王發(fā)明 莫權(quán)輝 葉開玉 龔弘娟 劉平平 蔣橋生 齊貝貝 李潔維

摘 要：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)目前雖已廣泛應(yīng)用于人類、動(dòng)物、微生物等物種的研究，但由于細(xì)胞壁的存在，使得該技術(shù)在植物上的應(yīng)用舉步維艱。如果能先分離出植物單條染色體，然后再應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，則可以避免細(xì)胞壁的干擾，從而具有重要的應(yīng)用價(jià)值。雖然科研人員一直嘗試針對(duì)單條植物染色體進(jìn)行測(cè)序，但目前尚未見有成功的報(bào)道，也未見有文章對(duì)失敗的原因進(jìn)行討論。該研究以六倍體中國(guó)春小麥為材料，針對(duì)使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行單染色體擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的假陽(yáng)性問題進(jìn)行了探討，分析了單染色體擴(kuò)增失敗的主要原因，并通過高通量測(cè)序技術(shù)研究了外源污染的可能來(lái)源。結(jié)果表明：在對(duì)實(shí)驗(yàn)器具、耗材、環(huán)境污染嚴(yán)格防控的基礎(chǔ)上，人體接觸可能是造成污染的主要來(lái)源;同時(shí)，推測(cè)單染色體之所以擴(kuò)增失敗可能是因?yàn)槿旧w自身超螺旋狀態(tài)造成引物難以結(jié)合和復(fù)制。該研究還針對(duì)存在的問題提出了可行性建議，為將來(lái)成功進(jìn)行單染色體測(cè)序提供了有益的借鑒。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)稳旧w，單細(xì)胞測(cè)序，外源污染，假陽(yáng)性，MDA，MALBAC

中圖分類號(hào)：Q943文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）01-0016-08

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract：Single-cell sequencing technology is widely used in the research of human，animal，microorganism and other species，but it is hard to be applied in plant because of being cell wall. If a single chromosomes can be separated from plant cells and then were used for amplification and sequencing with single-cell sequencing technique，the barrier of plant cell wall will be removed and be of important application value. However，there are to date no claims on the successful application of single chromosome sequencing，and the causes of the failure are poorly understood. The issue of false positives that commonly exist in single chromosome amplification was studied，and the main causes of the failure in single-chromosome amplification were discussed. Besides，the probable sources of exogenous pollution in chromosome amplification were studied with high-throughput sequencing，and human body was proved to be the most probable sources of pollution on the basis of all experimental tools，materials，reagents and spaces being under extremely sterilized treatments. The super helical structures of chromosomes themselves were considered as the primary cause of failure in amplification，as primers were hard to bind to strands of DNA to start replication. Finally，some feasible suggestions were put forward. This study provides beneficial lessons for the successful single-chromosome sequencing in the future.

Key words：single chromosome，single-cell sequencing，exogenous pollution，false positives，multiple displacement amplication （MDA），multiple annealing and looping-based amplication cycles （MALBAC）

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，是目前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)技術(shù)之一。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以在單個(gè)細(xì)胞水平上，使用極微量模板對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀組等進(jìn)行高通量測(cè)序分析，可以獲得用常規(guī)組織樣本無(wú)法獲得的單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性信息，從而被廣泛應(yīng)用于人類的疾病診斷、癌癥的早期檢測(cè)以及發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等方面（Lasken，2007; Navin et al.，2011; Huang et al.，2015）。目前，單細(xì)胞全基因組測(cè)序普遍使用的技術(shù)，包括多重置換擴(kuò)增技術(shù)（multiple displacement amplification，MDA）（Hosono et al.，2003）和基于多次退火環(huán)狀循環(huán)的擴(kuò)增技術(shù)（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）（Zong et al.，2012）。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于人類、動(dòng)物和微生物等方面的研究，但在植物上的研究應(yīng)用較少，主要原因是植物存在細(xì)胞壁，使用普通方法難以進(jìn)行分離和裂解。嚴(yán)建兵團(tuán)隊(duì)曾發(fā)現(xiàn)了一種簡(jiǎn)單可行的方法，成功分離出玉米小孢子四分體，并使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)成功進(jìn)行了全基因組測(cè)序，獲得了多個(gè)創(chuàng)新性的科學(xué)發(fā)現(xiàn)（Li et al.，2015）。這是單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在植物上的首次成功應(yīng)用。然而，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在染色體水平上的應(yīng)用卻尚未見有成功的報(bào)道。

植物染色體是植物細(xì)胞在有絲分裂或減數(shù)分裂時(shí)的超螺旋存在形式，是染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，容易分辨和分離。那么，能否利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)來(lái)進(jìn)行單條植物染色體的體外擴(kuò)增和測(cè)序呢。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以對(duì)單個(gè)微生物細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，多數(shù)細(xì)菌基因組大小不足十兆，遠(yuǎn)低于很多植物單條染色體的大小，因此利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行植物單染色體測(cè)序從理論上是可行的。通過分離染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，可以避免細(xì)胞壁的干擾，目前雖然已有較多分離單條染色體并進(jìn)行體外擴(kuò)增的成功案例，但使用的主要是基于PCR的全基因組擴(kuò)增技術(shù)，如簡(jiǎn)并寡核苷酸引物擴(kuò)增技術(shù)（DOP-PCR）（Telenius et al.，1992）和接頭介導(dǎo)的PCR擴(kuò)增技術(shù)（LA-PCR）（Chen & Armstrong，1995）。這些技術(shù)存在非特異性擴(kuò)增、擴(kuò)增偏倚和擴(kuò)增結(jié)果基因組覆蓋度低等問題。如果能使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行植物單條染色體的擴(kuò)增，則可以從根本上解決這些問題，具有可預(yù)期的廣闊應(yīng)用前景。但是，目前關(guān)于這方面研究的報(bào)道較少。殷卉等（2015）在巴西橡膠樹上嘗試應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)橡膠樹單條染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，但一直未見后續(xù)的研究報(bào)道。

植物單條染色體的體外擴(kuò)增除了對(duì)極微量模板的考驗(yàn)以外，外源污染的防控還是該技術(shù)應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)，如何有效防控外源污染是微量模板能否正確擴(kuò)增和保證后續(xù)測(cè)序質(zhì)量的關(guān)鍵因素。但是，基于MDA、MALBAC技術(shù)的擴(kuò)增敏感性，即使有極微量外源核苷酸模板的存在也可能造成污染的擴(kuò)增和放大，從而造成假陽(yáng)性現(xiàn)象并導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。擴(kuò)增過程中外源污染可能來(lái)源于實(shí)驗(yàn)環(huán)境，也可能來(lái)自實(shí)驗(yàn)試劑、水、各種緩沖液，擴(kuò)增使用的槍頭、離心管等耗材器具以及染色體制備和分離過程中使用的玻片、玻璃針等（王發(fā)明等，2010）。此外，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下的氣溶膠污染也不容忽視（杜茜等，2015）。因此，只有在植物單染色體體外擴(kuò)增的各個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)該對(duì)外源污染進(jìn)行嚴(yán)格防控，才能保證擴(kuò)增的高質(zhì)量。

目前，單染色體測(cè)序還未見有成功的報(bào)道，筆者在同測(cè)序公司和其他單位相關(guān)領(lǐng)域人員交流時(shí)，發(fā)現(xiàn)普遍存在假陽(yáng)性現(xiàn)象嚴(yán)重而目標(biāo)染色體卻沒有得到有效擴(kuò)增的問題。針對(duì)這種問題，尚未見有人進(jìn)行過系統(tǒng)研究和提出可行性建議，特別是對(duì)假陽(yáng)性現(xiàn)象形成的原因和污染的主要來(lái)源還認(rèn)識(shí)不足，這樣不利于有針對(duì)性地提出外源污染防控策略和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案。

本研究嘗試使用單細(xì)胞測(cè)序的方式對(duì)小麥單條染色體分離后進(jìn)行體外擴(kuò)增和測(cè)序，在嚴(yán)格防控外源污染的前提下，針對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中普遍遇到的假陽(yáng)性問題進(jìn)行研究，旨在探討其可能來(lái)源和形成原因，并針對(duì)單染色體測(cè)序存在的主要問題提出可行性建議，以期為植物單染色體測(cè)序的開展提供經(jīng)驗(yàn)和參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

六倍體中國(guó)春小麥（2n=6×=42）種子，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所王道文課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 小麥中期染色體制備和單條染色體分離 將六倍體中國(guó)春小麥種子用冷水于4 ℃冰箱浸泡1 d后，置于25 ℃下避光培養(yǎng)，當(dāng)其根尖長(zhǎng)至1.5～2.0 cm時(shí)，用鋒利的刀片將其切下，用0.1%秋水仙素預(yù)處理3 h，無(wú)菌水洗凈后用卡諾固定液（冰醋酸∶純酒精=1∶3）于低溫下固定5 min，轉(zhuǎn)入70%酒精中，4 ℃冰箱保存。使用時(shí)用鑷子取出所需數(shù)量的根尖，用無(wú)菌水沖洗3遍，控干水分。分別加入體積比4%和3%的纖維素和果膠酶20 μL，37 ℃ 酶解45 min，酶解完成后，用無(wú)菌水沖洗3遍，控干水分，滴加10 μL卡寶品紅染液，用槍頭將根尖搗碎，略放置后進(jìn)行壓片。先將壓片完成后的玻片置于-70 ℃超低溫冰箱中放置30 min，再迅速揭掉蓋玻片，置于倒置顯微鏡下觀察和使用微細(xì)玻璃針法進(jìn)行顯微分離（Nikon Ti-S研究級(jí)倒置顯微操作系統(tǒng)）。在分離單條染色體的同時(shí)，也分離包含全部中期染色體的單個(gè)完整細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.2 染色體MALBAC擴(kuò)增 分離后的包含全部染色體的單個(gè)完整細(xì)胞和單條小麥染色體是使用億康公司的MALBAC微量基因組快速擴(kuò)增試劑盒（KT110700324）來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。操作過程詳情見使用說明書（http：//www.yikongenomics.com/upload/2017/1124/KT1107003_MALBACweiliangjiyinzukuaisukuozengshijihechanpinshuomingshu_zhongwenPM-40c9e.pdf）。根據(jù)說明書分別將擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)置為適合單條染色體擴(kuò)增的21個(gè)循環(huán)和常規(guī)的17個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 染色體MDA擴(kuò)增 分離后的包含全部染色體的單個(gè)完整細(xì)胞和單條小麥染色體是使用Qiagen公司的REPLI-g Single Cell Kit（Cat No./ID：150343）來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，操作過程詳情見使用說明書（https：//www.qiagen.com/cn/resources/resourcedetail？id=38faca1c-64b0-4281-aab3-aa8324bbd181&lang=en）。擴(kuò)增完成后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在使用試劑盒自行體外擴(kuò)增的同時(shí)，使用安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司提供的解離液在分離部分單條染色體后委托其進(jìn)行體外擴(kuò)增。

1.2.4 污染源排除實(shí)驗(yàn) 為了研究染色體擴(kuò)增過程中的假陽(yáng)性現(xiàn)象以及對(duì)外源污染的可能來(lái)源進(jìn)行排除，我們委托億康基因公司使用MALBAC技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)使用的無(wú)菌水、PBS溶液、離心管和試劑盒本身進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

1.2.5 SCoT分子標(biāo)記檢測(cè) 由于SCoT分子標(biāo)記是一種目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記，因此可以用來(lái)檢測(cè)外源污染物是來(lái)自其他外源物種基因還是因引物多聚體形成的。SCoT引物是根據(jù)Collard & Mackill （2009）和Luo et al.（2011）公布的引物序列來(lái)合成。本研究用于單染色體擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR檢測(cè)的SCoT引物如表2所示。

使用20 μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mix 10 μL、擴(kuò)增產(chǎn)物（稀釋1 000倍，約30 ng·μL-1） 1.0 μL、10 μmol·L-1引物0.8 μL、超純水8.2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.2.6 Southern雜交鑒定 將小麥全基因組DNA酶切產(chǎn)物與染色體擴(kuò)增產(chǎn)物及陰性對(duì)照一起進(jìn)行電泳，并通過印記雜交的方式轉(zhuǎn)移至帶正電荷的Hybond尼龍膜上，小麥全基因組DNA經(jīng)酶切、標(biāo)記后作為探針進(jìn)行雜交。具體操作步驟參照羅氏公司生產(chǎn)的“DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter-KitⅠ（Roche）”試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7 高通量測(cè)序 選擇小麥染色體假陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建單細(xì)胞基因組MDA類型文庫(kù)，文庫(kù)質(zhì)檢合格后，使用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)PE150。對(duì)過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)隨機(jī)抽取10 000條Reads數(shù)據(jù)，通過Blast軟件比對(duì)NT庫(kù)，分析可能的污染源。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥中期染色體制備和顯微分離

在40倍鏡下，尋找到分散良好、視野清晰的小麥中期染色體分裂相，制備微細(xì)玻璃針，使用顯微操作儀準(zhǔn)確挑出單條小麥染色體（圖1）。染色體通過靜電作用吸附在針尖上，迅速轉(zhuǎn)移至放有裂解液的200 μL離心管中，8 000 r·min-1簡(jiǎn)短離心20 s，進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

2.2 MALBAC和MDA方法對(duì)小麥染色體進(jìn)行擴(kuò)增出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象

分別使用基于MALBAC技術(shù)的MALBAC微量基因組快速擴(kuò)增試劑盒（KT110700324）和基于MDA技術(shù)的REPLI-g Single Cell Kit（Cat No./ID：150343）進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果顯示（圖2），包含全部染色體的完整細(xì)胞的擴(kuò)增條帶（1號(hào)泳道）跟單個(gè)染色體的擴(kuò)增條帶（2號(hào)泳道）帶型基本一致。但是，兩種方法中無(wú)菌水陰性對(duì)照（3號(hào)泳道）和PBS陰性對(duì)照（4號(hào)泳道）也分別擴(kuò)增出了與目標(biāo)樣品明顯類似的條帶。兩種使用單細(xì)胞測(cè)序試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增的方法均出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，說明擴(kuò)增過程中可能存在外源DNA污染。

2.3 可能污染源的排除

為了排除假陽(yáng)性現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因，我們委托億康基因公司使用MALBAC單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒，針對(duì)擴(kuò)增過程中使用的無(wú)菌水、PBS溶液、離心管以及試劑盒本身分別進(jìn)行了排除。研究結(jié)果表明，體外擴(kuò)增使用的水及各種試劑、耗材均未檢測(cè)到明顯擴(kuò)增，沒有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)（圖3：A），而陽(yáng)性對(duì)照卻擴(kuò)增出了明顯條帶（圖3：B），說明污染在可控范圍之內(nèi)。經(jīng)咨詢公司得知，其檢測(cè)時(shí)在第二輪擴(kuò)增使用的是17個(gè)循環(huán)，不是本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行單染色體擴(kuò)增使用的21個(gè)循環(huán)。當(dāng)我們改為17個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，染色體及陰性對(duì)照均沒有擴(kuò)增出條帶。這說明在較高的循環(huán)數(shù)下，BALBAC單細(xì)胞技術(shù)容易產(chǎn)生非特異性假陽(yáng)性擴(kuò)增。

2.4 使用SCoT分子標(biāo)記對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證

既然試劑耗材沒有產(chǎn)生明顯的外源污染，那么為什么使用MALBAC技術(shù)擴(kuò)增時(shí)增加循環(huán)數(shù)或者使用MDA技術(shù)擴(kuò)增時(shí)卻均出現(xiàn)了較明顯的假A. 使用MALBAC技術(shù)對(duì)分離的染色體進(jìn)行擴(kuò)增（循環(huán)數(shù)21）; B. 使用MDA技術(shù)對(duì)分離的染色體進(jìn)行擴(kuò)增。1. 一個(gè)完整細(xì)胞的全部染色體; 2. 單條染色體; 3. 無(wú)菌水陰性對(duì)照; 4. PBS陰性對(duì)照; M. DNA Marker-Q，分子量大小分別為200、400、600、800、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、4 000、5 000、6 000、8 000、10 000 （bp）。

A. Amplification with MALBAC technique （21 cycles）; B. Amplification with MDA technique. 1. Whole chromosomes of a single wheat cell; 2. A single chromosome of wheat; 3. Negative control （sterile water）; 4. Negative control （PBS solution）; M. DNA Marker-Q，molecule weight are 200，400，600，800，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000，4 000，5 000，6 000，8 000，10 000 （bp），respectively.

陽(yáng)性現(xiàn)象呢？其可能形成的原因是什么？為此，我們使用SCoT分子標(biāo)記來(lái)檢測(cè)外源污染是來(lái)自其他外源物種基因還是由于引物多聚體形成。擴(kuò)增結(jié)果顯示（圖4），陰性對(duì)照和MALBAC技術(shù)擴(kuò)增的樣品均沒有明顯的多態(tài)性條帶出現(xiàn)，而使用MDA技術(shù)擴(kuò)增的樣品使用引物P17和引物P21時(shí)，包含全部染色體的單個(gè)細(xì)胞（3號(hào)）和單條染色體（5號(hào)）卻有兩個(gè)樣品出現(xiàn)了較明顯的擴(kuò)增條帶，說明這兩個(gè)樣品可能是真實(shí)外源基因的擴(kuò)增。

2.5 使用Southern印跡對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述3號(hào)和5號(hào)樣品是否為小麥染色體的真實(shí)擴(kuò)增還是外源物種基因的擴(kuò)增，我們對(duì)其進(jìn)行了Southern雜交驗(yàn)證，使用小麥基因組DNA標(biāo)記的探針對(duì)這兩個(gè)樣品的MDA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，結(jié)果顯示除基因組陽(yáng)性對(duì)照外，這兩個(gè)樣品及陰性對(duì)照均沒有雜交信號(hào)出現(xiàn)（圖5）。因此，證明該擴(kuò)增產(chǎn)物可能是外源物種DNA污染造成。

2.6 高通量測(cè)序和序列比對(duì)驗(yàn)證污染類型及可能來(lái)源

為了進(jìn)一步證明該污染源的可能來(lái)源及其類型，我們對(duì)3號(hào)和5號(hào)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并隨機(jī)挑選委托安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司擴(kuò)增的2個(gè)樣品（MDA01和MDA02）進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。將以上4個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后顯示，其均未比對(duì)到小麥基因組上，而比對(duì)到了人（Homo sapiens）、微生物（Propionibacterium acnes、Cutibacterium acnes）、黑猩猩（Pan troglodytes）等物種上（表3）。其中，Cutibacterium acnes （Propionibacterium acnes）和Propionibacterium phage兩種微生物均可以棲息在人的皮膚上（Lood & Collin，2011; Brigitte et al.，2018）。

3 討論

首先分離單條染色體，然后再進(jìn)行體外擴(kuò)增，A 1-6. 實(shí)驗(yàn)1 中的PBS、水、空白各2次; 7-8. 實(shí)驗(yàn)3中的水各2次; 9-14. 實(shí)驗(yàn)2 中的PBS、水、空白各2次; 15-18. 實(shí)驗(yàn)4中的水、空白各2次。 B 1702A試劑17個(gè)循環(huán)擴(kuò)增效果。1. 陽(yáng)性樣本（50 pg小麥基因組DNA）; 2-3. 空白對(duì)照。

A 1-6. Detection of the PBS，water，blank in Test 1，each repeated twice; 7-8. Detection of the water in Test 3，repeated twice; 9-14. Detection of the PBS，water，and blank in Test 2，each repeated twice; 15-18. Detection of the water and blank in Test 4，each repeated twice. B Detected by MALBAC technique with 17 cycles. 1. Positive sample （50 pg wheat genomic DNA）; 2-3. The blank control.

1-2. 空白對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物（MDA擴(kuò)增產(chǎn)生的假陽(yáng)性產(chǎn)物）; 3. 使用MDA技術(shù)擴(kuò)增的一個(gè)細(xì)胞的全部染色體（42條）;? 4-5. 使用MDA技術(shù)擴(kuò)增的單條小麥染色體; 6-7. 使用MALBAC技術(shù)擴(kuò)增的單條小麥染色體。

1-2. Amplification products of blank control （false positive amplification products with MDA）; 3. Amplification products of the whole 42 chromosomes in a cell of wheat with MDA technique; 4-5. Amplification products of a single chromosome of wheat with MDA technique;? 6-7. Amplification products of a single chromosome of wheat with MALBAC technique.

建立單條染色體DNA文庫(kù)，對(duì)于構(gòu)建高密度分子標(biāo)記連鎖圖譜和分離重要基因、基因物理作圖和染色體進(jìn)化等研究具有重要應(yīng)用價(jià)值。在高通量全基因組測(cè)序中，一些物種基因組比較復(fù)雜，由于多倍體、雜合程度高或重復(fù)序列多等問題而導(dǎo)致后續(xù)數(shù)列的組裝和拼接困難，且質(zhì)量和效率低。如果能分離出單條染色體，針對(duì)單條染色體進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，則會(huì)大大降低物理圖譜構(gòu)建的難度。

近些年來(lái)，雖然國(guó)內(nèi)外多家單位嘗試使用單細(xì)胞測(cè)序的技術(shù)進(jìn)行單染色體測(cè)序研究，但目前還沒有成功的報(bào)道，主要原因是外源污染的假陽(yáng)性擴(kuò)增嚴(yán)重。本研究在嚴(yán)格防控外源污染的基礎(chǔ)上，針對(duì)單染色體測(cè)序過程中出現(xiàn)的假陽(yáng)性問題進(jìn)行研究，探討其可能的污染途徑和來(lái)源，并提出個(gè)人觀點(diǎn)：（一）假陽(yáng)性現(xiàn)象難以完全避免。首先，單染色體的分離和體外擴(kuò)增涉及較多步驟，每個(gè)步P. 陽(yáng)性對(duì)照（小麥基因組酶切產(chǎn)物）; 3. 圖4中3號(hào)（一個(gè)完整小麥細(xì)胞的全部42條染色體）擴(kuò)增產(chǎn)物; 5. 圖4中5號(hào)（單條小麥染色體）擴(kuò)增產(chǎn)物; N. 假陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物。

P. Positive control （restricted wheat genomic DNA）; 3. The same amplification products as the above sample No. 3 in Fig. 4 （the whole 42 chromosomes in a wheat cell）; 5. The same amplification products as the above sample No. 5 in Fig. 4 （a single wheat chromosome）; N. False positive amplification products.

驟涉及使用較多試劑、耗材和不同操作空間，絕對(duì)控制外源污染困難較大。其次，在使用MALBAC技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，在第二輪使用較多的循環(huán)數(shù)會(huì)增加假陽(yáng)性現(xiàn)象發(fā)生的幾率;而使用MDA技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，陰性對(duì)照也往往產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象（ Marcy et al.，2007; Yilmaz et al.，2010）。兩種單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)模板的擴(kuò)增均具有較高靈敏度，假陽(yáng)性的存在可能是因?yàn)闃O微量外源DNA在目標(biāo)樣品缺乏時(shí)被擴(kuò)增或引物自身形成的引物多聚體現(xiàn)象，如果在目標(biāo)樣品存在并獲得優(yōu)先擴(kuò)增的情況下，外源污染的擴(kuò)增或多聚物的形成則會(huì)被抑制。本研究在對(duì)假陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，污染物的來(lái)源與人體密切相關(guān)，其他來(lái)源的污染相對(duì)較少，說明對(duì)環(huán)境、試劑、耗材等的污染較易防控。但是，人體無(wú)法使用常規(guī)方式對(duì)外源DNA進(jìn)行降解和破壞。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中，要嚴(yán)格避免人體任何部位與實(shí)驗(yàn)試劑、耗材甚至操作環(huán)境的直接接觸，要全程穿戴一次性鞋套、口罩、帽子、實(shí)驗(yàn)服等，最大限度的減少外源污染。（二）單染色體擴(kuò)增失敗可能并不是因?yàn)槟０辶刻?，而是由于染色體本身沒有得到有效擴(kuò)增。本研究中，使用一個(gè)完整細(xì)胞的全部42條染色體進(jìn)行擴(kuò)增，同樣沒有獲得目標(biāo)樣本的基因組擴(kuò)增信息，而小麥基因組大小為15.4～15.8 Gb（Appels et al.，2018），卻大于已經(jīng)成功進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序的絕大多數(shù)物種。因此，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)使用單細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行小麥單染色體擴(kuò)增失敗的主要原因可能在于染色體的形態(tài)。染色體的高度濃縮超螺旋狀態(tài)會(huì)影響組蛋白的去除及DNA變性，一般的裂解條件可能無(wú)法使DNA從這種超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性且可以與引物有效結(jié)合的狀態(tài)，無(wú)法有效啟動(dòng)復(fù)制。此外，染色體制備過程中殘留的固定劑、染色劑等成分可能會(huì)對(duì)組蛋白消化和DNA聚合酶反應(yīng)等造成影響。

為成功使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行單條染色體的體外擴(kuò)增，建議從以下幾個(gè)方面進(jìn)行嘗試：（1）整個(gè)操作過程必須保證完全的無(wú)菌環(huán)境，所使用的儀器、器皿等工具應(yīng)嚴(yán)格高壓滅菌和紫外線滅菌;體外擴(kuò)增試劑應(yīng)選用經(jīng)過嚴(yán)格無(wú)菌化處理的商品化試劑盒;實(shí)驗(yàn)用水和其他試劑必須進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌和質(zhì)量檢測(cè)，確保無(wú)外源DNA污染后方可使用;嚴(yán)格做好自身防護(hù)，減少人體裸露部位暴露在環(huán)境中的機(jī)會(huì);全程設(shè)無(wú)菌水陰性對(duì)照;最好使用新建實(shí)驗(yàn)室和新的超凈工作臺(tái)等進(jìn)行操作，且需將染色體分離和擴(kuò)增兩個(gè)環(huán)節(jié)在不同實(shí)驗(yàn)室分開進(jìn)行，避免氣溶膠的污染。（2）通過高鹽緩沖液、使用蛋白酶K消化、延長(zhǎng)消化時(shí)間等措施盡量去除組蛋白，同時(shí)綜合運(yùn)用生物酶（如拓?fù)洚悩?gòu)酶等）、離心機(jī)械力等方法，盡可能地使染色體變?yōu)樗缮⒌木€性狀態(tài)。（3）評(píng)估染色體制備過程中不同藥劑對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，選擇最合適的染色體制備和染色方法，并爭(zhēng)取在前處理過程中通過減少操作時(shí)間、中和反應(yīng)和溶劑沖洗等措施降低或去除這種影響。建議使用較溫和的方法獲得染色體懸浮液后不經(jīng)染色直接使用微細(xì)玻璃針（管）吸取分離，進(jìn)行后續(xù)裂解和擴(kuò)增反應(yīng)。本研究團(tuán)隊(duì)在總結(jié)和深入解析單染色體測(cè)序失敗原因的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)染色體懸浮液制備和分離方法，增加蛋白酶K消化等步驟，目前已成功分離和體外擴(kuò)增了小麥的單條植物染色體，并經(jīng)過了Southern雜交驗(yàn)證，但顯示雜交信號(hào)不是很強(qiáng)，目前正在進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，相關(guān)研究結(jié)果將在后續(xù)文章中進(jìn)行報(bào)道。

本研究針對(duì)使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行單染色體體外擴(kuò)增和測(cè)序過程中普遍遇到的擴(kuò)增失敗和假陽(yáng)性問題，進(jìn)行了具體地分析和探討，并提出了可行性建議，為進(jìn)一步改進(jìn)植物單染色體擴(kuò)增技術(shù)提供借鑒。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）