章曉棟 沈文英 任 崗

(紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物系, 紹興 312000)

肌抑素(Myostatin, MSTN)是骨骼肌生長發(fā)育的負調(diào)控因子[1], 抑制成肌細胞的增殖和分化[2]。肌抑素前體蛋白由信號肽、編碼前體肽的N-末端區(qū)和編碼成熟肽的C-末端區(qū)三部分組成, 經(jīng)兩步蛋白酶切轉(zhuǎn)化成成熟的肌抑素[3,4]。肌抑素前體肽(Myostatin propetide, MSTNpp)在酶切分泌后通過非共價相互作用, 與成熟肽間形成復(fù)合物, 抑制成熟肽與其受體的結(jié)合, 阻斷肌抑素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而抑制肌抑素生物活性, 促進肌肉生長[5]。研究表明, 過表達肌抑素前體肽或?qū)⒓∫炙厍绑w肽注入小鼠均可有效促進肌肉生長, 表現(xiàn)出骨骼肌的“雙肌”現(xiàn)象[6,7]。在斑馬魚胚胎發(fā)育中過表達肌抑素前體肽, 骨骼肌肌纖維數(shù)量顯著增加, 胚胎體型大、生長加快[8]。相對于脊椎動物中肌抑素及前體肽的深入研究, 無脊椎動物肌抑素的研究較少。目前只在海灣扇貝(Argopecten irradians)[9]、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodom)[10]、大西洋龍蝦(Homarus americanus)[11]、日本長額蝦(Pandalopsis japonica)[12]、日本沼蝦(Macrobrachium nipponenese)[13]等物種克隆得到肌抑素基因。研究表明, 在蛻皮階段,大西洋龍蝦、日本長額蝦、日本沼蝦等肌抑素基因表達下調(diào), 促進間歇性快速生長[11—13]。而關(guān)于無脊椎動物肌抑素前體肽的研究尚未見報道。

日本沼蝦(M. nipponenese)是我國養(yǎng)殖面積最廣、產(chǎn)量最大的淡水經(jīng)濟蝦類。在日本沼蝦養(yǎng)殖中, 存在生長緩慢、個體小型化、性早熟等現(xiàn)象[14],導(dǎo)致生長速度和生產(chǎn)性能低下, 養(yǎng)殖總產(chǎn)量不高。目前, 主要通過遺傳育種和飼料研發(fā)等手段改良日本沼蝦性狀, 提高養(yǎng)殖規(guī)格和效益[15,16]。本研究從日本沼蝦肌肉生長調(diào)控角度探討促進生長的途徑,在前期日本沼蝦MSTN全基因的克隆和表達特性研究[13]基礎(chǔ)上, 采用枯草芽孢桿菌表達體系表達日本沼蝦肌抑素前體肽, 分析其對生長的影響, 為闡明日本沼蝦肌抑素前體肽對肌肉生長發(fā)育的調(diào)節(jié)機理及其在養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、枯草芽孢桿菌WB800, 均為本實驗室保存。穿梭分泌性表達載體pGJ105, 為本實驗室構(gòu)建。

1.2 穿梭分泌性表達載體的構(gòu)建

根據(jù)日本沼蝦MSTNpp原始基因序列特征, 按照枯草芽孢桿菌的偏愛密碼子對MSTNpp基因序列進行優(yōu)化合成(上海生工, 上海)BsMSTNpp, 并亞克隆到pET28a(NdeⅠ/XhoⅠ), 獲得質(zhì)粒pET28a-BsMSTNpp。根據(jù)優(yōu)化合成基因全長序列, 設(shè)計表達引物, 上游引物為P001CF： 5′-GGCAACCGCCTCT GCAGCGCAGAAAAGCCACGGGAAAAC-3′, 下游引物為3pETR： 5′-TCATTAAGCTTGTCGG GATCCGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGG-3′, 下劃線為同源重組片段。以質(zhì)粒pET28a-BsMSTNpp為模板, 目的基因全長序列951 bp, 反應(yīng)體系為50.0 μL。PCR反應(yīng)條件： 98℃, 5min; 98℃,10s;55℃, 10s; 72℃, 60s; 5個循環(huán); 98℃, 10s; 58℃, 30s;72℃, 60s; 30個循環(huán); 72℃延伸10min, 并進行PCR產(chǎn)物切膠回收。

枯草芽孢桿菌的表達載體pGJ105用PstⅠ和BamHⅠ進行雙酶切, 酶切產(chǎn)品切膠回收, 將純化后的PCR產(chǎn)物2.5 μL與載體酶切產(chǎn)物pGJ105(PstⅠ-BamHⅠ)2.5 μL、Gibson Assembly Master Mix(2×,NEB, E5510S)5 μL, 置于PCR儀中50℃反應(yīng)15min,進行同源組裝, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α, 篩選并測序獲得重組質(zhì)粒pGJ105-BsMSTNpp。

1.3 MSTNpp基因在枯草芽孢桿菌中的表達及鑒定

通過二步法[17]制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pGJ105-BsMSTNpp轉(zhuǎn)化進入枯草芽孢桿菌WB800感受態(tài)細胞中; 通過PCR和酶切鑒定, 挑選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性克隆轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基(SpcR, 100 ng/mL)中, 在30℃, 180 r/min培養(yǎng)至24h, 收集上清液, 以含pGJ105空質(zhì)粒的WB800菌株作為對照, 通過Western blot檢測目的蛋白的表達。

取不同時間的發(fā)酵液上清進行Western blot分析, 檢測重組BsMSTNpp的表達和分泌的時間動態(tài)情況。

1.4 MSTNpp重組枯草芽孢桿菌菌劑和飼料的制備方法

重組枯草芽孢桿菌接種于枯草發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃, 180 r/min培養(yǎng)24h離心取菌泥, 37℃恒溫干燥至恒重, 與白炭黑、玉米淀粉按1：0.5：4的質(zhì)量比混合制成干菌粉, 干菌粉中重組枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為109cfu/g。將枯草芽孢桿菌工程菌按照日本沼蝦餌料的0.5‰、1‰的比例加入日本沼蝦餌料中, 用α淀粉粘合、攪拌均勻, 風(fēng)干, 再噴灑5‰的橄欖油包被, 風(fēng)干后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MSTNpp枯草芽孢桿菌投喂日本沼蝦養(yǎng)殖實驗

選擇平均體重為(1.52±0.11) g, 平均體長為(4.55±0.21) cm的健康日本沼蝦, 隨機分為4組, 每組3個重復(fù), 每個重復(fù)200尾, 養(yǎng)殖于體積為1 m3的水泥池中, 實驗期間保持養(yǎng)殖水溫為(24±3)℃, 日投喂量為蝦體重的2%, 試驗開始前暫養(yǎng)1周。在日本沼蝦基礎(chǔ)飼料中添加0.5‰和1‰重組枯草芽孢桿菌菌劑, 分別作為實驗組1和實驗組2; 投喂無任何添加的日本沼蝦基礎(chǔ)飼料, 作為對照組1, 在日本沼蝦基礎(chǔ)飼料中添加1‰空白枯草芽孢桿菌生物制劑(不表達MSTNpp的空白枯草芽孢桿菌), 作為對照組2;實驗周期為30d。實驗開始前和結(jié)束時測定日本沼蝦體重, 計算特定生長率(Special growth rate,SGR)和增長率。SGR(%)=(LnWt-LnW0)/T×100%; 其中Wt,W0分別表示平均終末體重(g)、平均初始體重(g);T表示飼養(yǎng)時間(d)。增長率(%)=[(實驗組或?qū)φ战M2SGR-對照組1SGR)/對照組1SGR]×100%。

實驗結(jié)束取日本沼蝦肌肉組織, 稱重, 按1﹕9的比例加入PBS, 冰浴條件下勻漿, 制備成10%的組織勻漿, 2500 r/min, 離心10min, 取上清測定肌酸激酶活性, 肌酸激酶(CK)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司(南京)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±SD表示, 利用DPS軟件處理數(shù)據(jù),P＜0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 BsMSTNpp表達載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pET28a-BsMSTNpp為模板, P001CF(PstⅠ)和3pETR(BamHⅠ)為引物擴增優(yōu)化好的BsMSTNpp基因, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測, 目的條帶大小約1000 bp, 與預(yù)期結(jié)果(951 bp)相符。采用PstⅠ和BamHⅠ雙酶切pGJ105質(zhì)粒, 分別回收酶切產(chǎn)物和PCR片段, 通過同源組裝連接后轉(zhuǎn)化, 雙酶切和PCR鑒定陽性重組子, 送陽性克隆進行測序鑒定, 測序正確得到BsMSTNpp重組表達質(zhì)粒pGJ105-BsMSTNpp (圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pGJ105-BsMSTNpp和目的基因PCR電泳Fig. 1 PCR of recombined pGJ105-BsMSTNpp and BsMSTNpp gene

2.2 BsMSTNpp基因在枯草芽孢桿菌中的表達

將重組質(zhì)粒pGJ105-BsMSTNpp轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主菌WB800, 培養(yǎng)24h后, 收集上清液進行Western blot鑒定, 結(jié)果顯示陽性菌上清中有與預(yù)期大小相近的條帶, 由于融合了His.Tag的一段序列,所以重組蛋白理論分子量約36.0 kD (圖2)。

圖2 重組菌發(fā)酵上清Western blot鑒定Fig. 2 Western blot analysis of the supernatant samples

2.3 BsMSTNpp基因在枯草芽孢桿菌分泌表達時間動態(tài)

取不同時間的發(fā)酵液上清進行Western blot鑒定分析, 檢測重組BsMSTNpp的表達和分泌情況(圖3)。在發(fā)酵液的上清中, 在培養(yǎng)24h后開始出現(xiàn)重組BsMSTNpp的表達條帶, 從條帶的灰度分析可見, 重組BsMSTNpp隨著時間的延長, 其表達量逐漸在升高。在檢測的時間范圍內(nèi), 在分泌上清中100h后達到最高值, 重組BsMSTNpp的表達量相對于24h約提高了10倍。

2.4 肌抑素前體肽對日本沼蝦生長和CK酶活力的影響

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后測定日本沼蝦特定生長率, 對照組1、對照組2、實驗組1和實驗組2日本沼蝦SGR分別是2.88%、3.00%、3.17%和3.31% (表1)。添加0.5‰和1‰表達MSTNpp的重組枯草芽孢桿菌的實驗組日本沼蝦SGR顯著高于對照組1(P＜0.05),分別提高10.1%和14.9%; 實驗組日本沼蝦SGR均高于對照組2, 但不存在顯著性差異。日本沼蝦肌酸激酶活性測定結(jié)果表明, 實驗組1和實驗組2的CK酶活性顯著高于對照組(P＜0.05), 表明重組表達MSTNpp枯草芽孢桿菌能有效提高日本沼蝦CK酶活性。推測重組表達的MSTNpp可能通過促進肌細胞增殖和分化提高肌肉組織生長, 從而進一步影響日本沼蝦生長速度。

圖3 不同發(fā)酵時間WB800 [pGJ105-BsMSTNpp]上清中BsMSTNpp的Western blot分析Fig. 3 Western blot analysis for recombined BsMSTNpp expression

3 討論

枯草芽孢桿菌(B. subtilis)具有較清楚的遺傳背景、良好的分泌性和無致病性等優(yōu)點, 將其芽孢制備成口服制劑能夠耐受胃腸道環(huán)境, 目前已作為重要工業(yè)菌種應(yīng)用于水產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖業(yè), 被批準(zhǔn)為食品級安全菌株[18]。和大腸桿菌表達系統(tǒng)相比, 枯草芽孢桿菌胞壁不含內(nèi)毒素, 簡化了表達產(chǎn)物的純化和回收; 和酵母表達系統(tǒng)相比, 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)成本低, 發(fā)酵周期短[19,20]。但枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)存在一個限制因素, 即生長到對數(shù)末期時會分泌表達多種胞外蛋白酶, 導(dǎo)致目的蛋白降解。Bol-huis等[21]利用基因失活的突變方法, 成功構(gòu)建一株在野生菌株的基礎(chǔ)上缺失了8個蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌WB800, 該蛋白酶缺陷菌株胞外蛋白酶的活力只有野生型的0.32%, 克服了表達蛋白降解及不穩(wěn)定等問題。近年來, 隨著枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的完善, 越來越多地應(yīng)用于飼用酶、飼用代謝產(chǎn)物、抗菌肽、藥用蛋白、抗原蛋白的生產(chǎn)[22—25]。由于大部分枯草芽孢桿菌不含內(nèi)源性質(zhì)粒, 體外連接的雙鏈質(zhì)粒DNA分子直接轉(zhuǎn)化宿主效率很低, 因此構(gòu)建大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體十分必要[26—28]。本研究根據(jù)枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的特點, 對日本沼蝦MSTNpp基因序列進行了優(yōu)化, 同時為提高轉(zhuǎn)化效率, 構(gòu)建了大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pGJ105, 構(gòu)建重組表達載體pGJ105-BsMSTNpp, 成功地在枯草芽孢桿菌WB800中表達了日本沼蝦肌抑素前體肽基因, 經(jīng)過Western blot檢測到大小為36.0 kD的表達產(chǎn)物。本研究采用了組合型啟動子PrapA, 不需要誘導(dǎo)物, 重組蛋白可以持續(xù)表達[27], 通過分析發(fā)酵時間對重組BsMSTNpp表達量的影響, 結(jié)果表明發(fā)酵時間與重組BsMSTNpp表達量成正相關(guān)。

為驗證表達產(chǎn)物的生物活性, 本實驗將表達有MSTNpp的枯草芽孢桿菌工程菌添加到日本沼蝦飼料進行投喂。結(jié)果表明, 枯草工程菌能夠有效提高日本沼蝦的肌酸激酶活性和特定生長率, 促進日本沼蝦生長。大量研究表明枯草桿菌可以提高草魚、凡納濱對蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長性能[28—31]。在本研究中, 實驗組日本沼蝦特定生長率顯著提高,但和對照組2間不存在顯著性差異, 可能與養(yǎng)殖周期不夠長有關(guān)。在小鼠和斑馬魚的研究表明, 過表達肌抑素前體肽可以有效促進骨骼肌細胞的增殖和生長[6—8]。CK又叫磷酸肌酸激酶(Creatine phosphokinase, CPK), 催化肌酸轉(zhuǎn)換成磷酸肌酸, 消耗三磷酸腺甘(Adenosine triphosphate, ATP)生成二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate, ADP), 是肌肉組織代謝的關(guān)鍵酶, 在成肌細胞增殖和分化過程中能快速合成肌酸激酶[32], CK已成為直接測定肌細胞增殖和分化能力的特異性指標(biāo)[33,34]。本研究結(jié)果表明重組表達MSTNpp枯草芽孢桿菌能有效提高日本沼蝦肌酸激酶活性, 證明日本沼蝦肌細胞的增殖和分化能力增強了。推測重組表達的MSTNpp可能通過促進肌細胞增殖和分化提高肌肉組織生長,從而進一步影響日本沼蝦生長速度。

表1 MSTNpp重組蛋白對日本沼蝦生長率和肌酸激酶活性的影響Tab. 1 Effects of recombined MSTNpp on growth rate and creatine kinase activity

4 結(jié)論

本實驗采用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)對日本沼蝦MSTNpp進行表達, Western blot檢測到重組MSTNpp蛋白分子量約為36.0 kD。為進一步研究MSTNpp對日本沼蝦生長的作用機理提供了基礎(chǔ)。將重組枯草芽孢桿菌投喂日本沼蝦30d, 驗證表達產(chǎn)物的生物活性, 結(jié)果證明重組表達MSTNpp枯草芽孢桿菌能提高日本沼蝦CK酶活性, 促進肌細胞增殖和分化, 進一步影響生長速度。為肌抑素前體肽進一步應(yīng)用于日本沼蝦養(yǎng)殖提供了實驗基礎(chǔ)。