黃洪龍

(1.福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002；2.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361100)

綠鮑(Haliotisfulgens)產(chǎn)于美洲太平洋亞熱帶沿岸，屬大型鮑、暖水性種類，且經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，在溫度變化范圍為9～30℃的海洋環(huán)境中可以繁殖生長，生長最適溫度在18～24℃，與福建水溫條件相適宜[1]。綠鮑的適應(yīng)性比較強(qiáng)，對(duì)于養(yǎng)殖環(huán)境要求不高，而且是一種容易在人工控制下進(jìn)行性腺發(fā)育和繁殖的優(yōu)良品種[2]。國內(nèi)外對(duì)于綠鮑的研究報(bào)道相對(duì)較少，Leighton等研究發(fā)現(xiàn)綠鮑發(fā)育比較快，可以用綠鮑來選育生長速度比較快的品系[3]。皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)是我國鮑科動(dòng)物中最重要的養(yǎng)殖種類，其自然分布海域僅限于江蘇以北的遼東、山東半島的黃海側(cè)和渤海海峽及其部分島礁周圍[4]。20世紀(jì)70年代，陳木等成功解決了皺紋盤鮑的人工育苗技術(shù)，并將皺紋盤鮑從北方海區(qū)引種至福建進(jìn)行養(yǎng)殖[5]。

鮑的種間雜交育種工作開展較早，自從Owen等發(fā)現(xiàn)北美洲太平洋沿岸主要鮑種間存在著自然雜交現(xiàn)象[6]，許多學(xué)者先后開展了鮑種間雜交實(shí)驗(yàn)，而且有些雜交種因性狀優(yōu)良，已開始產(chǎn)業(yè)化運(yùn)用于生產(chǎn)中。然而，隨著鮑養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，很多問題也相繼出現(xiàn)，種質(zhì)退化、疾病頻發(fā)等造成經(jīng)濟(jì)效益嚴(yán)重下滑，優(yōu)良養(yǎng)殖品種的不足成為制約鮑養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[7]。因此，開展鮑的遺傳改良研究成為當(dāng)務(wù)之急，也將為鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供重要技術(shù)保障。鑒于綠鮑所表現(xiàn)的耐高溫特性，與皺紋盤鮑在耐溫性等性狀具有互補(bǔ)性，因此通過利用引進(jìn)美洲沿岸的綠鮑與福建現(xiàn)有養(yǎng)殖的皺紋盤鮑進(jìn)行雜交，培育出生長快、耐高溫、抗逆性強(qiáng)的品種，這對(duì)于改善我國鮑養(yǎng)殖品種結(jié)構(gòu)和推動(dòng)整個(gè)鮑養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2015年7月開展的苗種養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，所用綠鮑(FF)、皺紋盤鮑(DD)、雜交F1(DF)、回交F1(DD×DF、DD×FD)，為2014年12月在晉江福大鮑魚水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖基地家系桶培育的苗種。從家系桶中挑出5個(gè)組合養(yǎng)殖群體(其他組合數(shù)量不足)，每個(gè)群體150只，并隨機(jī)挑選每個(gè)組合的30只幼鮑測量其殼長。實(shí)驗(yàn)從2015年7月開始，到2016年4月結(jié)束，5個(gè)組合鮑起始?xì)らL數(shù)據(jù)見表1。

表1 綠鮑與皺紋盤鮑雜交、回交后代的起始?xì)らL數(shù)據(jù)

注：同一行上標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05)。下表同此。

Notes：Means in each line with different superscripts differed significantly(P<0.05).The same as below.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

授精及孵化實(shí)驗(yàn)設(shè)置的雜交、回交組合見表2。從皺紋盤鮑和綠鮑親本群體中挑選性腺飽滿、體表無損傷、生長發(fā)育較好的個(gè)體進(jìn)行人工催產(chǎn)，親鮑催產(chǎn)采用陰干結(jié)合紫外線照射過的海水刺激的方法。將親鮑單獨(dú)放在10 L容器中排精、產(chǎn)卵。在操作的過程中，同種的雌雄個(gè)體間保持10 m以上的距離，同時(shí)在每一步操作前用淡水清洗所有的容器及滴管，嚴(yán)防同種受精，每次實(shí)驗(yàn)用的精子濃度先使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行確認(rèn)。與此同時(shí)，在進(jìn)行每次雜交實(shí)驗(yàn)前，取一次性塑料杯，往里放入未受精的卵子，6 h后進(jìn)行鏡檢，如果發(fā)現(xiàn)受精卵有卵裂，表明該次實(shí)驗(yàn)的卵子已受到污染，應(yīng)加入淡水中停止該實(shí)驗(yàn)。授精后每隔1 h洗卵1次，直至幼體發(fā)育至擔(dān)輪幼體階段后，進(jìn)行優(yōu)選。按10×104個(gè)/m3的密度將幼體均勻地潑入家系桶中進(jìn)行采苗，實(shí)驗(yàn)用育苗家系桶規(guī)格為長1.1 m、寬0.9 m、深1.0 m，采苗器材用聚乙烯波紋板，育苗用海水經(jīng)過兩層砂濾，鹽度為30～31。采苗后的管理按常規(guī)育苗方法進(jìn)行。

表2 皺紋盤鮑與綠鮑雜交、回交組合

注：DD：皺紋盤鮑；FF：綠鮑；DF：皺紋盤鮑作為母本、綠鮑作為父本的雜交F1；FD：綠鮑作為母本、皺紋盤鮑作為父本的雜交F1。

Notes：DD：Haliotisdiscushannai；FF：Haliotisfulgens；DF：Haliotisdiscushannai♀ ×Haliotisfulgens♂；FD：Haliotisfulgens♀ ×Haliotisdiscushannai♂.

苗種養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在晉江福大鮑魚水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖基地進(jìn)行，在2015年3月初家系桶中波紋板上的藻類數(shù)量減少到不能滿足稚鮑生長需求，因而采用大蒜素水溶液進(jìn)行稚鮑剝離。剝離后的稚鮑直接轉(zhuǎn)入鋪有四角磚的家系桶中進(jìn)行流水培育并大量充氣，每天傍晚投喂人工配合飼料，而后第二天上午全部換水，并徹底沖洗池底和池壁，去除殘餌。2015年7月，將鮑苗(平均殼長2 cm)移入鮑籠養(yǎng)殖，鮑籠規(guī)格為長42 cm、寬31 cm、高12 cm，每5層塑料籠1串，養(yǎng)殖密度為每籠30粒，每個(gè)組合鮑養(yǎng)1串，并且標(biāo)記銘牌。容器養(yǎng)殖在長7.5 m、寬3.0 m，高1.0 m的水泥池內(nèi)進(jìn)行，水泥池為南北走向2%找坡，實(shí)驗(yàn)從2015年7月開始，一直持續(xù)到2016年4月為止，養(yǎng)殖池中進(jìn)行流水培育并大量充氣，每隔5～7天投喂龍須菜(Gracilariaverrucosa)或海帶(Laminariajaponica)至每次稍有剩余量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 受精率測定

實(shí)驗(yàn)在6孔組織培養(yǎng)板中進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平重復(fù)6孔，設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照孔(即不加入精子)，以監(jiān)測卵子是否被同種精子污染，24 h后如果空白對(duì)照孔出現(xiàn)浮游幼體則表示卵子在實(shí)驗(yàn)前已經(jīng)被污染，反之則未被污染。綜合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中每孔卵子數(shù)控制在100個(gè)。人工授精后，在室溫條件下孵育，2 h后統(tǒng)計(jì)受精率。受精率為已分裂的卵數(shù)占總卵數(shù)的百分比。在受精卵發(fā)育到2細(xì)胞期之后，每個(gè)組合在顯微鏡下計(jì)數(shù)分裂的卵數(shù)。

受精率(%)=卵裂的個(gè)數(shù)/總卵數(shù)×100%

1.3.2 孵化率測定

2013年水利部小浪底水利樞紐管理中心（簡稱樞紐管理中心）認(rèn)真貫徹落實(shí)黨的十八大精神及中央水利決策部署，按照水利部提出的“爭創(chuàng)一流的工作業(yè)績、取得一流的綜合效益、建設(shè)一流的職工隊(duì)伍、培育一流的企業(yè)文化、打造一流的水利水電品牌、形成一流的水利樞紐管理中心”（簡稱“六個(gè)一流”）的目標(biāo)要求，把握好“擔(dān)當(dāng)、務(wù)實(shí)、轉(zhuǎn)變”的主題，持續(xù)推進(jìn)“管好民生工程，謀求多元發(fā)展”戰(zhàn)略，深化改革，強(qiáng)化管理，加快發(fā)展，取得了十分顯著的成績。

攪拌使孵化盆中的受精卵在水中分散均勻，用1 mL移液管從每個(gè)孵化盆中取樣計(jì)數(shù)卵數(shù)，定量每個(gè)孵化盆中的卵數(shù)。擔(dān)輪幼蟲孵化后，將上浮的幼蟲轉(zhuǎn)移至另一個(gè)盆中，定量該盆的幼蟲數(shù)，記為孵化幼蟲數(shù)。孵化率為孵化幼蟲數(shù)占受精卵數(shù)的百分比，每個(gè)組合分別設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

孵化率(%)=孵化幼蟲數(shù)/受精卵數(shù)×100%

1.3.3 殼長測定

殼長測量過程中，避免撬動(dòng)對(duì)鮑生長的影響，每隔1個(gè)月，對(duì)每串每籠的個(gè)體進(jìn)行拍照，并用Photoshop對(duì)照片進(jìn)行處理，得出殼長數(shù)據(jù)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。此外記錄死亡的個(gè)數(shù)，記錄每天的海水溫度，并用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)分析測量的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 皺紋盤鮑與綠鮑雜交種的受精率及孵化率

皺紋盤鮑與綠鮑雜交F1的受精率及孵化率如表3所示。由表3可知，水溫在24℃時(shí)，皺紋盤鮑與綠鮑自繁F1受精率較雜交F1高，存在顯著性差異(P<0.05)。正交F1受精率較反交F1高，存在顯著性差異(P<0.05)。

表3 皺紋盤鮑與綠鮑雜交F1的受精率及孵化率

綠鮑和皺紋盤鮑雜交F2的受精率及孵化率如表4所示。由表4可知，水溫在24℃時(shí)，皺紋盤鮑與綠鮑雜交F2，DF為母本的受精率低于FD為母本的受精率，存在顯著性差異(P<0.05)。

表4 綠鮑和皺紋盤鮑雜交F2的受精率及孵化率

皺紋盤鮑與綠鮑回交F1的受精率及孵化率如表5所示。由表5可知，水溫在24℃時(shí)，皺紋盤鮑與綠鮑回交F1，DD×FD的受精率最高為(86.7±5.8)%，DF×FF的受精率(53.8%±10.0)%次之。DD×DF、FD×FF受精率分別為(35.0±6.2)%、(27.5±0.6)%，而FF×FD、DF×DD、FD×DD不受精。

表5 皺紋盤鮑與綠鮑回交F1的受精率及孵化率

2.2 皺紋盤鮑與綠鮑雜交種的殼長

綠鮑與皺紋盤鮑雜交、回交子代不同時(shí)期的殼長情況如圖1所示。由圖1可知，剛開始時(shí)，DD、FF、DF、DD×DF、DD×FD平均殼長差異不大，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，DD×DF、DD×FD的最后殼長增加量要優(yōu)于DD和FF。在2015年7月到2015年12月期間，當(dāng)時(shí)的水溫為23～27℃，DF的生長明顯優(yōu)于其他4個(gè)組合，存在顯著性差異(P<0.05)。在2016年2月到2016年4月期間，當(dāng)時(shí)的水溫為13～18℃，DD×DF的生長明顯優(yōu)于其他4個(gè)組合，存在顯著性差異(P<0.05)?？傮w上，經(jīng)過275 d的培育，DF、DD×DF、DD×FD的殼長增加量優(yōu)于DD和FF，且存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 皺紋盤鮑與綠鮑雜交種的存活率

在相同養(yǎng)殖條件下，各組合鮑的存活率比較結(jié)果如表6所示。由表6可知，經(jīng)過275 d的跟蹤統(tǒng)計(jì)，自繁組合F1、雜交組合F1、回交組合F1的存活率都高于90%，不存在顯著性差異(P>0.05)，這與陸基工廠化養(yǎng)殖條件較為適宜有關(guān)。

表6 相同養(yǎng)殖條件下各組合鮑的存活率比較

在相同養(yǎng)殖條件下，各組合鮑死亡的殼長和數(shù)量結(jié)果如表7所示。由表6和表7可知，經(jīng)過275 d跟蹤統(tǒng)計(jì)，DD、FF、DF、DD×DF和DD×FD的存活率都高于90%，且各月死亡的都是殼長較小的個(gè)體。因此，在相同的養(yǎng)殖條件下，不論是自繁組合F1、雜交組合F1、回交組合F1，小個(gè)體鮑均較容易死亡。

表7 相同養(yǎng)殖條件下各組合鮑死亡的殼長和數(shù)量

3 討論

3.1 授精及孵化實(shí)驗(yàn)

在海洋無脊椎動(dòng)物中，近緣種之間的種間雜交較為常見，但是種間雜交受精率往往比較低，想要獲得較高的受精率則需要對(duì)授精條件進(jìn)行優(yōu)化[8-10]。駱軒研究了溫度對(duì)西氏鮑與皺紋盤鮑雜交受精的影響，結(jié)果表明，皺紋盤鮑自繁組合的受精率受水溫變化影響較小，西氏鮑自繁組合的受精率則受水溫變化的影響較大，當(dāng)授精水溫在18～20℃時(shí)，受精率均達(dá)到90%以上，而當(dāng)水溫為22℃時(shí)，受精率則迅速下降，僅為44.3%。西氏鮑與皺紋盤鮑雜交的受精率在不同水溫條件下變化較大，認(rèn)為雜交受精率的高低受到西氏鮑繁殖適溫性的影響，同時(shí)在西氏鮑與皺紋盤鮑雜交過程中，對(duì)西氏鮑親本的性腺促熟及雜交過程的水溫控制極為重要[11]。范飛龍研究了在水溫為22℃時(shí)，皺紋盤鮑和綠鮑的自繁F1的受精率達(dá)到最高值，分別為71.62%和66.73%；當(dāng)溫度低于18℃或者高于26℃時(shí)，皺紋盤鮑和綠鮑自繁F1的受精率都低于20%，兩者的最適授精水溫為20～24℃[12]。本研究通過在相同條件下比較皺紋盤鮑、綠鮑及其雜交種的受精率及孵化率，發(fā)現(xiàn)皺紋盤鮑與綠鮑的雜交種受精率較其父、母本低，存在顯著性差異(P<0.05)，如表3所示；在雜交F2中，F(xiàn)D×FD受精率高于DF×DF，存在顯著性差異(P<0.05)，如表4所示；在回交F1中，DD×FD受精率最高為(86.7±5.8)%，而FF×FD、DF×DD、FD×DD不受精，如表5所示。

不同生物種存在生殖隔離，這是一個(gè)重要的生物過程。雖然有許多機(jī)理還是未知的，但已研究清楚了物種之間的生殖隔離的兩種方式，即前合子生殖隔離和后合子生殖隔離[13-14]。前者包括生境隔離、時(shí)間(季節(jié))隔離、行為隔離、機(jī)械隔離及配子隔離(不成熟、不受精)；后者包括雜交后代不育、不受精。綠鮑和皺紋盤鮑是兩個(gè)不同的物種，盡管在貝類人工繁殖中有其雜交和繁育的可行性，但其屬于種間雜交，根據(jù)生殖隔離原理，其受精率極其低下，胚胎畸形極多，幼蟲成活率相當(dāng)?shù)拖?，屬于正常現(xiàn)象。從表3、表4和表5可知，皺紋盤鮑與綠鮑的雜交可受精，因此，綠鮑與皺紋盤鮑不存在后合子生殖隔離，而海洋環(huán)境中可能是通過前合子生殖隔離方式避免種間雜交。在配子隔離之前，生殖隔離和物種形成可能已經(jīng)發(fā)生，因?yàn)榫雍吐炎幼R(shí)別的分子機(jī)制是隨著時(shí)間推移而分化的[15]。Leighton等發(fā)現(xiàn)白鮑提供卵子、紅鮑提供精子的受精率幾乎為100%，而其反交的受精率卻低很多[16]。如表3中，DF受精率為(50.0±11.1)%，F(xiàn)D受精率為(25.6±4.7)%；如表5中，DD×DF受精率為(86.7±5.8)%，DF×DD不受精；FF×DF受精率為(18.6±9.1)%，DF×FF受精率(53.8±10.0)%，表明雜交種的受精率存在非對(duì)稱性，其受精率的差異可能與配子的親合力有關(guān)。

3.2 苗種實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的初始?xì)らL往往會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)期間的生長造成影響，表現(xiàn)為初始?xì)らL作為協(xié)變量時(shí)對(duì)因變量具有顯著影響[17]。協(xié)方差分析能在剔除協(xié)變量影響的情況下正確評(píng)估實(shí)驗(yàn)因素的影響。本實(shí)驗(yàn)中，自繁組合F1、雜交組合F1、回交組合F1的初始?xì)らL有顯著性差異(表1)，因此，對(duì)各實(shí)驗(yàn)階段殼長等指標(biāo)進(jìn)行分析時(shí)，將其作為協(xié)變量，以避免得到不可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

存活率作為雜交育種的主要目標(biāo)性狀之一，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中直接關(guān)系到養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)于雙殼類貝類種間雜種存活率的報(bào)道，大多是幼蟲存活率不高，在變態(tài)之前就夭折或者是獲得很少量的稚貝，在此之后全部死亡[18-19]。本研究通過比較皺紋盤鮑、綠鮑及其雜交種的存活，發(fā)現(xiàn)皺紋盤鮑、綠鮑及其雜交種的存活率都在90%以上，沒有顯著性差異(P>0.05)，這與養(yǎng)殖過程中較適宜的養(yǎng)殖條件有關(guān)。由表6和表7可得出結(jié)論，不論是父本、母本還是雜交種，在相同養(yǎng)殖條件下小個(gè)體比較容易死亡，溫度較高的8、9和10月鮑個(gè)體的死亡個(gè)數(shù)相對(duì)增多。

培育新品種過程中，另一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)即生長速率。駱軒通過研究西氏鮑和皺紋盤鮑雜交，結(jié)果顯示西氏鮑與皺紋盤鮑正反交F1在生長方面表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢，即生長速度比皺紋盤鮑自繁組合快，且隨著養(yǎng)殖日齡的增加，西氏鮑與皺紋盤鮑的正、反交F1在生長方面的雜種優(yōu)勢率逐漸增加，表現(xiàn)為養(yǎng)成期>幼鮑期>稚鮑期[11]。范飛龍通過對(duì)皺紋盤鮑與綠鮑的自繁F1及雜交F1的周年跟蹤，發(fā)現(xiàn)在平均水溫為24.7℃的5月，與其他3個(gè)組合相比，皺紋盤鮑自繁組合日均生長速率最低，說明皺紋盤鮑不耐較高水溫，而綠鮑自繁F1在8月的日均生長速率最高，且顯著高于其他3個(gè)組合，說明綠鮑適宜在較高水溫下生長，在10月，正交F1表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖275 d內(nèi)，雜交鮑較其父本、母本均有較快的生長速度，表明在此階段內(nèi)，雜交后代具有超親優(yōu)勢。在2015年7月至2016年1月，綠鮑自繁F1、正交DF比皺紋盤鮑自繁F1的殼長生長要快，在2016年1月至2016年4月期間，綠鮑自繁F1、正交DF比皺紋盤鮑自繁F1的殼長生長要慢，說明皺紋盤鮑不耐較高水溫，綠鮑更適宜于在較高水溫下生長(圖1)。變異是育種工作的基礎(chǔ)，在豐富的遺傳變異種中更容易選擇出有利變異，從而培育出具備優(yōu)良生產(chǎn)性狀的品種[20]，因此雜交鮑具備了較高的育種價(jià)值。所獲得的皺紋盤鮑與綠鮑雜交DF、回交DD×DF和DD×FD在生長方面表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢，并且隨著養(yǎng)殖日齡的增加，DF、DD×DF和DD×FD在生長方面的雜種優(yōu)勢率逐漸增加(圖1)。本研究經(jīng)275 d的實(shí)驗(yàn)期發(fā)現(xiàn)雜交苗要比自交苗生長快；雜交苗、自交苗的存活率在90%以上，存活率較高。

本研究發(fā)現(xiàn)，在2015年7月至2015年12月期間，正交DF的殼長比回交F1生長要快；在2016年1月至2016年4月期間，正交DF的殼長比回交F1生長要慢，總體來說，雜交F1和回交F1殼長生長要快于自繁F1，皺紋盤鮑與綠鮑雜交種具有較高的育種價(jià)值(圖1)。結(jié)合圖1的溫度曲線，DF在2015年7月到2015年11月期間生長較快，而在2015年12月到2016年4月期間生長相對(duì)較慢，這可能與溫度的下降有關(guān)，23～26℃可能為DF的最適溫度。DD×DF在2015年7月到2015年11月期間生長較慢，而在2015年12月到2016年4月期間生長相對(duì)較快，這也可能與溫度的下降有關(guān)，14～18℃可能為DD×DF生長的最適溫度。綠鮑產(chǎn)于美洲太平洋熱帶沿岸，最適水溫在18～24℃，因此雜交種DF生長可能的最適溫度與綠鮑比較接近。