傳感器、光學(xué)型生物傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、量熱型生物傳感器、壓電晶體生物傳感器等[9]。在農(nóng)產(chǎn)品安全品質(zhì)檢測方面，生物傳感器以其檢測速度快、靈敏度較高、特異性強(qiáng)、價格較為低廉等優(yōu)點(diǎn)一直備受研究者的關(guān)注。

2 生物傳感器在谷物安全品質(zhì)檢測上的應(yīng)用

2.1 真菌毒素

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的具有毒性的次生代謝物，可對農(nóng)作物、食品及飼料等植物性產(chǎn)品造成廣泛污染[10]。尤其是在谷物的長期儲藏期間，不當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件可加速真菌的滋長與繁殖，促使真菌毒素的不斷富集。國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)對于谷物中真菌毒素的檢測項(xiàng)目主要包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、脫氧雪膚鐮刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素A(OTA)，以及玉米赤霉烯酮(ZEA)四大類。以上谷物真菌毒素的攝入可引起不同程度的急性或慢性中毒，如AFB1可引發(fā)惡性營養(yǎng)不良、急性肝炎、肝硬化、肝癌，以及雷氏癥候群等病癥，被國際癌癥研究所認(rèn)定為最強(qiáng)基因毒性劑；DON又稱為嘔吐毒素，可引起嘔吐、胃腸炎、免疫抑制和血液病等；OTA可對人體腎臟及免疫系統(tǒng)造成損害，并有潛在的致畸、致癌危害；ZEA則會引發(fā)雌激素綜合癥等。

目前，國內(nèi)外在谷物真菌毒素檢測用生物傳感器的研究上多集中在酶傳感器、免疫傳感器及新型材料方面。其中在AFB1的檢測應(yīng)用上，Chrouda等[11]以AFB1對乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制作用為基礎(chǔ)，并以海藻酸鈉生物聚合物作為固定化乙酰膽堿酯酶的新基質(zhì)制備了電化學(xué)生物傳感器；在0.1～100 ng/ml線性動態(tài)范圍內(nèi)，檢測下限為0.1 ng/ml，低于AFB1(2 μg/L)的推薦水平，具有較高的靈敏度、良好的重復(fù)性和長期儲存穩(wěn)定性；同時用添加AFB1(0.5 ng/ml)的大米樣品評價了該方法的適用性。Bhardwaj等[12]使用納米顆粒集成金芯片開發(fā)了一種無標(biāo)記的超敏感微流表面等離子體共振生物傳感器用于檢測AFB1，其線性測定范圍在1～50 nm，檢測限為0.19 nm；通過加標(biāo)的小麥樣品評估了所提出的生物傳感器的有效性，其平均回收率(93%和90.1%)是可以接受的。Díaz Nieto等[13]基于由大豆過氧化物酶和化學(xué)還原的氧化石墨烯復(fù)合物修飾的玻璃碳電極，通過基于響應(yīng)面方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得了構(gòu)建生物傳感器的最佳條件，進(jìn)而開發(fā)了第三代酶生物傳感器，對摻有曲霉素的玉米樣品進(jìn)行分析，平均回收率為96.5%?；s[14]通過引入電位分辨比率原理，配合筆記本電腦與微型電化學(xué)工作站，開發(fā)出了可以在陽光照射下即可工作的新型光電化學(xué)生物傳感平臺，并成功應(yīng)用于AFB1的檢測，就此消除了陽光強(qiáng)度隨時間和氣候而變化所引起的干擾。

在DON的檢測應(yīng)用上，Schnerr等[15]基于表面等離振子共振(SPR)的間接抑制性免疫分析方法，合成DON-生物素偶聯(lián)物，并將其固定在鏈霉親和素包被的SPR傳感器表面，以測量添加到小麥樣品中的游離抗DON抗體，分析顯示，使用新型生物傳感器與氣相色譜/質(zhì)譜及高效液相色譜法測得的DON濃度之間呈線性正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.946 4與0.906 6。Ong等[16]以鐵納米花-石墨烯-鎳(INFGN)為傳感器，特異性適體為生物識別元件，研制了一種選擇性生物傳感系統(tǒng)，其對DON的檢測限為2.11 pg/ml，且48 h后仍保持30.65%的活性，具有很高的穩(wěn)定性。Zheng等[17]基于表面活性劑輔助合成TiO2介晶的雙功能試劑調(diào)節(jié)比例電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，通過發(fā)光氨和緩沖液(4,4'-二羧酸-2,2'-聯(lián)吡啶基)的兩個電化學(xué)發(fā)光信號比來檢測DON，檢測范圍為0.05～5 ng/ml，檢測限為1.67×10-2pg/ml。韓逸陶等[18]基于無模板合成鳥嘌呤四聚體(G-quadruplex,G4)方法，以及G4與特異性染料分子結(jié)合后的熒光增強(qiáng)效用，并利用DON與其適體DNA的高親和作用以及核酸外切酶的酶切反應(yīng)，構(gòu)建了可快速分析谷物中DON的熒光“開啟”的生物傳感器。其在用于添加DON的小麥和玉米樣品實(shí)驗(yàn)中，回收率為94%～112%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～4.9%。

在OTA的檢測應(yīng)用上，Rubaye等[19]首次報(bào)道了適體作為OTA的高度特異性人工分子受體與全內(nèi)反射橢圓偏振法(TIRE)的結(jié)合使用；研究結(jié)果表明，用特異適體直接檢測OTA的濃度可降至0.01 ng/ml；通過動態(tài)TIRE光譜測量研究了適配體/OTA結(jié)合的動力學(xué)，其可評估的親和力常數(shù)KD=1.8×10-8mol/L，這是高度特異性適配體/OTA結(jié)合的特征。張立轉(zhuǎn)等[20]基于聚多巴胺納米顆粒熒光猝滅效率高，以及核酸適配體特異性的識別能力特點(diǎn)，構(gòu)建了一種用于OTA定量檢測的快速、靈敏、簡便且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的熒光生物傳感器，其檢出限為20 nmol/L。Kim等[21]基于金納米材料，并將其部分嵌入固體基質(zhì)(如聚二甲基硅氧烷)，開發(fā)了一種固態(tài)單步適配傳感器，其線性范圍為0.1～1 000 ng/ml，檢測限為0.022 ng/ml(在30 min內(nèi)到達(dá)OTA)，此外通過3次循環(huán)檢測與回收的可重復(fù)使用性評估確定了其很好的可重復(fù)使用性；該項(xiàng)研究為便攜式、可重復(fù)使用的現(xiàn)場檢測用生物傳感器平臺的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。Hao等[22]開發(fā)出一個便攜式太陽能驅(qū)動的可視化的電化學(xué)生物傳感器，該傳感器被制造在一個小的ITO電極上，該電極分為檢測模塊與參考模塊兩部分；每個模塊由兩個區(qū)域組成，其中三維石墨烯水凝膠納米復(fù)合材料用于構(gòu)建光電感應(yīng)區(qū)域，電致變色材料普魯士藍(lán)用于可見區(qū)域；通過兩個模塊上可視區(qū)域的色度比率進(jìn)行量化，獲得了良好的線性范圍(1～500 ng/ml)，檢出限為0.29 ng/ml。

在ZEA的檢測應(yīng)用上，Azri等[23]采用半胱胺鹽酸鹽和1,4-亞苯基二異氰酸酯鍵合，用ZEA修飾金電極，將解離常數(shù)為(13.4±2.1)nm的截短型ZEA適體應(yīng)用于適配傳感器。該傳感器與其他ZEA類似物有高度的交叉反應(yīng)，而對其他真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)；其檢測范圍在0.01～1 000 ng/ml，檢測限為0.017 ng/ml；用于玉米籽粒提取物中玉米醇溶蛋白的ZEA測定，回收率為87%～110%。Moradi等[24]使用電紡絲技術(shù)制造了一種摻入聚丙烯腈/納米纖維改性的筆形石墨電極，以應(yīng)用于食品模擬物中，尤其是液態(tài)食品，用以檢測ZEA。該傳感器是在室溫下使用pH6的Britton-Robinson緩沖液制成，對ZEA在5～30和60～100 nmol/L的濃度范圍內(nèi)具有線性行為和良好特性。Wu等[25]將合成的高熒光上轉(zhuǎn)換納米粒子與ZEA適體互補(bǔ)寡核苷酸偶聯(lián)作為信號探針，并將ZEA適體固定化的磁性納米粒子作為捕獲探針，結(jié)果表明，在0.05～100 μg/L范圍內(nèi)，其檢測限(玉米0.126 μg/kg，啤酒0.007 μg/L)明顯低于現(xiàn)有方法；通過將實(shí)際食品樣品中的測定結(jié)果與商業(yè)方法檢測結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證了競爭免疫分析法的可靠性。Sadrabadi等[26]研究表明使用雙鏈DNA/多壁碳納米管-聚二烯丙基二甲基氯化銨修飾的筆形石墨電極，可通過檢測ZEA與雙鏈DNA的相互作用測定低至0.005 ng/ml的痕量ZEA。

2.2 農(nóng)藥殘留

為防治病、蟲、草害，保障谷物長勢與產(chǎn)量，各類殺菌劑、殺蟲劑、除草劑、激素類藥劑等的施用已貫穿于谷物萌芽到植株生長的整個生命周期中，且以殺蟲劑的使用最為頻繁。其中有機(jī)磷殺蟲劑以其廣譜、高效、價格較低的特點(diǎn)被廣泛使用于植保管理中，但是其高毒性與高殘留的特點(diǎn)也給谷物及其制品的安全問題帶來巨大隱患。目前，在有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測上，我國標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)對植物源性食品中90種有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定作出了具體說明，測定方法為氣相色譜法。在生物傳感器研究應(yīng)用上，基于有機(jī)磷對乙酰膽堿酶活性的抑制作用，以及乙酰膽堿酯酶酶抑制生物傳感器可避開大量的預(yù)處理的特點(diǎn)，使之為樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥痕量殘留的快速檢測提供了可能性[27]。如高慧麗等[28]所制備的乙酰膽堿酯酶生物傳感器，采用溶膠-凝膠法在醋酸纖維膜上將酶固定，然后將該酶膜在聚四氨基鈷酞菁修飾的玻碳電極上進(jìn)行固定，再采用計(jì)時安培法對對硫磷、辛硫磷與氧化樂果進(jìn)行測定，其檢測限依次為2.0×10-9mol/L、1.4×10-9mol/L和1.1×10-8mol/L。薛瑞等[29]采用層層自組裝技術(shù)并通過靜電引力把乙酰膽堿酶與金納米粒子固定到玻碳電極表面，所制備的酶傳感器對不同濃度甲基對硫磷進(jìn)行檢測，檢出限為7.6×10-6mol/L。Zhang等[30]通過聚合4,7-二(呋喃-2-基)苯并噻二唑與Ag-rGO-NH2的協(xié)同作用，開發(fā)了基于共軛聚合物和Ag-rGO-NH2納米復(fù)合材料的高靈敏度安培乙酰膽堿酯酶生物傳感器。在優(yōu)化后的傳導(dǎo)條件下，馬拉硫磷的檢出限約為0.032 μg/L，敵百蟲的檢出限約為0.001 μg/L。關(guān)樺楠等[31]以多層納米酶膜修飾電極為核心，采用脂質(zhì)體技術(shù)制備乙酰膽堿酯酶的微反應(yīng)器，并以微反應(yīng)器、殼聚糖及二氧化硅為基質(zhì)，構(gòu)建了有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測酶電化學(xué)生物傳感器，其對敵敵畏的最低檢出限為(0.72±0.065)μg/L，且靈敏度高、重復(fù)性與選擇性好。衛(wèi)銀銀等[32]研究報(bào)道了二氧化鉛或二氧化鈦修飾的乙酰膽堿酶生物傳感器具有光電協(xié)同催化功能；且乙酰膽堿酶表現(xiàn)出良好的動力學(xué)反應(yīng)，其對敵百蟲的最低檢出限達(dá)到1.0 nmol/L。Nagabooshanam等[33]在10～120 ng/L的濃度范圍內(nèi)，研究了基于聚苯胺和羧基官能化的多壁碳納米管的超靈敏電化學(xué)傳感器在檢測實(shí)際樣品中有機(jī)磷酸鹽的效果，結(jié)果表明毒死蜱的靈敏度為0.41 mA·(ng/L)-1·cm-2，檢出限為8.8 ng/L；對甲基對硫磷的靈敏度為0.58 mA·(ng/L)-1·cm-2，檢出限為10.2 ng/L。

2.3 重金屬

谷物在種植管理過程中，重金屬離子可通過水、藥、肥等多種途徑被谷物植株吸收。雖然最終到達(dá)并存在于谷物籽粒中的重金屬含量極小，但這些痕量重金屬可通過食物鏈直接或間接的在人體內(nèi)不斷富集；一旦超過人體耐受限度，將會引起急性、亞急性或慢性中毒，危害人體健康。因而重金屬檢測對于保障谷物及其制品的安全品質(zhì)必不可少。我國最新標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》(GB 2762—2017)對于谷物中重金屬的檢測項(xiàng)目主要包括鉛、鎘、汞、砷、鉻5種。在檢測方法上，常規(guī)方法測定步驟主要包括樣品的消解處理(如壓力罐消解、回流消解、微波消解、濕式消解、干式灰化等)與質(zhì)譜或光譜分析(包括冷原子吸收光譜法、原子吸收光譜法、原子熒光光譜法，以及電感耦合等離子質(zhì)譜法等)[34]。在快速檢測技術(shù)的研究與應(yīng)用上，基于免疫學(xué)檢測技術(shù)的試劑條與試劑盒產(chǎn)品，因其成本較低、特異性強(qiáng)、可用于現(xiàn)場檢測、且對操作人員的專業(yè)要求不高等優(yōu)點(diǎn)，在谷物等農(nóng)產(chǎn)品的重金屬檢測上得到較高推廣。其次，X射線熒光類設(shè)備因其無需消解、無需試劑耗材、檢測速度快、操作簡單、檢測范圍廣、靈敏度高和檢出限低等優(yōu)點(diǎn)也備受關(guān)注；但由于該類型設(shè)備開發(fā)技術(shù)難度高，致使國內(nèi)市場上可見到的X射線熒光類谷物重金屬檢測儀廠商也只有寥寥幾家，如江蘇天瑞、鋼研納克，以及美國三值，且市場價格也十分高昂，在推廣使用上具有很大局限性。而有關(guān)生物傳感器在食品重金屬檢測方面的研究僅有少量報(bào)道，如楊文平等以磁性Fe3O4納米粒子的過氧化物酶活性作為傳感信號輸出工具，并以核酸適配體的特異性識別功能作為靶標(biāo)識別元件，開發(fā)了一種可簡單快速檢測Cd離子與Pb離子的比色傳感器[35]。

3 小結(jié)與展望

目前，國內(nèi)外對于生物傳感器在谷物安全品質(zhì)的快速檢測應(yīng)用上，多集中在真菌毒素與農(nóng)藥殘留方面，而在重金屬檢測方面的研究較少，且相應(yīng)檢測設(shè)備在實(shí)際應(yīng)用中也均存在著諸多方面的局限性，如檢測靈敏度、檢測穩(wěn)定性、檢測便利性等。但生物傳感器技術(shù)作為一種涵蓋生物化學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)以及材料學(xué)等多學(xué)科融合技術(shù)，隨著各學(xué)科技術(shù)與多學(xué)科融合技術(shù)研究的不斷發(fā)展，其在谷物安全品質(zhì)快速檢測應(yīng)用方面的諸多局限性也必將一一打破。此外，為滿足不同谷物流通過程中不同環(huán)節(jié)的檢測要求，谷物用生物傳感器設(shè)備也必將從單一化到多樣化，從普適性到針對性方向發(fā)展。