謝慶娥，王夢(mèng)瑤，梁譚，劉雅靜

松果體素（melatonin）又稱(chēng)褪黑素，是美國(guó)耶魯大學(xué)Lerner教授于1958年從牛松果體提取物中分離純化出的一種能夠使青蛙皮膚褪色的物質(zhì)，其不僅可以通過(guò)與其高親和性跨膜受體及核內(nèi)受體結(jié)合發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)，也可以通過(guò)直接清除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）或激活抗氧化酶從而發(fā)揮獨(dú)特的抗氧化作用，從而在很多生理活動(dòng)和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]，主要包括改善睡眠[2]、調(diào)節(jié)生物鐘[3]、延緩衰老[4]、抗氧化[5]、抗炎和免疫調(diào)節(jié)[6]、改善記憶及抗腫瘤[7]等。

輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technique，ART）是目前治療不孕不育的主要有效手段。ART過(guò)程中，不論是體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）還是胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）均不能模擬真實(shí)的體內(nèi)生理?xiàng)l件，ROS可能來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外等各個(gè)環(huán)節(jié)。體外培養(yǎng)環(huán)境下，一種或多種因素均可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，加速卵母細(xì)胞老化，降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，繼而影響胚胎著床，從而影響ART的治療結(jié)局。近年來(lái)，由于松果體素獨(dú)特的抗氧化作用，具有的高親水性和高脂溶性使其容易通過(guò)生理屏障進(jìn)入各類(lèi)細(xì)胞，松果體素在ART中的應(yīng)用極大地引起了研究者的關(guān)注。

1 松果體素的合成與代謝

松果體素主要是由松果體腺細(xì)胞分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，化學(xué)名稱(chēng)為N-乙酰-5-甲氧色胺（N-acetyl-5-methoxytryptamine）。松果體素以色氨酸（tryptaphan，Trp）為合成原料，經(jīng)過(guò)羥化、脫羧、N-乙?；脱跫谆罱K形成松果體素。其具體過(guò)程如下：Trp 在色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）的作用下羥化為5-羥色氨酸（5-hydroxytryptophan）。5-羥色氨酸經(jīng)過(guò)芳香氨基酸脫羧酶的作用轉(zhuǎn)化為5-羥色胺（5-HT），后者在N-乙?；D(zhuǎn)移酶（serotonin N-acetyltransferase，NAT）的作用下經(jīng)過(guò)N-乙?；纬蒒-乙酰基-5-羥色胺（NAS），此過(guò)程是松果體素合成的關(guān)鍵步驟。最后在羥基吲哚甲基化轉(zhuǎn)移酶（hydroxyindole -O -methyltransferase，HIOMT，又 稱(chēng)Acetylserotonin Omethyltransferase，ASMT）的作用下通過(guò)氧甲基化將NAS轉(zhuǎn)化為松果體素。松果體素合成后并不在松果體中儲(chǔ)存，隨即被動(dòng)地進(jìn)入血液循環(huán)[1]。

松果體素的分解代謝主要在肝臟和腦組織中進(jìn)行，其中肝臟是松果體素的主要降解途徑。在肝細(xì)胞中，松果體素在微粒體羥化酶作用下生成6-羥松果體素（6-OH-melatonin），從而喪失生物活性[8]。松果體素在腦組織的代謝主要通過(guò)氧化作用，松果體素的吡咯核環(huán)打開(kāi)形成N-乙酰-5-甲氧-犬尿胺[9]。松果體素的代謝產(chǎn)物主要通過(guò)尿液排出。

2 松果體素的來(lái)源

有研究表明，除松果體外，其他組織和細(xì)胞也可以產(chǎn)生松果體素，包括視網(wǎng)膜、肝臟、小腦、氣道上皮、腎臟、腎上腺、甲狀腺、卵巢、胎盤(pán)、子宮內(nèi)膜、哈德氏腺、胃腸道和皮膚、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板，甚至膽汁和人類(lèi)卵泡液、精液中也存在高水平的松果體素[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的大鼠原代皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6以及小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3等均可合成和分泌松果體素[11]，并且載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）的基因型對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的松果體素的功能有不同的調(diào)節(jié)作用[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生殖系統(tǒng)的卵母細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞等均可合成松果體素[13]。線粒體作為卵母細(xì)胞提供能量的主要細(xì)胞器，也是卵母細(xì)胞成熟過(guò)程產(chǎn)生松果體素的主要場(chǎng)所[14-15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，松果體素在原始卵泡和閉鎖卵泡弱表達(dá)[10]，多囊卵巢綜合征患者的卵巢顆粒細(xì)胞和卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體也能分泌一定量的松果體素[16]。人類(lèi)下丘腦-垂體-性腺軸3個(gè)水平均可表達(dá)松果體素受體，表明松果體素可能在這些組織和細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。

3 松果體素的抗氧化作用

松果體素是一種非酶類(lèi)抗氧化物質(zhì)，具有高親水性和高脂溶性，很容易通過(guò)各種生理屏障進(jìn)入不同組織細(xì)胞中，并在線粒體和細(xì)胞核中富集。松果體素可以多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)地作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。松果體素可以通過(guò)兩種方式發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用，一種是通過(guò)其高親和性的跨膜受體和核內(nèi)受體對(duì)特定的細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用；另外，松果體素可以直接通過(guò)其抗氧化作用發(fā)揮保護(hù)作用。

松果體素及其經(jīng)過(guò)肝臟代謝形成的代謝產(chǎn)物6-羥松果體素均具有很高的抗氧化能力，松果體素所產(chǎn)生的抗氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)使其成為高效、獨(dú)特的抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn)，松果體素能夠激活細(xì)胞中的抗氧化酶，包括超氧化歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶等，抑制促氧化酶，保護(hù)細(xì)胞和線粒體免受ROS的侵害，從而抑制細(xì)胞凋亡[9,17]。松果體素還能通過(guò)細(xì)胞沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（silent information regulator 1，SIRT1）依賴(lài)性的機(jī)制抑制小鼠間質(zhì)細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激[18]。松果體素對(duì)組織細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用一直是研究的熱點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期給予松果體素可以減輕大鼠卵巢組織由酒精引起的氧化應(yīng)激損傷[19]。哺乳動(dòng)物的卵子和胚胎對(duì)氧化應(yīng)激損傷非常敏感，研究表明，松果體素可以通過(guò)其抗氧化效應(yīng)減輕小鼠卵巢線粒體的氧化應(yīng)激損傷，改善衰老引起的小鼠生育力下降[20]。此外，松果體素還可通過(guò)抗氧化效應(yīng)維持小鼠顆粒細(xì)胞膜的完整性[21]，并通過(guò)與顆粒細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞黃體生成激素（LH）受體和促性腺激素釋放激素受體基因的表達(dá)及卵巢功能[22]。

4 松果體素在ART中對(duì)卵母細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞和胚胎的保護(hù)作用

ART技術(shù)的關(guān)鍵因素之一是配子和胚胎的質(zhì)量，而卵母細(xì)胞和胚胎的退化和死亡是影響ART成功率最關(guān)鍵的因素。卵巢顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能細(xì)胞，其增殖與分化直接影響卵泡的發(fā)育、排卵、黃體形成及性激素分泌等，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，最終會(huì)影響胚胎的發(fā)育潛能[4，23]。研究發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡與IVF的成功密切相關(guān)，其可預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞質(zhì)量和IVF-ET的成功率，并可作為胚胎發(fā)育的依據(jù)[23]。

松果體素對(duì)卵母細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞及胚胎的發(fā)育都有一定的保護(hù)作用。研究表明，外源性松果體素可抑制未成熟卵母細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其成熟，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，改善胚胎的發(fā)育[24-25]。另外，松果體素可以通過(guò)膜受體MT1和MT2抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)孕酮的產(chǎn)生[26]。

在常規(guī)的ART超促排卵周期中，未成熟卵母細(xì)胞的比例約為15%～20%，這些細(xì)胞通常是被廢棄的。研究表明，通過(guò)未成熟卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）技術(shù)，松果體素可以通過(guò)增強(qiáng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用促進(jìn)未成熟卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，提高囊胚形成率和早期胚胎發(fā)育潛能，形成優(yōu)質(zhì)胚胎[27]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，松果體素可以通過(guò)改善線粒體功能促進(jìn)控制性超促排卵（COH）周期中人未成熟卵母細(xì)胞體外發(fā)育成熟和胚胎發(fā)育[28]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和松果體素處理組之間有1 026個(gè)差異表達(dá)基因（differential genes，DEGs），松果體素處理組中大多數(shù)參與氧化磷酸化途徑并與三磷酸腺苷（ATP）生成相關(guān)的DEGs表達(dá)上調(diào)。另外，松果體素處理組卵母細(xì)胞線粒體膜電位明顯升高，細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+水平明顯下降。

有研究發(fā)現(xiàn)，卵泡液中松果體素的濃度顯著高于外周血，并且大卵泡（卵泡發(fā)育后期）液中的松果體素水平明顯高于小卵泡（卵泡發(fā)育早期），提示松果體素在卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟過(guò)程中起重要作用[29]。此外，卵泡液中的松果體素不僅與卵子的數(shù)量和質(zhì)量相關(guān)，并可作為預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能和IVF-ET結(jié)局的生物標(biāo)志物[29]。本課題組的近期研究表明，松果體素可以通過(guò)抑制鈣離子的內(nèi)流維持人卵母細(xì)胞的線粒體膜電位，對(duì)未成熟卵母細(xì)胞起保護(hù)作用[30]。

5 松果體素在ART中對(duì)精子的保護(hù)作用

研究發(fā)現(xiàn)，松果體素受體在男性的下丘腦視上核、垂體及睪丸均有表達(dá)。松果體素可通過(guò)下丘腦-垂體-睪丸軸調(diào)控垂體促性腺激素的分泌，從而影響生殖系統(tǒng)的功能。松果體素也能與睪丸的β腎上腺素受體結(jié)合，直接調(diào)控卵泡刺激素（FSH）、LH、睪酮（T）和前列腺素（PG）等性激素的分泌，進(jìn)而調(diào)控生殖器官的發(fā)育成熟[10]。

一定水平的ROS在精子的獲能、頂體反應(yīng)、精卵融合及高活躍性運(yùn)動(dòng)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，過(guò)多的ROS則可使精子膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生丙二醛（MDA）等脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物，導(dǎo)致精子膜結(jié)構(gòu)與功能的損傷。研究表明，精子膜上富含多聚不飽和脂肪酸，非常容易受ROS攻擊，可改變精子膜流動(dòng)性，繼而導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力減弱甚至喪失。在正常生理情況下，精子和精漿中均含有可清除ROS的抗氧化物質(zhì)，可以保護(hù)精子免受ROS的攻擊和損傷。然而，在一些病理或特殊情況下，ROS的過(guò)度生成超出了精子中抗氧化物質(zhì)的清除能力，引起精子結(jié)構(gòu)和功能的損傷。

ART操作過(guò)程中，ROS可產(chǎn)生于精子制備的多個(gè)環(huán)節(jié)如精液離心過(guò)程中的未成熟精子、精漿中的抗氧化劑丟失或白細(xì)胞污染等均可導(dǎo)致ROS生成。同時(shí)，ART操作過(guò)程中的外環(huán)境也可能成為氧化應(yīng)激的潛在來(lái)源。與體內(nèi)正常的生理環(huán)境相比，體外處理的精子處于相對(duì)高氧的環(huán)境，可能影響精子質(zhì)量及胚胎的發(fā)育潛能。

線粒體是精子運(yùn)動(dòng)的能量來(lái)源，其結(jié)構(gòu)與功能的改變必然會(huì)影響精子的運(yùn)動(dòng)能力，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降。琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，位于線粒體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，SDH活性和線粒體膜電位的改變是ROS引起精子線粒體功能損傷的主要原因，而松果體素則可以通過(guò)其獨(dú)特的抗氧化能力對(duì)該損傷起到很好的保護(hù)作用[31]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，精液中存在松果體素并與精子活力有關(guān)，大部分男性不育患者的精液中均發(fā)現(xiàn)ROS水平升高[10]。研究證實(shí)，松果體素對(duì)牛和公雞解凍后的精子質(zhì)量有一定的保護(hù)作用[32-33]。松果體素可通過(guò)減少生殖細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)睪酮水平改善尼古丁處理大鼠精子生成和精子染色質(zhì)的完整性[34]。另外，松果體素可通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號(hào)通路影響精子膜的完整性、細(xì)胞內(nèi)活性氧種類(lèi)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）活性等，對(duì)人類(lèi)精子冷凍保存過(guò)程中的低溫?fù)p傷具有很好的保護(hù)作用[35]。

6 結(jié)語(yǔ)

卵母細(xì)胞和胚胎的退化和死亡是影響ART成功率最關(guān)鍵的因素，而卵巢顆粒細(xì)胞凋亡影響卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育潛能。由于松果體素具有高親水性、高脂溶性以及抗氧化效應(yīng)，其可以保護(hù)卵母細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞、精子和胚胎免受ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，同時(shí)松果體素具有安全性高、毒性低的特點(diǎn)，其在輔助生殖領(lǐng)域?qū)?huì)有廣泛的應(yīng)用前景。