王昕源，張雨，楊楠，程禾，孫玉潔

研究報告

DNMT3a通過提升基因內(nèi)部甲基化介導(dǎo)紫杉醇誘導(dǎo)的LINE-1異常表達

王昕源1,2，張雨1,2，楊楠1，程禾1,2，孫玉潔1,2

1. 南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇省人類功能基因組學(xué)重點實驗室，南京 211166 2. 南京醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)系，南京 211166

藥物誘導(dǎo)的長散在重復(fù)序列LINE-1異常激活可促進細胞基因組不穩(wěn)定，而基因組不穩(wěn)定是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展和耐藥表型形成的重要因素。因此，探索LINE-1異常激活的分子機制具有重要的理論和臨床意義。DNA甲基化是調(diào)控基因表達的重要方式，已知DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員DNMT3a不僅能通過促進基因啟動子甲基化抑制基因表達，還可通過增強基因內(nèi)部甲基化上調(diào)基因表達。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，將乳腺癌細胞暴露于化療藥物可誘導(dǎo)LINE-1異常高表達，但LINE-1啟動子甲基化水平并無顯著改變。本研究進一步探討了在化療藥物壓力下DNMT3a是否可通過增強LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平促進LINE-1在乳腺癌細胞中的異常高表達。ChIP實驗和甲基分析結(jié)果顯示，用化療藥物紫杉醇(PTX)處理乳腺癌細胞，不僅可以誘導(dǎo)DNMT3a表達，而且可以促進DNMT3a與LINE-1基因內(nèi)部區(qū)域的結(jié)合，提升其基因內(nèi)部甲基化水平, 進而上調(diào)LINE-1的表達水平。利用表達載體增加細胞內(nèi)DNMT3a的表達水平，可顯著上調(diào)LINE-1基因內(nèi)部的甲基化及基因的表達水平，而下調(diào)DNMT3a的表達可有效抑制LINE-1表達。上述研究結(jié)果表明，DNMT3a介導(dǎo)的基因非啟動子區(qū)甲基化在藥物誘導(dǎo)的LINE-1異常激活中發(fā)揮重要作用，為認(rèn)識LINE-1在乳腺癌化療耐藥性形成過程中異常激活的機制提供了新思路。

乳腺癌；LINE-1異常激活；基因內(nèi)部DNA甲基化；DNMT3a

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤之一，與結(jié)腸癌、肺癌并列為全世界發(fā)病率最高的三大癌癥[1]。在中國，乳腺癌已經(jīng)成為女性患病率最高的癌癥(17.1%)，并且其發(fā)病率逐年上升[2]?；瘜W(xué)藥物治療(簡稱化療)是乳腺癌系統(tǒng)性治療中不可缺少的一部分，然而癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐受性是阻礙化療成功的主要原因之一[3~5]。

長散在重復(fù)序列LINE-1(long interspersed nuc-lear element-1, LINE-1)是一種能夠自主發(fā)生轉(zhuǎn)座的“逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件”[6,7]，約占人類基因組的18%[8,9]。完整的LINE-1主要包括2個開放閱讀框，分別編碼Orf-1和Orf-2兩種蛋白。其中Orf-1具有RNA結(jié)合能力，Orf-2具有核酸內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性。Orf-1蛋白翻譯后能夠識別并結(jié)合編碼他們的信使RNA (message RNA, mRNA)，與Orf-2形成核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoprotein complex, RNP)進入細胞核，Orf-2蛋白的核酸內(nèi)切酶活性能夠識別基因組DNA 上的目標(biāo)序列(AATTT)并對其進行切割，其逆轉(zhuǎn)錄酶活性能夠利用暴露的TTT為引物，以LINE-1的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生新的LINE-1 DNA并拷貝整合入基因組，這一過程被稱為“靶點引導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄過程”(target-site primed reverse transcription, TPRT)[10~12]。LINE-1的逆轉(zhuǎn)錄過程不僅可能會破壞基因或非編碼功能區(qū)域的完整性，還可能會導(dǎo)致DNA雙鏈斷 裂，進而使得細胞基因組發(fā)生更多的非等位基因同源性重組以及對染色質(zhì)重組的無效性修復(fù)[10,13,14]。LINE-1所表達的兩個蛋白，亦能單獨發(fā)揮其自身功能。例如Orf-1能夠單獨發(fā)揮其RNA結(jié)合能力，參與mRNA和小核RNA (small nuclear RNA, snRNA)在內(nèi)的多種RNA的活化[15,16]。而Orf-2也能直接對基因組DNA雙鏈進行切割從而導(dǎo)致DNA雙鏈斷 裂[14,17]。而這些現(xiàn)象最終都會導(dǎo)致細胞基因組不穩(wěn)定性的形成。

基因組不穩(wěn)定性是一種以遺傳改變頻率升高為主要特點的突發(fā)性的細胞狀態(tài)[18]。研究表明，基因組的不穩(wěn)定會增進腫瘤異質(zhì)性、促進腫瘤的克隆演變，從而使多種腫瘤產(chǎn)生原發(fā)性耐藥或獲得性耐藥表型[19~21]。LINE-1在正常乳腺細胞中一般處于沉默狀態(tài)，而在多種亞型的乳腺癌中均異常激活[22,23]。有研究表明多種癌癥中異常激活的LINE-1會加劇細胞基因組不穩(wěn)定性從而增加腫瘤細胞的多樣性，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并且還會導(dǎo)致腫瘤耐藥性的形成[10,11,20,24,25]。因此，深入探索LINE-1在乳腺癌中異常激活的機制，對于提升乳腺癌臨床治療效果，以及改善患者預(yù)后均具有極為重要的現(xiàn)實意義。

DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)形成的表觀遺傳修飾方式之一，其功能與修飾區(qū)域在基因組上的相對位置密切相關(guān)。發(fā)生于啟動子區(qū)域的甲基化一般與基因沉默相關(guān)[26]，而發(fā)生于基因內(nèi)部的甲基化被認(rèn)為與基因表達激活和激活狀態(tài)的維持相關(guān)[26]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族(DNA methyltransferases, DNMTs)主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。其中，DNMT1發(fā)揮“維持原有甲基化”的功能[27]，而DNMT3a和DNMT3b則發(fā)揮“從頭合成甲基化”(methylation)的功能[28]。研究證明3種DNMTs均能作用于啟動子甲基化[27]，通過抑制轉(zhuǎn)錄因子在啟動子區(qū)域的結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄聚合體形成等方式抑制基因的表達。此外，DNMT3a還具有調(diào)控基因內(nèi)部甲基化的功能，可通過直接提升基因內(nèi)部甲基化水平，使得基因保持穩(wěn)定持續(xù)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，從而促進基因的表達[28~31]。并且DNMT3a還能夠在多種保守染色質(zhì)區(qū)域上發(fā)揮其“從頭合成甲基化”功能，建立新的甲基化位點，使得這些原本處于沉默狀態(tài)的保守染色質(zhì)區(qū)域重新激活[29~31]。但是目前為止，DNMT3a通過基因內(nèi)部甲基化維持基因的轉(zhuǎn)錄或直接激活基因轉(zhuǎn)錄的潛在的機制還未有深入而詳細的報道。

目前認(rèn)為LINE-1啟動子高水平甲基化修飾對于LINE-1轉(zhuǎn)錄具有顯著抑制作用[32]，但是關(guān)于基因內(nèi)部甲基化能否調(diào)控LINE-1的轉(zhuǎn)錄依舊研究尚淺。本實驗室前期研究結(jié)果也顯示：當(dāng)乳腺癌細胞暴露于化療藥物紫杉醇(paclitaxel, PTX)時，LINE-1表達水平的改變與其啟動子甲基化水平變化并不存在顯著相關(guān)性，這一結(jié)果引發(fā)了我們后續(xù)對LINE-1基因內(nèi)部甲基化改變與LINE-1異常激活的關(guān)系的思考和探究。與處于LINE-1啟動子區(qū)域的、密集存在并且形成CpG島的CpG二核苷相比，LINE-1基因內(nèi)部的CpG二核苷處于散在分布狀態(tài)。但是在位于LINE-1轉(zhuǎn)錄起始位點之后，Orf-1開放閱讀框內(nèi)大約500 bp長度的序列上，卻發(fā)現(xiàn)了相對于LINE-1基因其他區(qū)域更密集的CpG二核苷。因此，本研究旨在探索在化療藥物PTX作用下乳腺癌細胞中的DNMT3a能否通過提升LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平促進LINE-1的表達，進而提高乳腺癌細胞對化療藥物的耐受性。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌ZR-75-1細胞系、MCF-7細胞系、MDA-MB-468細胞系、MDA-MB-453細胞系、MDA-MB-231細胞系均購于美國ATCC公司。

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231培養(yǎng)于含有10%小牛血清(NCBS)、200 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的L15培養(yǎng)液中。人乳腺癌細胞系MDA-MB- 453、ZR-75-1和MDA-MB-468均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)、200 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的L15培養(yǎng)液中。人乳腺癌細胞系MCF-7培養(yǎng)與含有10%胎牛血清(FBS)、0.01 mg/mL胰島素、200 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液中。上訴細胞均培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中。所有實驗均使用處于對數(shù)生長期的細胞。

1.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染

人乳腺癌細胞系以合適的密度(轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒時細胞密度應(yīng)為70%~90%，而轉(zhuǎn)染si-RNA時細胞密度應(yīng)為30%~50%)接種于相應(yīng)的孔板中。接種16 h后，按使用說明書將適量的Lipofectamine 3000(Thermo Fisher，美國)均勻稀釋于50倍體積的L15培養(yǎng)液中，之后將對應(yīng)的DNMT3a過表達質(zhì)粒或si-RNA (質(zhì)粒和Lipo的質(zhì)量體積比為2∶1，而si-RNA和Lipo的體積比也為2∶1)分別均勻稀釋于50倍體積的L15培養(yǎng)液中(如果稀釋的是質(zhì)粒，則需要加入和Lipo相同體積的P3000，而如果稀釋的是si-RNA則不用添加P3000)，室溫靜置5 min。將稀釋后的質(zhì)粒或si-RNA和稀釋后的Lipofecta-mine 3000混勻，室溫孵育5 min。吸棄孔板中的原培養(yǎng)液，分別將合適體積的L15培養(yǎng)液加入每個培養(yǎng)皿。最后將孵育好的混合液分別加入對應(yīng)的培養(yǎng)皿中，輕晃混勻。將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4~6 h，之后更換細胞對應(yīng)的完全培養(yǎng)液正常培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h、36 h、48 h后收樣。

1.3 總RNA提取和Real-time PCR

收集約1×106個細胞，使用Trizol法(Invitrogen，美國)提取細胞全RNA，采用微量紫外分光光度計測定RNA濃度以及純度(260/280在1.8~2.0之間為宜)，500 ng RNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模版，使用SYBR Green I Master Mix (TaKaRa, 日本)在Real-time PCR儀器上檢測LINE-1 Orf-1和Orf-2 mRNA的相對表達量。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s ；35個循環(huán)。采用2–ΔΔCt進行相對定量分析。所用引物序列見表1。

1.4 Western blot分析

RIPA裂解法提取收集細胞總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白濃度。Western blot 法檢測乳腺癌細胞系中DNMT3a蛋白表達量。SDS-PAGE進行蛋白分離，蛋白上樣量為30 μg/孔，恒壓電流，堆積膠80 V，分離膠120 V。濕轉(zhuǎn)法進行蛋白轉(zhuǎn)膜，冰浴中以100V恒壓電轉(zhuǎn)60 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。按照體積比1∶2000比例加入TBST稀釋的DNMT3a抗體，4℃輕搖過夜。次日取出聚偏氟乙烯膜，TBST清洗3次，每次15 min。按照體積比1∶5000比例加入TBST稀釋的二抗，室溫輕搖2 h。取出二抗孵育的聚偏氟乙烯膜，TBST清洗3次，每次15 min。辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光法顯色。最后使用Image J軟件對曝光所得的蛋白條帶進行灰度分析。

1.5 甲基化特異性PCR (methylation specific PCR, MSP)

收集約1×106個細胞，使用基因組DNA提取試劑盒(Axygen，美國)提取細胞基因組DNA，采用微量紫外分光光度計測定DNA濃度以及純度。500 ng DNA使用重亞硫酸鹽修飾試劑盒(ZYMO，美國)進行修飾。以修飾后的DNA作為模版，使用SYBR Primix Ex Taq II (TaKaRa，日本)在Real-time PCR儀器上檢測LINE-1啟動子區(qū)域和基因內(nèi)部的甲基化修飾水平。LINE-1啟動子區(qū)段對應(yīng)的引物為LINE1- Promoter-MSP，而LINE-1基因內(nèi)部兩個區(qū)段S1和S2分別對應(yīng)的引物為LINE1-GB1-MSP和LINE1- GB2-MSP。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s；40個循環(huán)。采用2–ΔΔCt進行相對定量分析。所用引物序列見表2。

1.6 染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunop-recipitation, ChIP)

收集約1×107個細胞，使用ChIP試劑盒(Magna，美國)提取碎片化的基因組DNA片段，并將基因組DNA片段分裝為3份。第一份基因組DNA片段和20 μL磁珠、3 μg DNMT3a抗體(Santa-Cruz，sc-20703，美國)混勻孵育過夜，第二份基因組DNA片段和20 μL磁珠、3 μL無免疫性IgG抗體混勻孵育過夜，第三份基因組DNA作為Input。孵育過后，磁珠將按照操作手冊進行清洗并解交聯(lián)得到DNA片段。使用解交聯(lián)得到的DNA片段作為模版，在Real-time PCR儀器上檢測LINE-1和DNMT3a是否存在相互作用，并且確定DNMT3a在LINE-1上的具體結(jié)合位置。引物L(fēng)INE-1-SP對應(yīng)的片段為LINE-1啟動子中的片段SP，而引物L(fēng)INE-1-SGB1所對應(yīng)的片段為SGB1，引物L(fēng)INE-1-SGB2所對應(yīng)的片段為SGB2，以此類推。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s ；35個循環(huán)。以Input的Ct值作為內(nèi)參，采用2–ΔΔCt進行相對定量分析。所用引物序列見表3。

表2 甲基化特異性PCR所用引物

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以3次實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(mean± SEM)表示。組間比較用檢驗，<0.05時，為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(用*表示)，<0.01時為差異顯著(用**表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PTX處理促進MDA-MB-231乳腺癌細胞系中DNMT3a蛋白和LINE-1 mRNA的表達并提升LINE-1基因內(nèi)部區(qū)域甲基化水平

利用100 nmol/LPTX處理MDA-MB-231乳腺癌細胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)LINE-1的mRNA表達水平顯著升高(圖1A)。為探究該現(xiàn)象與LINE-1啟動子去甲基化是否存在相關(guān)性，本研究使用MSP檢測LINE-1啟動子甲基化水平，結(jié)果顯示PTX處理前后LINE-1啟動子甲基化水平并未發(fā)生顯著性變化(>0.05) (圖1B)。

表3 染色質(zhì)免疫共沉淀所用引物

由于LINE-1轉(zhuǎn)錄起始位點后，Orf-1開放閱讀框中大約500 bp長度的區(qū)域內(nèi)存在相對密集的CpG二核苷，為檢測該區(qū)段的甲基化水平，設(shè)計了兩對MSP引物(對應(yīng)片段為S1和S2)(圖1C)，通過甲基化特異性PCR擴增這兩個片段。

MSP實驗結(jié)果顯示：與未處理的MDA-MB-231細胞相比，經(jīng)過PTX處理的細胞中片段S1和片段S2對應(yīng)的LINE-1基因內(nèi)部區(qū)段的甲基化水平顯著上升(圖1D)，并且還伴隨著細胞中DNMT3a蛋白表達上升(圖1E)。

以上結(jié)果提示PTX處理引起的乳腺癌細胞中LINE-1mRNA表達水平的上升可能是通過提升LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平而非降低其啟動子甲基化水平完成的，并且DNMT3a可能參與了該調(diào)節(jié)過程。

1.1 對象 選取2013年3—6月收治于我院經(jīng)鼻腔插管的口腔科患者90例，年齡18～65歲，男52例，女38例，按照頭帶固定鼻插管方法和傳統(tǒng)固定方法隨機分為觀察組和對照組各45例。其中，正頜手術(shù)30例，頸清手術(shù)32例，上頜骨擴大切除術(shù)28例。兩組患者年齡、性別、病種和置管時間等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 PTX誘導(dǎo)乳腺癌細胞中DNMT3a的表達并促進其與LINE-1基因內(nèi)部區(qū)域的結(jié)合

為了證實上述推論，通過ChIP技術(shù)檢測MDA- MB-231細胞中DNMT3a和LINE-1是否存在直接相互作用。實驗選取LINE-1啟動子區(qū)域和基因內(nèi)部長度大約為800 bp的富含散在CpG二核苷的區(qū)域上分別設(shè)計引物，以探索DNMT3a在LINE-1的具體結(jié)合位置(圖2A)。

結(jié)果顯示：在MDA-MB-231乳腺癌細胞中DNMT3a未與LINE-1啟動子區(qū)域結(jié)合，而是結(jié)合在LINE-1基因內(nèi)部(圖2B)，并且檢測到的DNMT3a結(jié)合區(qū)域與檢測LINE-1基因內(nèi)部甲基化時引物L(fēng)INE-1-GB1-MSP和LINE-1-GB2-MSP所對應(yīng)的區(qū)域(片段S1和S2)相重合。使用100 nmol/L PTX處理細胞后，DNMT3a和LINE-1基因內(nèi)部的結(jié)合增加(圖2C)。

為進一步探究DNMT3a是否介導(dǎo)了PTX引起的LINE-1 mRNA表達水平上調(diào)，經(jīng)PTX處理MDA- MB-231細胞后使用DNMT3asi-RNA干擾DNMT3a蛋白表達，并檢測LINE-1的轉(zhuǎn)錄水平和其甲基化水平。結(jié)果表明：干擾DNMT3a蛋白的表達(圖3A)可以部分逆轉(zhuǎn)因PTX引起的LINE-1 mRNA上調(diào)(圖3B)和基因內(nèi)部甲基化水平的升高(圖3C)，且該過程中LINE-1啟動子甲基化水平始終未發(fā)生顯著性變化(>0.05) (圖3C)。

圖1 PTX處理上調(diào)乳腺癌細胞中DNMT3a蛋白和LINE-1 mRNA表達并提升LINE-1基因內(nèi)部而非啟動子區(qū)的甲基化水平

A：Real-time PCR檢測PTX處理后MDA-MB-231乳腺癌細胞中LINE-1的mRNA水平；B：MSP檢測PTX處理后MDA-MB-231細胞中LINE-1啟動子甲基化水平；C：利用甲基化特異性PCR擴增的LINE-1基因內(nèi)部相應(yīng)片段(S1和S2)位置示意圖，片段位于LINE-1 Orf-1開放閱讀框架中長度約500 bp富含CpG的區(qū)域；D：MSP檢測PTX處理后MDA-MB-231細胞中LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平；E: Western blot檢測PTX處理后MDA-MB-231細胞中DNMT3a蛋白的表達及相應(yīng)的灰度分析結(jié)果。*:<0.05表示有差異; **:<0.01表示差異顯著。

以上結(jié)果表明：MDA-MB-231細胞在PTX刺激作用下能夠通過提高DNMT3a蛋白的表達，使更多的DNMT3a蛋白和LINE-1基因區(qū)域結(jié)合，提升LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平。

2.3 DNMT3a通過提升LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平正向調(diào)控LINE-1的轉(zhuǎn)錄

為進一步探索乳腺癌細胞中DNMT3a與LINE-1 mRNA水平上調(diào)的關(guān)系，本研究檢測了5種乳腺癌細胞系中DNMT3a蛋白的表達水平和LINE-1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)二者的表達呈現(xiàn)正相關(guān)性(圖4，A和B)。

隨后選擇在MDA-MB-231和MDA-MB-453兩種乳腺癌細胞系中過表達DNMT3a蛋白，以探索LINE-1 mRNA表達水平否發(fā)生相應(yīng)的上升。結(jié)果顯示：在MDA-MB-231和MDA-MB-453兩種乳腺癌細胞中過表達DNMT3a蛋白后(圖5A)，細胞中LINE-1 mRNA表達上調(diào)的同時(圖5B)，也促進了細胞內(nèi)DNMT3a和LINE-1基因內(nèi)部的結(jié)合(圖5C)。與此同時兩種乳腺癌細胞系中LINE-1啟動子甲基化水平并未發(fā)生顯著性變化(>0.05)，但是LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平卻發(fā)生了顯著提升(圖5D)。

圖2 DNMT3a結(jié)合在LINE-1基因內(nèi)部

A：LINE-1啟動子區(qū)域和基因內(nèi)部ChIP-PCR檢測區(qū)段位置示意圖；B：ChIP檢測在MDA-MB-231乳腺癌細胞中DNMT3a蛋白與LINE-1啟動子區(qū)和基因內(nèi)部區(qū)域的結(jié)合情況；C：ChIP檢測MDA-MB-231細胞經(jīng)PTX處理后DNMT3a在LINE-1基因不同區(qū)段的結(jié)合情況。*:<0.05表示有差異;**:<0.01表示差異顯著。

3 討論

長散在重復(fù)序列LINE-1的異常激活是影響細胞基因組不穩(wěn)定性、增加細胞耐藥性的因素之一。LINE-1在正常細胞中不表達而在多種腫瘤細胞(包括乳腺癌細胞)中異常激活[7]。有研究表明乳腺癌細胞中異常激活的LINE-1能夠通過自身靶點引導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄過程插入多種抑癌基因的基因區(qū)域[24]，從而抑制這些基因的表達或直接破壞基因的完整性；或通過不同基因之間的同源重組概率、引起大片段的基因重復(fù)或缺失等途徑使腫瘤細胞基因組不穩(wěn)定性增加[14~17]。目前，人們對于乳腺癌耐藥性形成的機制已經(jīng)有了一定的研究，包括對藥物造成的DNA損傷的精準(zhǔn)修復(fù)[33]、全基因組甲基化水平紊亂推動耐藥基因的異常表達[34]等。而基因組不穩(wěn)定作為腫瘤的特征之一，也能通過增進腫瘤異質(zhì)性、促進腫瘤的克隆演變[19~21]等方式促進腫瘤產(chǎn)生原發(fā)性耐藥，或獲得性耐藥表型。因此研究LINE-1在乳腺癌如何被異常激活，對于了解乳腺癌細胞基因組不穩(wěn)定性形成以及耐藥性形成的原因具有重要的幫助作用。

多種腫瘤細胞中LINE-1的轉(zhuǎn)錄均受其啟動子甲基化水平的負(fù)調(diào)控，但是本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)MDA- MB-231乳腺癌細胞系在面對100 nmol/L PTX刺激時，LINE-1可以在維持啟動子甲基化水平不變的情況下提高自身轉(zhuǎn)錄水平，與此同時LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平顯著提升。與基因沉默相關(guān)聯(lián)的啟動子甲基化相比，基因內(nèi)部甲基化常與多種基因的高表達相關(guān)聯(lián)[35,36]。許多研究已經(jīng)證明基因內(nèi)部甲基化在多種生理學(xué)和疾病發(fā)生發(fā)展進程中通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控、增強子活化、基因內(nèi)部啟動子沉默、反義鏈轉(zhuǎn)錄沉默等調(diào)控相應(yīng)基因的表達和功能發(fā)揮[35~37]。因此這些結(jié)果提示在乳腺癌細胞面對PTX刺激時，細胞中LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平的升高可能導(dǎo)致LINE-1轉(zhuǎn)錄水平的提升。

圖3 抑制DNMT3a蛋白的表達能部分逆轉(zhuǎn)因PTX處理引起的LINE-1 mRNA表達水平的上升

A：Western blot檢測MDA-MB-231乳腺癌細胞中si-DNMT3a對DNMT3a蛋白表達的抑制情況及相應(yīng)的灰度分析結(jié)果；B：Real-time PCR檢測抑制DNMT3a表達對PTX處理后LINE-1 mRNA表達情況的影響；C：MSP檢測抑制DNMT3a表達對PTX處理后LINE-1啟動子區(qū)和基因內(nèi)部區(qū)段甲基化水平的影響。*：<0.05表示有差異；**：<0.01表示差異顯著。

在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員中，目前認(rèn)為具有“從頭合成甲基化”活性的DNMT3a和DNMT3b能夠參與到基因內(nèi)部甲基化的修飾調(diào)控過程中[30,31]。本研究結(jié)果顯示：MDA-MB-231乳腺癌細胞中DNMT3a不僅能夠和LINE-1基因內(nèi)部區(qū)域發(fā)生直接的相互作用，并且在細胞面對PTX刺激時，細胞也能通過上調(diào)DNMT3a蛋白的表達從而提升LINE-1基因內(nèi)部的甲基化水平，最終顯著上調(diào)LINE-1的轉(zhuǎn)錄。且在兩種DNMT3a和LINE-1均低表達的乳腺癌細胞(MDA-MB-231和MDA-MB-453)中直接過表達DNMT3a蛋白后發(fā)現(xiàn)，DNMT3a蛋白能夠在不改變LINE-1在其啟動子甲基化水平的同時，通過直接提升LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平從而正向調(diào)控LINE-1的轉(zhuǎn)錄。

圖4 各個乳腺癌細胞系中DNMT3a蛋白表達和LINE-1 mRNA水平

A：Western blot檢測5種乳腺癌細胞系中DNMT3a蛋白的表達水平；B：Real-time PCR檢測5種乳腺癌細胞系中LINE-1 mRNA的表達水平。*：<0.05表示有差異；**：<0.01表示差異顯著。

但是基因內(nèi)部甲基化上調(diào)LINE-1轉(zhuǎn)錄的機制還有待進一步的研究。有研究表明基因內(nèi)部甲基化可能通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄單位(transcribed unit)的有序結(jié)構(gòu)，使得RNA聚合酶能夠更加順利的在轉(zhuǎn)錄單位中延伸，提升轉(zhuǎn)錄單位獲得參與轉(zhuǎn)錄的幾率，從而正向調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[36]。此外，很多研究結(jié)果顯示DNA甲基化的改變能夠影響相應(yīng)區(qū)域內(nèi)組蛋白甲基化的形成，并且反之亦然[38~40]。某些處于激活狀態(tài)的基因，其啟動子一般不存在H3K36me3而基因內(nèi)部區(qū)域常帶有高水平的H3K36me3。并且這樣的基因啟動子區(qū)一般不存在甲基化或處于低甲基化水平，而基因內(nèi)部區(qū)域常常表現(xiàn)為高甲基化[41,42]。這表明H3K36me3和基因內(nèi)部甲基化的出現(xiàn)呈現(xiàn)一致性。并且因為DNMT3a能夠作用于基因內(nèi)部甲基化的同時，其蛋白中的PWWP結(jié)構(gòu)域與H3K36me3之間又存在直接相互作用[43]，而H3K36me3作為轉(zhuǎn)錄激活性的組蛋白標(biāo)志物，能夠促進基因的轉(zhuǎn)錄。所以DNMT3a可能通過促進基因內(nèi)部甲基化的形成從而招募轉(zhuǎn)錄激活性的H3K36me3組蛋白從而促進基因的轉(zhuǎn)錄[44]。而這些仍需要進一步的探索和研究。

在乳腺癌細胞中DNMT3a蛋白的表達可以作為LINE-1異常激活的因素之一，并且LINE-1的轉(zhuǎn)錄在受其啟動子甲基化水平負(fù)調(diào)控的同時，也會受到其基因內(nèi)部甲基化水平的正向調(diào)控。雖然目前的研究對于DNMT3a和乳腺癌耐藥性的相關(guān)研究還比較少，但本研究結(jié)果顯示，化療藥物作用后DNMT3a在乳腺癌組織中的表達上調(diào)，且正向調(diào)控LINE-1的轉(zhuǎn)錄，促進乳腺癌耐藥表型的形成。這提示在乳腺癌的化療過程中，在以PTX為主的化療方案中同時抑制DNMT3a的表達可能會取得更好的化療效果。但這一推測仍需要進一步的研究證實。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞系中DNMT3a能夠直接結(jié)合到LINE-1基因內(nèi)部，通過提升LINE-1基因內(nèi)部的散在分布的CpG二核苷的甲基化水平，從而正向調(diào)控LINE-1 mRNA的表達水平。并且在細胞面對化療藥物刺激時，DNMT3a也能通過相同的機制提升LINE-1 mRNA的表達水平。本研究結(jié)果為探索LINE-1在乳腺癌化療耐藥過程中異常激活的原因提供了一定的新思路。

圖5 DNMT3a在乳腺癌細胞系中通過提升LINE-1基因內(nèi)部甲基化水平從而正向調(diào)控LINE-1的轉(zhuǎn)錄

A：Western blot檢測MDA-MB-231和MDA-MB-453乳腺癌細胞中轉(zhuǎn)染DNMT3a過表達質(zhì)粒后DNMT3a蛋白的表達情況；B：Real-time PCR檢測在MDA-MB-231和MDA-MB-453乳腺癌細胞中過表達DNMT3a蛋白后LINE-1 mRNA的表達水平；C：ChIP檢測過表達DNMT3a對其與LINE-1基因啟動子區(qū)和基因內(nèi)部區(qū)域結(jié)合情況的影響；D：MSP檢測過表達DNMT3a對LINE-1啟動子和基因內(nèi)部甲基化水平的影響。*：<0.05表示有差異；**：<0.01表示差異顯著。

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DNMT3a mediates paclitaxel-induced abnormal expression of LINE-1 by increasing the intragenic methylation

Xinyuan Wang1,2, Yu Zhang1,2, Nan Yang1, He Cheng1,2, Yujie Sun1,2

The activation of long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) leads to genomic instability, which promotes carcinogenesis and drug resistant. Therefore, exploring the mechanism underlying LINE-1 abnormal activation has the theoretical and clinical significance. DNA methylation is an important way to regulate gene expression. DNMT3a, one member of the DNA methyltransferase family, not only inhibits gene expression by inducing promoter hypermethylation, but also activates gene expression by increasing the intragenic DNA methylation. Our previous studies found that the expression of LINE-1 did not increase significantly in the promoter methylation in breast cancer cells treated with paclitaxel (PTX), a first-line chemotherapeutic drug for breast cancer. Here we explored whether DMNMT3a could directly mediate the drug-induced activation of LINE-1 in breast cancer cells through increasing the LINE-1 intragenic methylation. Our ChIP experiments and methyl analysis showed that treatment of breast cancer cells with PTX not only induced DNMT3a expression, but also promoted the binding of DNMT3a to the inner region of thegene to increase its methylation, resulting in upregulation of LINE-1 expression. Using expression vectors or RNA interference to alter the DNMT3a expression levels in the cells significantly changed the intragenic methylation degree and LINE-1 expression. Moreover, down-regulation of DNMT3a expression effectively inhibited the expression of LINE-1. These results indicate that DNMT3a-mediated intragenic methylation plays an important role in drug-induced abnormal activation of LINE-1, which provides a new idea for understanding the mechanism of abnormal activation of Line-1 induced by chemotherapy drug stress in breast cancer cells.

breast cancer; abnormal activation of LINE-1; intragenic DNA methylation; DNMT3a

2019-10-29;

2019-12-27

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81172091)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81172091)]

王昕源，碩士，專業(yè)方向：LINE-1的異常激活機制。E-mail: wangxinyuan2727@gmail.com

孫玉潔，博士，教授，研究方向：增強子生物學(xué)功能、腫瘤耐藥形成機制。E-mail: yujiesun@njmu.edu.cn

程禾，博士，講師，研究方向：乳腺癌耐藥形成機制。E-mail: chenghe@njmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-258

2020/1/3 13:48:20

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200103.0923.002.html

(責(zé)任編委: 宋旭)