趙麗麗，孫小富，黃莉娟，王雷挺，趙 鑫

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

輻射誘變育種是植物育種的重要手段之一，是采用一定劑量的射線，照射植物的種子、莖段、花粉、愈傷組織或其他器官，誘發(fā)植物產(chǎn)生基因突變和染色體畸變，并從突變?nèi)后w中鑒定、篩選有利突變，培育新品種的過程[1]。輻射誘變育種不僅可以大大提高植物基因的突變頻率，在短時(shí)間內(nèi)獲得有價(jià)值的突變體，而且多數(shù)突變屬于小量突變，在改良品種時(shí)保證了原有品種的優(yōu)質(zhì)性狀，常被用于改良優(yōu)良品種的單一性狀[2]。輻射誘變主要的輻射源有γ、X、β射線和中子等電離輻射源，離子束、激光和紫外線等非電離輻射源。各種輻射源的性質(zhì)、波長(zhǎng)不同，引起的變異效果不同，所以輻射應(yīng)用范圍也不同[1]。其中60Co-γ射線的穿透性強(qiáng)，波長(zhǎng)短，誘變效果穩(wěn)定，誘變當(dāng)代效果直觀，M2代即可出現(xiàn)大量明顯的突變性狀，突變體易于篩選，所以60Co-γ射線成為高等植物誘變育種中應(yīng)用最多的輻射源[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前輻射誘變育成的突變品種中，70%以上來自γ輻射或用γ輻射誘發(fā)的突變體培育而成[4]。

誘變育種應(yīng)用廣泛，育種效果顯著。誘變育種過程包括誘變?cè)催x擇、最佳輻射劑量確定、突變體篩選和鑒定等，每個(gè)過程對(duì)誘變育種的成敗起到重要作用。本文對(duì)誘變育種關(guān)鍵環(huán)節(jié)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，擬為各種植物誘變育種提供技術(shù)支持。

1 輻射誘變育種技術(shù)的發(fā)展情況

1896年，法國(guó)科學(xué)家BECQUEREL H A發(fā)現(xiàn)了天然放射性元素鈾，揭開了原子能時(shí)代的序幕[5]。之后，越來越多的研究者開始關(guān)注核輻射的生物學(xué)效應(yīng)，生物學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域開始了核技術(shù)的應(yīng)用研究。1927年，昆蟲學(xué)家MULLER H J發(fā)現(xiàn)X射線能誘發(fā)果蠅產(chǎn)生多種類型的遺傳性變異[6]。1928年，植物育種學(xué)家STADLER L J利用X射線研究了輻射對(duì)小麥和玉米等農(nóng)作物產(chǎn)生的誘變效應(yīng)，開啟了人們對(duì)植物誘變育種技術(shù)的研究[7]。1934年，印度尼西亞科學(xué)家D. Tollenear等利用X射線育成了世界上第一例輻射誘變煙草突變新品種“Chlorina F1”[1]。到50至60年代，隨著遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，輻射誘變的規(guī)律逐步被了解，促使誘變育種方法進(jìn)一步成熟，并獲得了一些突出性成果[8]。特別是1969年《突變育種手冊(cè)》的出版，使得輻射誘變育種技術(shù)得到迅速的發(fā)展[9]。進(jìn)入70年代后，離體培養(yǎng)技術(shù)有效地解決了輻射誘變育種中嵌合體的形成[10]。到80年代，輻射誘變育種開始與化學(xué)誘變、雜交育種、倍性育種及現(xiàn)代生物技術(shù)等方法相互交叉、結(jié)合，發(fā)展成為綜合性育種技術(shù)。到20世紀(jì)末，全世界已有50多個(gè)國(guó)家運(yùn)用輻射誘變育種技術(shù)在150多個(gè)植物種類上育成了近1 800個(gè)品種[11]。進(jìn)入21世紀(jì)，輻射誘變育種技術(shù)不僅為科學(xué)家提供了創(chuàng)造和篩選突變體的廣闊平臺(tái)，豐富了物種的遺傳變異范疇，也為遺傳學(xué)研究和植物育種家提供了嶄新的手段和領(lǐng)域[12]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(food and agriculture organization of the united nations/international atomic energy agency,FAO/IAEA)突變品種數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)：截至2009年9月，世界上60多個(gè)國(guó)家在170多種植物上利用誘發(fā)突變技術(shù)育成和推廣了3 088個(gè)突變品種；截至2013年9月底，在214個(gè)植物種類上育成3 218個(gè)突變品種。其中，中國(guó)在45種植物上育成了802個(gè)突變品種，超過目前國(guó)際誘變育成品種數(shù)據(jù)庫中總數(shù)的1/4，位居世界第一。特別是棉花品種“魯棉一號(hào)”、水稻品種“原豐早”、大豆品種“鐵豐18號(hào)”等多個(gè)誘變品種獲得國(guó)家發(fā)明一等獎(jiǎng)。這些突變品種累計(jì)種植面積己達(dá)到數(shù)億公頃，創(chuàng)造了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益[1]。

2 輻射劑量選擇及突變類型

2.1 輻射敏感性和劑量選擇

輻射誘變育種的關(guān)鍵是采取適當(dāng)?shù)膭┝?，既獲得較高的變異率和較寬的變異譜，又不致過分損傷植株。適宜的輻射劑量與材料的輻射敏感性有關(guān)，需考慮到植物種類、品種、器官、發(fā)育階段、生理狀況及外界因素，是一個(gè)比較復(fù)雜的問題[13]。輻射劑量過低，起不到誘變作用；輻射劑量過高，變異頻率雖然增加，但植物的死亡率也會(huì)增加，影響選擇機(jī)率。因此，確定植物的適宜輻射劑量被稱為誘變育種的第一步工作[14]。目前，國(guó)內(nèi)外一般采用半致死劑量和臨界劑量確定輻射誘變適宜劑量，采用的指標(biāo)包括種子發(fā)芽率、植株成活率、出苗率、植株不育程度和生長(zhǎng)抑制程度等。胡瑞陽、耿興敏和李鳳濤等分別針對(duì)杉木(Cunninghamialanceolata)、桂花(Osmanthusfragrans)和白刺花(Sophoradavidii)等研究材料，分析了60Co-γ射線對(duì)不同植物種子萌發(fā)的影響，提出了各種植物種子適宜輻射劑量，有效突變劑量的選擇為后期突變性狀的產(chǎn)生和突變體的選擇提供了保障[14-16]。

2.2 輻射誘變后代主要突變類型

輻射誘變已經(jīng)在農(nóng)作物、花卉、果樹、牧草等植物中得到廣泛應(yīng)用，獲得了大量有益突變體，為植物育種及基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。李臻等經(jīng)多年種植及篩選，從圣稻15誘變突變體庫中獲得93份在葉色、葉形、株高、抽穗期、穗型、粒型等方面出現(xiàn)明顯變異的突變體[17]。孫孟園等從輻射誘變獲得的大豆突變體中發(fā)現(xiàn)了葉片、株型、生育期、粒形、籽粒蛋白質(zhì)及油脂等性狀的突變體[18]。彭振英等對(duì)花生干種子進(jìn)行60Co-γ輻射誘變處理，獲得了高油突變體和高蛋白突變體[19]。宋華偉等利用60Co-γ輻射誘變結(jié)縷草，從誘變材料中選育獲得了3個(gè)抗旱性優(yōu)于其親本的新品系[20]。李新鵬等通過60Co-γ輻射誘變京科糯2000，獲得了一個(gè)糯玉米突變體庫，在該突變體庫中鑒定出71個(gè)不同類型的雄性完全不育的突變體[21]。綜上，輻射誘變產(chǎn)生的突變類型主要包括株高突變、產(chǎn)量突變、品質(zhì)突變、抗性突變和育性突變等方面[17]。

3 輻射誘變突變體篩選和鑒定

突變體是植物育種、挖掘基因和研究功能基因組學(xué)的重要材料。而各類突變體后代，需要經(jīng)過詳細(xì)而大量的鑒定，才能明確其突變的位點(diǎn)和特點(diǎn)，工作量大，過程繁雜，耗時(shí)耗力。因此，突變體的鑒定與選擇在植物誘變育種中占有舉足輕重的位置，特別是突變體的早期鑒定分離與篩選[22]。如何以有效的手段鑒定和選擇優(yōu)良突變體卻是誘變育種的一個(gè)難題，目前常用的方法有形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生化和分子標(biāo)記鑒定等。

3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定是將突變體和原品種進(jìn)行比對(duì)，觀察與記錄植物的外部形態(tài)特征，要求必須有能遺傳的、相對(duì)于野生型有顯著差異的外觀性狀，一般也包括逆境篩選和化驗(yàn)分析篩選。謝向譽(yù)等利用60Co-γ輻射木薯后，通過形態(tài)學(xué)鑒定獲得了穩(wěn)定的裂葉葉形突變體、葉柄顏色突變體、株高突變體、莖粗突變體等[23]。趙麗麗等發(fā)現(xiàn)白刺花輻射誘變后代在植株高度、冠幅直徑、莖粗、葉片大小、分枝位點(diǎn)高度等方面發(fā)生了顯著的變異[12]。表型鑒定的方法簡(jiǎn)單、直觀、易行，不需要特殊的硬件設(shè)備，能直接反映突變體的表型性狀變化，可以對(duì)變異的性狀做出直接的判斷。但是因?yàn)樵摲椒ㄈ菀资艿缴L(zhǎng)環(huán)境和人為因素的影響，所以多態(tài)性差、準(zhǔn)確性不高，在突變體鑒別方面的作用是很有限的。因此，在篩選突變體的工作中，一般都會(huì)與其他鑒定方法混合使用。

3.2 細(xì)胞學(xué)鑒定

細(xì)胞學(xué)鑒定是利用普通顯微鏡、電鏡或熒光原位雜交技術(shù)在細(xì)胞水平對(duì)誘變后代的細(xì)胞變異進(jìn)行鑒定，不僅可以鑒定輻射誘變后代的細(xì)胞及細(xì)胞器的形態(tài)變化，還可以鑒定染色體易位、缺失等變異[1]。在小麥矮化突變體及水稻卷葉突變體鑒定中，借助石蠟切片技術(shù)，從細(xì)胞學(xué)水平鑒定出矮化突變體多因莖稈細(xì)胞長(zhǎng)度減少和細(xì)胞變小引起；卷葉突變體多因泡狀細(xì)胞、厚壁細(xì)胞及薄壁細(xì)胞的變化，以及維管束中韌皮部變化和葉肉細(xì)胞的變化引起[24-25]。水稻雄性不育突變體是因小孢子畸形、萎縮不能形成正常的花粉粒[26]。染色體是遺傳物質(zhì)的載體，染色體變異必然會(huì)導(dǎo)致遺傳變異的發(fā)生。γ射線輻照處理的黃花苜蓿細(xì)胞出現(xiàn)了多倍體突變，多倍體出現(xiàn)的幾率為39.98%～41.71%[27]。γ射線輻照后，籽粒莧細(xì)胞中出現(xiàn)了染色體微核畸變、染色體橋、落后染色體、游離染色體、粘連染色體等[28]。細(xì)胞學(xué)鑒定雖然克服了形態(tài)學(xué)標(biāo)記易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)，但存在耗時(shí)費(fèi)力、非染色體變異性狀難以檢測(cè)、基因的精細(xì)定位困難等缺點(diǎn)，所以近年來細(xì)胞學(xué)鑒定未得到廣泛的應(yīng)用。

3.3 生化鑒定

生化鑒定是基于蛋白質(zhì)多態(tài)性發(fā)展起來的一種標(biāo)記方法，包括同工酶和貯藏蛋白(谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白及清蛋白等)電泳鑒定。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，借助聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得蛋白質(zhì)譜帶，能從一定程度上反映植物的遺傳變異。樊光輝利用Co輻射誘變枸杞“寧杞1號(hào)”的種子，結(jié)合單株選優(yōu)和同工酶譜分析，成功選育出輻射誘變優(yōu)良新品系[29]。生化鑒定方法較為簡(jiǎn)單，易于操作，經(jīng)濟(jì)方便，受到廣泛應(yīng)用。但其也存在標(biāo)記數(shù)量有限，穩(wěn)定性差，不利于貯存和運(yùn)輸?shù)葐栴}。特別是同工酶檢測(cè)中，因?yàn)槊覆皇腔虻闹苯赢a(chǎn)物，中間存在一個(gè)表達(dá)、調(diào)節(jié)、修飾的問題，所以其檢測(cè)的可靠性受到一定程度上的影響。另外，同工酶具有發(fā)育、組織和物種的特異性，易受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境因素影響。這些缺點(diǎn)一定程度上制約了生化鑒定技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。

3.4 分子標(biāo)記鑒定

分子標(biāo)記鑒定是繼形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生化鑒定突變體之后應(yīng)用廣泛的一種較為理想和新的遺傳標(biāo)記形式。分子標(biāo)記的研究開始于20世紀(jì)80年代，經(jīng)過多年的發(fā)展，分子標(biāo)記大致可以分為4類：(1)以分子雜交為基礎(chǔ)，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。(2)以限制性酶切和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)，如酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)。(3)基于PCR技術(shù)的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)分子標(biāo)記，包括隨機(jī)引物的PCR標(biāo)記，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(random amplified polymorphism DNA，RAPD)；特異引物的PCR標(biāo)記，如簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)、序列特異性擴(kuò)增區(qū)(sequence-characterized amplified region，SCAR)等。(4)基于DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)，如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。該技術(shù)在突變體鑒定中得到廣泛應(yīng)用。如RFLP、AFLP、SSR、SNP等分別在水稻、唐菖蒲、狼尾草、煙草等植物的突變體鑒定中得到成功的應(yīng)用[30-33]。分子標(biāo)記鑒定技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：突變位點(diǎn)直接以DNA的形式表現(xiàn)，在植物體的各個(gè)組織、各發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到，不受季節(jié)環(huán)境限制，結(jié)果可靠性強(qiáng)；檢測(cè)位點(diǎn)多、多態(tài)性高；而且許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供的遺傳信息較完整。但也存在一定的局限性，如其檢測(cè)到的突變位點(diǎn)可能沒有相應(yīng)的表型，或者找到多個(gè)突變位點(diǎn)后，不能確定到底哪個(gè)位點(diǎn)與缺失的功能相關(guān)，只能說明誘變材料從DNA水平上發(fā)生了變化以及突變發(fā)生的頻率[34]。

4 結(jié)語

隨著輻射育種研究的快速發(fā)展，誘變育種逐漸與雜交育種、組織培養(yǎng)、分子鑒定等密切結(jié)合，現(xiàn)已發(fā)展成為一門成熟的綜合性育種新技術(shù)，并在農(nóng)作物、蔬菜、果樹、觀賞植物和牧草育種中取得了很多可喜的成果。誘變育種中，突變體的早期鑒定和選擇至關(guān)重要，常用的形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、生化鑒定和分子標(biāo)記鑒定4種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，為取得很好的鑒定效果，一般根據(jù)植物特性、突變類型和試驗(yàn)條件等選擇多個(gè)鑒定方法進(jìn)行綜合鑒定。