郭愛民 喀迪爾丁·艾爾肯 焦 麗 郝翠蘭 陳 琳 潘國強 謝志勝張文潤 容夢婕 岳 城

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院, 烏魯木齊 830052; 2. 新疆眾力洋漁業(yè)科技有限公司, 烏魯木齊 830052;3. 布爾津縣額河特有冷水魚繁育開發(fā)有限公司, 布爾津 836600)

異域物種形成(Allopatric speciation)理論認為,同一物種的種群若發(fā)生地理隔離, 就會阻止種群間的基因流, 經(jīng)過長期的基因突變、自然選擇和環(huán)境因素的共同作用后, 隔離形成的不同小種群會逐漸適應不同的生態(tài)環(huán)境, 逐步形成不同的地理宗或生態(tài)型(Geographic race), 不同的地理宗或生態(tài)型在分別獨自進化, 可形成不同的種[1]。

太門哲羅鮭(Hucho taimen)隸屬于鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)、哲羅鮭屬(Hucho)[2],是大型冷水性淡水兇猛魚類, 在1998年出版的《中國瀕危動物紅皮書·魚類》中被列為中國的瀕危物種[3]。哲羅鮭在新疆俗稱“大紅魚”, 因著名的喀納斯湖“湖怪”傳說, 而受到世人廣泛關注, 成為額爾齊斯河的乃至新疆的生物名片[4]。20世紀60年代,哲羅鮭在額爾齊斯河流域, 包括布爾津河、哈巴河和喀納斯湖, 以及黑龍江流域的黑龍江、松花江、牡丹江、烏蘇里江等廣泛分布[5—9]。研究顯示在第三紀早、中期額爾齊斯河流域和黑龍江流域通過西伯利亞水系相連, 起源于西伯利亞的鮭科魚類在各流域間相互交流、擴散, 到中晚期水體萎縮、河湖分隔漸趨明顯, 在第三紀末, 西伯利亞水域和黑龍江流域的魚類區(qū)系已產(chǎn)生很大的差別[10]。李思忠[11]認為額爾齊斯河流域和黑龍江流域的魚類區(qū)系組成相似但有一定差異, 1981年將兩個流域劃為北方區(qū)的額爾齊斯河亞區(qū)和黑龍江亞區(qū)。有學者認為兩個流域的哲羅鮭長期存在地理隔離, 缺乏基因交流, 逐漸適應各自的生活環(huán)境, 獨自演化繁衍,已產(chǎn)生一定的差異[12,13], 董崇智等[5]的形態(tài)學研究表明來自額爾齊斯河的哲羅鮭比黑龍江的哲羅鮭側線鱗、幽門盲囊數(shù)稍多。未見應用分子生物學的方法對兩地的哲羅鮭進行比較研究。

由于生態(tài)環(huán)境改變、過度捕撈等人為原因和哲羅鮭個體大、性成熟晚、個體產(chǎn)卵量小等生物學特性, 我國哲羅鮭的群體數(shù)量急劇下降, 分布區(qū)域迅速縮小[1,6,14]。世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)2011—2012年期間對世界范圍內(nèi)的哲羅鮭進行了瀕危等級評估, 中國太門哲羅鮭(H. taimen)的等級為“瀕?！? 且新疆和黑龍江的哲羅鮭在過去3代(51年)的下降率分別約為87%和95%[15]。黑龍江流域的哲羅鮭人工繁育已獲成功, 額爾齊斯河流域的哲羅鮭由于野生種群數(shù)量稀少, 難以捕獲, 瀕臨滅絕。哲羅鮭因神秘的“湖怪”傳說使喀納斯湖聞名于世, 為順應相關需求和恢復其自然種群, 新疆由黑龍江引進了哲羅鮭進行養(yǎng)殖, 2011年將引進的4萬余尾哲羅鮭子一代放流到額爾齊斯河流域[16]。有專家認為額爾齊斯河和黑龍江存在地理隔離, 兩地分布的哲羅鮭有差異, 也有專家表示兩地的哲羅鮭是同一種,學者們各執(zhí)己見, 沒有充足的理論依據(jù), 故哲羅鮭引種、養(yǎng)殖及放流的合理性、科學性存在的爭議。

我們在野外采樣工作中得到了數(shù)尾哲羅鮭, 為比較兩地哲羅鮭的異同, 我們同時采集了當?shù)匾M的哲羅鮭, 進行了形態(tài)學觀察, 擴增COⅠ基因, 進行了基因差異的研究, 以探究額爾齊斯河流域野生哲羅鮭和引進的哲羅鮭的差異, 以期為哲羅鮭的引種放流和土著物種的保護提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 魚樣采集

將額爾齊斯河流域白哈巴河采集到的哲羅鮭標記為HuchoBHB, 將額爾齊斯河流域的布爾津縣某水庫采集到的哲羅鮭標記為HuchoBEJ, 將布爾津縣某冷水魚養(yǎng)殖公司引進的黑龍江哲羅鮭標記為HuchoHLJ。分別從3個來源的哲羅鮭尾鰭剪切小塊組織(約0.3 cm×0.5 cm×1.0 cm)放入1.5 mL Eppendorf管中, 加95%酒精保存。

1.2 形態(tài)學觀察

由于標本魚為活體, 主要觀察了哲羅鮭的外部形態(tài), 未對幽門盲囊數(shù)等內(nèi)部特征進行解剖觀察。

1.3 分子生物學研究

DNA 提取將95%酒精保存的鰭條各剪取約20 mg, 用濾紙擦干酒精后剪碎, 放入1. 5 mL離心管中用Omega軟體動物DNA小量提取試劑盒提取DNA。相關操作依據(jù)試劑盒說明書進行。

基因擴增及測序PCR擴增采用標準的25 μL體系, 2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL, 1 pmol/μL上下游引物各1 μL, 10 ng/μL的模板2 μL, ddH2O 8.5 μL。COⅠ正向引物為TyrCOⅠ： 5′-CTGTTTAT GGAGCTACAATC-3′,COⅠ反向引物為SerCOⅠ：5′-GTGGCAGAGTGGTTATG-3′[17]; 反應程序為：94℃預變性5min; 94℃變性30s, 56℃退火30s, 72℃延伸90s, 30個循環(huán); 最后72℃延伸10min。PCR反應結束后, 將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析, 目的條帶切膠后用OMEGA公司的膠回收試劑盒進行純化, 純化產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體上, 并轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞中, 經(jīng)藍白斑篩選后, 選取2個陽性克隆送上海生物工程股份有限公司測序。純化產(chǎn)物送上海生工生物公司進行測序。

序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構建從GenBank中下載所有含有哲羅鮭COⅠ基因的序列共來自10個樣本以及一條圖們江細鱗鮭序列作為外類群(表1), 用mega 6.0將下載序列與本研究得到的3個序列進行比對, 刪除兩端無法對齊的堿基, 用最大似然法和鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹并計算遺傳距離進行分析。

2 結果

2.1 形態(tài)學特征

HuchoBHB、HuchoBEJ和HuchoHLJ的形態(tài)相似, 體長形, 略側扁, 呈圓筒形; 頭部略扁平, 有許多的黑色圓斑; 口端位, 口裂大; 吻略尖, 上頜較下頜略突出; 上頜骨明顯、游離, 其末端延伸到眼后緣之后; 眼側上位, 眼間距寬; 鼻孔1對, 位于眼前上方, 距眼較距吻端近; 上、下頜骨、犁骨、腭骨和舌上均有向內(nèi)傾斜的銳齒; 體被橢圓形小鱗,鱗前端較尖而后端較鈍; 側線完全, 位于體中側;背鰭起點處于體中部稍前, 胸鰭側下位, 起點稍后于腮蓋膜后緣, 腹鰭位于背鰭基后端之下, 胸、腹鰭較小, 腹鰭基部有腋鱗, 臀鰭與脂鰭相對應; 體側有多數(shù)密集如粟粒狀的暗黑色小十字形斑點。但HuchoBHB背部為蒼青色, 腹部銀白色, 斑點小,斑點少而淡, 皮色通透;HuchoBEJ和HuchoHLJ的背部為黑褐色, 斑點大, 斑點黑而密, 皮色不通透(圖1)。董崇智等[1]此前對黑龍江流域和額爾齊斯河流域的哲羅鮭進行了詳細的形態(tài)學測量及解剖學研究(表2)。

2.2 分子生物學結果比較

電泳結果顯示COⅠ基因片段大小約為1600 bp,這與預期結果一致; 測序所得序列與從GenBank下載序列進行比對、計算遺傳距離并構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2、圖3)。

表1 來自GenBank的哲羅鮭基因序列Tab. 1 Gene sequences of Hucho from GenBank

從基于COⅠ基因的ML樹看,HuchoBHB、HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河(中國稱黑龍江)的太門哲羅鮭(H. taimen)聚為一個大的分支, 在這個大的分支下,HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河(中國稱黑龍江)的太門哲羅鮭(H.taimen)聚到一起, 而HuchoBHB形成一個獨立的分支。這個大的分支又與我國的川陜哲羅鮭(H.bleekeri)和歐洲的多瑙哲羅鮭(H. hucho)聚成的分支形成一個總的分支。NJ樹的結果與ML樹結果相一致。

圖1 額爾齊斯河流域不同來源哲羅鮭的形態(tài)Fig. 1 Morphologes of different sources of Hucho in the Irtysh River basin

從基于COⅠ基因的遺傳距離看(表3), 川陜哲羅鮭(H. bleekeri)與太門哲羅鮭(H. taimen)的種間距離為0.0127—0.0160, 川陜哲羅鮭(H. bleekeri)和多瑙河哲羅鮭(H. hucho)的遺傳距離為0.0140—0.0166,多瑙河哲羅鮭(H. hucho)與太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0.0134—0.0160, 說明哲羅鮭的屬間距離大約在0.0127—0.0160; 已發(fā)布的各太門哲羅鮭(H. taimen)相互間的遺傳距離為0—0.0038, 說明太門哲羅鮭的種間遺傳距離在0.0038左右。HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河(中國稱黑龍江)太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0—0.0031,HuchoBEJ與俄羅斯阿穆爾河太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0.0006—0.0044,HuchoHLJ和HuchoBEJ的遺傳距離為0.0038, 與太門哲羅鮭(H. taimen)的種間遺傳遺傳距離相一致;HuchoBHB與俄羅斯阿穆爾河、太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0.0057—0.0076,HuchoBHB與HuchoHLJ和HuchoBEJ的遺傳距離為0.0082和0.0057, 明顯大于太門哲羅鮭(H. taimen)的種間遺傳距離。HuchoBHB與川陜哲羅鮭(H.bleekeri)和多瑙河哲羅鮭(H. hucho)的遺傳距離為0.134—0.160, 與哲羅鮭的屬間遺傳距離(0.0127—0.0160)相一致, 這些結果說明HuchoHLJ、HuchoBEJ、HuchoBHB均為太門哲羅鮭(H. taimen), 但HuchoBHB與HuchoHLJ和HuchoBEJ及俄羅斯阿穆爾河分布的太門哲羅鮭(H. taimen)遺傳距離較大, 在基因上存在一定差異。

表2 不同水域哲羅鮭的主要性狀Tab. 2 Main traits of Hucho in different waters

圖2 基于哲羅鮭COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(ML)Fig. 2 Phylogenetic tree (ML) based on COⅠ gene of Hucho

3 討論

3.1 形態(tài)學特點

形態(tài)學觀察表明, 3種來源的哲羅鮭形態(tài)基本一致, 但存在部分差異：HuchoBHB背部為蒼青色,腹部銀白色, 斑點小, 斑點淡而少, 皮色通透;HuchoBEJ和HuchoHLJ背部為黑褐色, 斑點大, 斑點黑而密, 皮色不通透, 說明HuchoBHB與HuchoBEJ和HuchoHLJ在形態(tài)上有一定差異。本研究由于野生樣本為活體, 未對幽門盲囊數(shù)進行統(tǒng)計, 但據(jù)董崇智等[1]研究, 來自額爾齊斯河流域的哲羅鮭較黑龍江流域的哲羅鮭側線鱗、幽門盲囊數(shù)稍多, 表明2個流域的哲羅鮭在解剖構造上存在一定差異。

查閱各種含有哲羅鮭形態(tài)學描述的書籍發(fā)現(xiàn)不同專家對哲羅鮭的形態(tài)學描述略有不同, 如吻型特點, 石瓊等[24]、孫晨旭等[25]、袁國映[26]的描述是“吻尖”, 鄭葆珊[27]的描述是“吻鈍”, 而中國科學院動物所等機構聯(lián)合出版的《新疆魚類志》中的描述則是“吻略尖”[28]; 對于口位的描述, 鄭葆珊[27]的描述為“口前位”, 其他書籍中則描述為“口端位”[24—26];鱗片特點, 大多的描述為“鱗極細小, 橢圓形”[25—27],《新疆百科全書》[29]的描述則是“鱗片很小, 呈三角形”, 鄭葆珊[28]的描述則為“體背橢圓形小鱗, 鱗前端略尖, 后端較鈍”。我們認為, 導致這些形態(tài)描述特點不一致的原因可能跟樣本的采集地不同、樣本采集的時間、形態(tài)描述時的用詞差異等有關。

圖3 基于COⅠ基因的哲羅鮭系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ)Fig. 3 Phylogenetic tree (NJ) based on COⅠ gene of Hucho

表3 基于哲羅鮭COⅠ基因的遺傳距離矩陣Tab. 3 Genetic distance matrix based on the COⅠgene of Hucho

3.2 基因序列差異

由系統(tǒng)發(fā)育樹可看出,HuchoBHB、HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河(中國稱黑龍江)的太門哲羅鮭(H. taimen)聚為一個大的分支, 在這個大的分支下,HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河的太門哲羅鮭(H. taimen)聚到一起, 而HuchoBHB形成一個獨立的分支。由遺傳距離矩陣可看出,HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0—0.0044,與太門哲羅鮭(H. taimen)的種間距離相一致, 說明HuchoBEJ和HuchoHLJ為太門哲羅鮭(H. taimen);HuchoBHB與俄羅斯阿穆爾河的太門哲羅鮭(H.taimen)的遺傳距離(0.0057—0.0076)約為太門哲羅鮭(H. taimen)種間距離(0—0.0038)的兩倍, 與川陜哲羅鮭(H. bleekeri)和多瑙河哲羅鮭(H. hucho)的遺傳距離(0.0134—0.0160)與哲羅鮭的屬間遺傳距離(0.0127— 0.0160)相一致, 說明HuchoBHB為太門哲羅鮭(H. taimen), 但與俄羅斯阿穆爾河的太門哲羅鮭(H. taimen)在基因上的存在較大差異。

3.3 三個不同來源哲羅鮭的關系

相關研究表明冷水魚對冷水產(chǎn)卵環(huán)境具有獨特的選擇性, 和冷水魚強烈的返家繁殖習性及很弱的擴散能力, 地理種群間很容易因基因交流出現(xiàn)障礙而產(chǎn)生顯著的遺傳分化[30—33]。馬波等[34]的研究表明, 盡管水系相連, 但在嫩江上游、黑龍江、圖們江中的細鱗鮭表現(xiàn)出形態(tài)差異, 推測其為地理隔離導致的遺傳分化, 認為圖們江的細鱗鮭是尖吻細鱗鮭的一種特殊的地理生態(tài)類群。

我們的研究結果在形態(tài)學表征和分子數(shù)據(jù)皆顯示, 額爾齊斯河流域和黑龍江流域的哲羅鮭由于長期的地理隔離, 適應不同的地理環(huán)境, 進化繁衍, 從而在形態(tài)和基因上都產(chǎn)生了較大差異, 特別是基因序列方面, 來自額爾齊斯河流域的HuchoBHB與黑龍江流域的哲羅鮭在進化樹上形成單獨的分支, 遺傳距離為黑龍江流域哲羅鮭種間距離的兩倍, 可作為太門哲羅鮭(H. taimen)的不同生態(tài)地理類群。而HuchoBEJ與HuchoHLJ及俄羅斯阿穆爾河的哲羅鮭(中國稱黑龍江)在進化樹上聚到了一起, 遺傳距離為0—0.0044, 與太門哲羅鮭中間距離相一致, 我們推測HuchoBEJ為當年放流或養(yǎng)殖場逃逸的哲羅鮭。

3.4 關于引種問題的探討

外來種(Alien or exotic species)是指那些出現(xiàn)