高維寅，張 洪，羅 陽

(1.南昌大學第二附屬醫(yī)院急診科，江西南昌 330006；2.重慶大學生物工程學院，重慶 400044；3.重慶大學醫(yī)學院智慧檢驗與分子醫(yī)學中心，重慶 400044)

早在1937年，冠狀病毒首次從雞身上分離發(fā)現(xiàn)，病毒顆粒的直徑為60～200 nm，平均直徑為100 nm，呈球形或橢圓形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整個病毒像日冕，不同的冠狀病毒的棘突有明顯的差異[1]。冠狀病毒感染細胞內有時可以見到管狀的包涵體。新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是目前已知的第7種可以感染人的冠狀病毒[2]，其余6種分別是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和中東呼吸綜合征(MERS)-CoV[3]。冠狀病毒是一個大型病毒家族，已知輕癥可引起感冒類癥狀，重癥可引起MERS、SARS等。

目前所知，冠狀病毒科僅感染脊椎動物，與人、動物的多種疾病密切相關[4]。研究認為，血管緊張素轉化酶2(ACE2)是冠狀病毒感染的關鍵受體，只要表達ACE2受體的細胞均是冠狀病毒的侵襲對象[5]。研究觀察到ACE2定位于心臟、腎臟、肺、結腸和睪丸等組織中[6]，也在多種組織中低表達。ACE2在肝臟和腸等器官中具有重要作用。ACE2通常定位于上皮細胞的腔面，這是導致冠狀病毒高感染力的重要原因，因為SARS冠狀病毒通過表達ACE2的細胞腔面進行感染時，其感染效力更高。

如何在早期進行病毒鑒定是感染防控的關鍵。臨床常用的病毒病原學檢查主要包括病毒分離、病毒核酸檢測。病毒分離為實驗室檢測的“金標準”，病毒核酸檢測則用于快速診斷。受病毒感染機制影響，不同組織細胞中的SARS-CoV-2水平差異較大；而研究顯示SARS-CoV-2更趨向于結合肺泡上皮細胞，理論上來說其下呼吸道標本較上呼吸道標本病毒陽性檢出率更高[6]。因此收集標本時盡量留取多種標本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或氣管抽取物、痰或肺組織、血液和糞便)進行檢測和分離，可以提高準確性[7]。但對于短時間出現(xiàn)大量疑似患者，病毒分離遠不能滿足臨床工作需要，并且病毒分離需要三級生物安全實驗室進行，常規(guī)實驗室根本不具備上述條件，為確診工作帶來極大挑戰(zhàn)。

1 假陰性原因分析

2020年2月18日國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布了COVID-19診療方案(試行第六版)，明確COVID-19的確診方式有兩種：一種是實時熒光定量PCR(qPCR)檢測核酸呈陽性；第二種是病毒基因測序，與已知SARS-CoV-2高度同源。臨床上，大部分的高度疑似患者都采取方法一進行檢測。因為相對基因測序而言，qPCR方式具有速度快、批量化、價格低等優(yōu)勢。然而，影響qPCR結果的因素很多，如標本或核酸純化過程中出現(xiàn)的擴增反應抑制物、擴增儀孔間溫度的差異以及核酸提取中的隨機誤差，均可造成假陰性結果的出現(xiàn)。又如，以前擴增產(chǎn)物的污染和核酸提取中標本間的交叉污染，也很容易導致假陽性結果。因此，對于qPCR檢測結果的報告必須慎重，尤其是會導致嚴重后果時。本次COVID-19疫情暴發(fā)后，“金標準”核酸檢測卻多次出現(xiàn)假陰性結果，特別是個別病例在不同時間經(jīng)5次以上的檢測后結果由陰性轉為陽性，為臨床診斷和疾病控制帶來極大的困難。對關鍵部位進行標本采集(早期為咽拭子，第六版指南建議為痰標本)成為臨床科室性價比最高的選擇[1]。因此，本文重點結合臨床科室的具體實踐，針對臨床診斷陽性而核酸檢測顯示為假陰性的結果進行剖析，總結出導致檢測結果不準確的三大因素，希望有助于檢驗時機的把握，為下一步打贏疫情阻擊戰(zhàn)提供參考。

1.1太早 (1)檢測試劑不成熟：一個新病毒的出現(xiàn)，從分離到測序、鑒定，研發(fā)出成熟的試劑盒，需要一定的時間周期。隨著人類對疾病認識的深入，試劑盒本身還會逐漸優(yōu)化，其特異性和準確性必定會進一步提升。目前核酸檢測多采用qPCR技術，其檢測原理決定了大多數(shù)試劑盒的檢測靈敏度為100～500拷貝，這些試劑盒對于高濃度病毒檢出問題不大，但是不同廠家甚至于不同批次的試劑盒對于“灰區(qū)”的判定則明顯不一致。(2)疾病病程早：大部分假陰性患者處于疾病發(fā)展的早期。從現(xiàn)有文獻報道來看，COVID-19潛伏期長達14 d，個別病例甚至達到了29 d，早期臨床表現(xiàn)不典型，一旦進入快速發(fā)展期，病程進展極快[8]。在感染早期，病毒復制數(shù)量達不到qPCR檢測閾值的時候，出現(xiàn)假陰性不可避免。

1.2太多 待測的疑似病例數(shù)量多，有待排除感染的標本多，檢測操作步驟多。根據(jù)國家對傳染病管理的規(guī)定，陽性病例標本必須要送至疾病預防控制中心才能夠確認。然而，這樣長時間轉運標本極易導致病毒RNA的降解。后來國家下放確認權限，允許具備臨床擴增實驗室資質并且防護驗收合格的醫(yī)療機構檢驗科開展檢測。但在本次疫情之前，大多數(shù)實驗室均處于基本滿足臨床需要的狀態(tài)，少有富余檢測能力，在疑似病例大量出現(xiàn)的情況下，每日檢測數(shù)量超過實驗室既定極限，有的標本不得不被延遲檢測(只有達到標準的實驗室才有發(fā)布報告的權限)。標本難以做到即時送檢，只能是采集1批，留存1批，檢測1批，報告1批。許多標本都處于保存和檢測時間范圍的極值，甚至部分標本已經(jīng)超過檢測的最佳時限(后來這種情況隨著實驗室的快速改建擴容，送檢流程的優(yōu)化得到明顯的改善)。

由于疫情嚴重、發(fā)展迅速。在疫情暴發(fā)初期，防護裝備極為匱乏，為減少醫(yī)務人員感染病毒的風險，臨床上在留取標本的時候也盡可能采取集中采樣的方式，這也會影響標本采集的效果。醫(yī)護人員工作量過多，迫使大量非重癥和呼吸專業(yè)的醫(yī)護人員補充進來，對鼻、咽拭子采集流程和規(guī)范的不熟悉導致采樣標準的不統(tǒng)一，取樣部位不準確，導致標本陽性率下降。

1.3太雜 從有確診患者以來，COVID-19診治指南已發(fā)布多個版本。從湖北版指南、廣東版指南到最后的全國統(tǒng)一標準，盡管標準逐漸統(tǒng)一，但是很多一線操作人員對臨床具體取樣過程缺乏統(tǒng)一認識，仍舊采用陳舊的操作方式。目前的取樣涵蓋了血液、鼻拭子、咽拭子、肺泡灌洗液、排泄物、普通患者的痰液、插管患者的下呼吸道分泌物等標本類型。同時，對同一患者不同部位取樣進行核酸檢測，陽性率的統(tǒng)計學差異極有可能源于生理性差異。第六版診治指南發(fā)布以后，公開報道的假陰性患者明顯減少，這與全面實施規(guī)范化采樣過程關系密切。

2 對 策

COVID-19具有高傳染性、高隱匿性和高致病性，人們對于COVID-19的致病機制、臨床特點以及傳播途徑均存在著認識上的局限[9]，相信隨著人類與COVID-19疫情的斗爭，對疾病的認識會進一步深入和更加全面。目前可以從以下幾個方面進行規(guī)范，以減少檢測中的假陰性。

2.1綜合采用其他實驗室檢測手段 可以采用數(shù)字PCR等技術來對qPCR進行補充，特別是對于qPCR檢測陰性或者弱陽性標本，可以有效克服qPCR靈敏度不足的難題，適用于早期感染的判斷及患者治愈后的出院診斷。同時，對SARS-CoV-2抗原和抗體進行動態(tài)定量檢測也有助于識別感染者。目前，基于抗原檢測的試劑不多，大多數(shù)試劑盒采用免疫球蛋白(Ig)M/IgG聯(lián)合檢測以提高準確性。最新的研究報道，核酸檢測陰性但臨床癥狀確診的COVID-19患者中，IgM陽性率達到84.21%，IgG陽性率達到94.74%。聯(lián)合抗體和核酸檢測診斷COVID-19的總符合率為88.03%[10]。另外，結合實驗室的其他炎癥、凝血等指標進行綜合分析，也具有指導意義。聯(lián)合白細胞、淋巴細胞、C-反應蛋白、血清淀粉樣蛋白A等檢測指標可以提高診斷COVID-19的特異度和靈敏度，對重型和危重型COVID-19的診斷同樣有較高的參考價值[11]。淋巴細胞亞群和白細胞介素-6等炎性指標也可以用于輔助病情診斷。另外，降鈣素原可用來評估COVID-19患者是否有繼發(fā)感染及感染的嚴重程度。

2.2規(guī)范標本采集方式和過程 有條件的地區(qū)，在規(guī)范進行呼吸道標本采集和檢測的基礎上，盡可能完善其他部位標本采集(特別是合并消化道癥狀患者)，對減少假陰性結果可能有積極的意義。建議進行不同臨床標本檢測結果差異比對的臨床試驗，從而進一步規(guī)范標本來源；通過正規(guī)培訓和監(jiān)管來規(guī)范采樣過程并重視檢驗前的標本采集和保存工作。

2.3嚴格檢測試劑的監(jiān)管和審批 即便是再先進的檢測技術，也需要檢測儀器和試劑來承載。因此，不同廠家的試劑盒質量、陰(陽)性質控品、批間差異等指標顯得尤為重要。在疫情趨于平緩后，相關部門應該加強對各種檢測試劑盒的監(jiān)管工作，鼓勵各檢測產(chǎn)品和臨床擴增實驗室配合臨床檢驗中心進行室間質評以進行系統(tǒng)性評估。

總而言之，實驗室診斷只是能作為SARS-CoV-2檢測的重要手段之一，不能孤立地據(jù)此進行結果判斷。因為對該病毒的了解還不夠深入，有效的潛伏期篩查手段尚未建立，臨床上更應該重視患者的早期癥狀和影像學表現(xiàn)，將核酸檢測作為臨床診斷的“守門人”，并且配合多項實驗室檢查進行判斷。實驗室檢測和臨床診斷應當結合起來共同應對這個新型的病毒。