姬瑞方, 卞學(xué)鵬, 劉蓓蓓, 胡靜蕓, 薛香莉 , 婁淑杰△

((1. 上海體育學(xué)院， 上海 200438； 2. 濰坊醫(yī)學(xué)院， 山東 濰坊 261042)

高脂膳食可誘發(fā)多種代謝紊亂，例如肥胖、高血壓、胰島素抵抗、2型糖尿病和胰島素抵抗[1]，其中胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元、骨骼肌等靶細(xì)胞對(duì)正常循環(huán)水平的胰島素反應(yīng)降低[2]，使胰島素信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生障礙，繼而誘發(fā)氧化應(yīng)激、氮化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種細(xì)胞應(yīng)激。前人研究表明氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等可以激活NOD樣受體蛋白3(NOD like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體，引發(fā)細(xì)胞焦亡[3]。細(xì)胞焦亡是一種程序性促炎死亡方式，通常認(rèn)為參與機(jī)體防御病原體的免疫機(jī)制消皮素D(gasdmermin D，GSDMD)是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白，其蛋白上切割位點(diǎn)以及N端的完整性是焦亡發(fā)生的必要條件[4]。

NLRP3炎癥小體由NLRP3、接頭蛋白ASC及半胱氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)組成，參與Caspase-1依賴性經(jīng)典焦亡途徑。其中NLRP3蛋白可感知細(xì)胞內(nèi)的代謝變化和危險(xiǎn)分子，例如真菌、細(xì)菌或病毒的感染以及線粒體氧自由基增多、細(xì)胞體積改變和鉀離子外流等[5]；接頭蛋白ASC具有信號(hào)放大的作用可同時(shí)招募Caspase-1[6]。被招募的Caspase-1通過(guò)自切割形成活性形式的Caspase-1，可直接切割原本處于自身抑制狀態(tài)的GSDMD的N端和C端的連接，N端和C段的斷裂使GSDMD的自身抑制狀態(tài)解除，GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-N)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜與膜上的膜磷脂、磷酸肌醇和雙磷脂酰甘油結(jié)合后形成孔洞，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引起細(xì)胞焦亡[7]。同時(shí)活性形式的Caspase-1對(duì)白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)的前體進(jìn)行切割，成熟形式的IL-1β和IL-18通過(guò)孔洞釋放。

本課題組前期研究表明胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下海馬內(nèi)糖代謝紊亂，三羧酸循環(huán)受阻導(dǎo)致海馬內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)不足[8]。腺苷酸活化蛋白激酶((AMP)-activated protein kinase, AMPK)與沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1)是細(xì)胞的能量感受器，其活性受到海馬中異常糖代謝影響。而AMPK和SIRT1同時(shí)可參與炎癥反應(yīng)，通過(guò)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)去乙酰化降低其轉(zhuǎn)錄活性，減少NLRP3炎癥小體、IL-1β和IL-18等炎癥因子轉(zhuǎn)錄[7,9,10]。

研究表明，胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，在外周組織例如肝[11]、白色脂肪組織和骨骼肌[12]等部位均有細(xì)胞焦亡現(xiàn)象的發(fā)生，但腦內(nèi)特別是海馬組織是否發(fā)生細(xì)胞焦亡尚未可知。適量運(yùn)動(dòng)和合理膳食是促進(jìn)2型糖尿病患者康復(fù)，減輕胰島素抵抗的有效措施[13]。而抗阻訓(xùn)練可通過(guò)提高肌肉線粒體質(zhì)量和促進(jìn)骨骼肌肥大，改善胰島素反應(yīng)性和腦內(nèi)葡萄糖代謝[14]。但抗阻運(yùn)動(dòng)能否改善胰島素抵抗小鼠海馬內(nèi)的細(xì)胞焦亡仍未可知。

因此，本實(shí)驗(yàn)利用高脂膳食建立IR小鼠模型，考察外周胰島素抵抗對(duì)海馬細(xì)胞焦亡的影響，并探究抗阻訓(xùn)練的調(diào)節(jié)作用，從而揭示抗阻訓(xùn)練對(duì)胰島素抵抗小鼠海馬功能的改善作用，為運(yùn)動(dòng)促進(jìn)腦健康提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

6周齡雄性C57BL/6J小鼠38只(購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)飼養(yǎng)于上海體育學(xué)院動(dòng)物房。小鼠自由攝食和飲水，光照比12 h∶12 h，動(dòng)物房溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度40%～70%。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(C,n=12)和高脂飼料組(HFD,n=26)。C組喂養(yǎng)普通飼料，HFD組喂養(yǎng)高脂飼料(60 %脂肪供能，D12492)。

喂養(yǎng)12周后，C組和HFD組小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(glucose tolerance test, GTT)以及胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance test, ITT)。GTT實(shí)驗(yàn)中小鼠禁食16 h后按照2 g/kg體重腹腔注射50%濃度的葡萄糖溶液，此后0、15、30、60、90、120 min時(shí)于尾靜脈取血測(cè)小鼠血糖濃度；ITT實(shí)驗(yàn)禁食6 h后以1 U/kg體重腹腔注射胰島素溶液，于0、15、30、60、90、120 min時(shí)尾靜脈取血測(cè)小鼠胰島素濃度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果及繪制曲線，以實(shí)驗(yàn)結(jié)果C組小鼠和IR組小鼠的胰島素和葡萄糖曲線下面積具有顯著性差異判定胰島素抵抗模型成功建立。將建模成功的HFD組小鼠隨機(jī)分為胰島素抵抗組(IR,n=10)和胰島素抵抗+抗阻運(yùn)動(dòng)組(RT,n=10)，繼續(xù)進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

兔源抗體NLRP3、ASC、NF-κB、SIRT1、AMPK、p-AMPK購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，兔源抗體IL-1β、IL-18、GSDMD購(gòu)自abcam公司，鼠源抗體Caspase-1購(gòu)自Santa公司，β-Actin、β-Tubulin、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自proteintech公司。彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Thermo Scientific公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司。BeyoECL Plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)及PVDF膜購(gòu)自Millipore公司。蛋白質(zhì)電泳儀、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜裝置購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。

1.3 抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

RT組小鼠經(jīng)1周適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)后，進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)方案如下：

小鼠進(jìn)行負(fù)重爬梯抗阻訓(xùn)練12周。爬梯高度為1 m，與地面傾斜成85°，梯級(jí)間隔為2 cm。初始負(fù)重強(qiáng)度為小鼠自身體重的30%，并逐漸遞加負(fù)荷，前4周每周增加10%體重，第五周増至80%體重，此后每?jī)芍茉黾?0%體重。每周訓(xùn)練3 d，每天訓(xùn)練3組，每組訓(xùn)練5次，次間隔1 min，組間隔2 min，采用毛刷輕輕刺激小鼠尾部使小鼠完成15次抗阻運(yùn)動(dòng)或者達(dá)到力竭停止運(yùn)動(dòng)[15]。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材與樣本制備

12周抗阻運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，小鼠隔夜禁食，10%的水合氯醛麻醉后處死。于冰上迅速剝離腦組織并分離海馬，儲(chǔ)存于EP管中，迅速置于液氮中冷凍。隨后將海馬組織剪碎并提取海馬全組織蛋白，利用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)濃度測(cè)定結(jié)果，加入相應(yīng)量蛋白上樣緩沖液(5X)和PBS，將樣本濃度調(diào)成5 μg/μl，蛋白上樣緩沖液同時(shí)被稀釋成1X，在95℃水浴鍋中進(jìn)行5 min的蛋白變性，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

1.5 Western blot蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

利用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% BSA-TBST中封閉1 h。一抗孵育，4℃過(guò)夜。次日用TBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，然后用TBST洗膜3次。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore，USA)反應(yīng)3～5 min，曝光10 s～5 min，顯影2 min后定影。條帶用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胰島素抵抗小鼠的建模結(jié)果

如圖1所示，C組和HFD組小鼠GTT曲線均隨時(shí)間的推移呈先上升后下降的趨勢(shì)，且血糖峰值均出現(xiàn)在15 min左右，但HFD組的血糖值均始終高于C組，即HFD組小鼠葡萄糖耐量減低。同時(shí)，ITT曲線均隨時(shí)間的推移呈下降后上升的趨勢(shì)，且C組血糖始終高于HFD組，表明胰島B細(xì)胞的合成和分泌功能受阻。GTT曲線下面積可用來(lái)評(píng)估機(jī)體葡萄糖耐受能力，ITT曲線下面積反映胰島素靶器官對(duì)于胰島素的敏感性。結(jié)果顯示，HFD組小鼠GTT、ITT曲線下面積均顯著性高于C組(P<0.05)。上述結(jié)果表明，12周的高脂膳食可誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗的發(fā)生，模型建立成功。

Fig. 1 Glucose tolerance test and insulin tolerance test in each group of mice

2.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后各組小鼠海馬內(nèi)NLRP3炎癥小體及其相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

小鼠海馬內(nèi)NLRP3炎癥小體包括NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白，其中NLRP3為感受信號(hào)蛋白，ASC為接頭蛋白，招募Caspase-1組成炎癥小體，進(jìn)一步調(diào)控下游焦亡相關(guān)蛋白。如圖2所示，IR組小鼠海馬內(nèi)的NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白水平均顯著高于C組(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)12周的抗阻運(yùn)動(dòng)后，ASC、Caspase-1的表達(dá)水平均顯著下降(P< 0.05)。

2.3 運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后小鼠海馬內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

GSDMD是經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中Caspase-1的下游蛋白，可切割出GSDMD的N端用于和胞膜磷脂等結(jié)合在胞膜形成孔洞。同時(shí)Caspase-1可切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體，釋放成熟形式的IL-1β和IL-18。如圖3所示，IR組小鼠海馬內(nèi)GSDMD(P< 0.01)、GSDMD-N(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)、IL-18(P<0.05)的蛋白表達(dá)量均顯著高于C組，而12周的抗阻運(yùn)動(dòng)后，RT組小鼠海馬內(nèi)GSDMD(P< 0.05)、GSDMD-N(P<0.01)、IL-1β(P<0.05)、IL-18(P< 0.05)的蛋白表達(dá)量較IR組顯著性降低。

Fig. 3 The expressions ofpyroptosis-related proteins in the hippocampus of each group of n=8)

2.4 運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后小鼠海馬內(nèi)p-AMPK/AMPK、SIRT1、NF-κB的表達(dá)情況

NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平主要受核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)控，而細(xì)胞能量狀態(tài)感受器AMPK和細(xì)胞氧化還原狀態(tài)感受器SIRT1可協(xié)同抑制NF-κB的表達(dá)。為進(jìn)一步明確胰島素小鼠海馬內(nèi)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡情況與AMPK和SIRT1的關(guān)系，我們檢測(cè)了海馬內(nèi)p-AMPK/AMPK、SIRT1和NF-κB的蛋白水平。如圖4所示，IR組小鼠海馬內(nèi)AMPK磷酸化水平和SIRT1表達(dá)量較C組顯著下降(P<0.05)，而NF-κB較C組明顯升高(P< 0.01)；12周的抗阻運(yùn)動(dòng)后，RT組小鼠海馬內(nèi)p-AMPK水平和SIRT1蛋白較IR組明顯升高(P< 0.01)，NF-κB較IR組明顯降低(P<0.05)。

3 討論

細(xì)胞焦亡作為一種促炎程序性死亡方式，可分為Caspase-1依賴性焦亡途徑和非Caspase-1依賴性焦亡途徑[16]。焦亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹和膜成孔現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞內(nèi)容物釋放，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。GSDMD蛋白是細(xì)胞焦亡的標(biāo)志性產(chǎn)物，其GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域具有固有的細(xì)胞焦亡誘導(dǎo)活性[17]。適度的細(xì)胞焦亡可參與機(jī)體抵御感染的免疫反應(yīng)，過(guò)度的細(xì)胞焦亡會(huì)引起免疫性疾病和膿毒性休克[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗小鼠海馬內(nèi)細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、GSDMD-N有顯著性的升高，提示在胰島素抵抗小鼠海馬內(nèi)發(fā)生細(xì)胞焦亡。

Fig. 4 The expressions ofp-AMPK/AMPK, SIRT1 and NF-κB in the hippocampus of each group of n=8)

Tab. 1 Comparison of the expressions of proteins in the hippocampus of each group of mice by Western n=8)

研究表明，細(xì)胞焦亡過(guò)程中胞內(nèi)容物的釋放可以誘發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。本研究結(jié)果顯示，IR組小鼠海馬內(nèi)NLRP3、Caspase-1、ASC等炎癥小體構(gòu)成蛋白的蛋白表達(dá)量以及下游炎癥因子IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)水平均顯著增多，這與Zhai等[19]人的研究結(jié)果相似：db/db小鼠焦慮和抑郁樣行為加重，學(xué)習(xí)和記憶功能受損，伴隨著小鼠海馬中NLRP3、ASC和IL-1β蛋白表達(dá)量顯著上升，Caspase-1的活性明顯上升。上述結(jié)果說(shuō)明胰島素抵抗小鼠海馬內(nèi)NLRP3炎癥小體激活，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的表達(dá)，這與細(xì)胞焦亡標(biāo)志物GSDMD-N和GSDMD的增多相一致。

葡萄糖和糖原是大腦的主要能源底物，前期研究表明，大鼠發(fā)生胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，海馬細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝障礙，主要表現(xiàn)為三羧酸循環(huán)水平下降，糖酵解途徑、多元醇通路和磷酸戊糖途徑激活，腦內(nèi)ATP相對(duì)不足，AMP/ATP升高[20]。 AMPK是細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)感受器，其活性受AMP/ATP的調(diào)節(jié)。SIRT1是依賴于NAD+的去乙酰化酶，除去乙酰化組蛋白外，還可作用于NF-κB在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子，與衰老、炎癥、氧化應(yīng)激等多種生理病理密切相關(guān)[9]。SIRT1和AMPK可以增強(qiáng)彼此作用，共同抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)[21]。

本研究中，IR組AMPK蛋白磷酸化與SIRT1蛋白表達(dá)量均顯著性降低，NF-κB蛋白表達(dá)量顯著性增多，這提示胰島素抵抗小鼠海馬內(nèi)AMPK與SIRT1對(duì)NF-κB抑制作用減弱，NLRP3炎癥小體的激活，繼發(fā)細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)。

目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)運(yùn)動(dòng)影響細(xì)胞焦亡的研究較少，尤其是抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素抵抗小鼠海馬內(nèi)細(xì)胞焦亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，但有學(xué)者關(guān)注藥物對(duì)細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用。例如Lin等[22]人利用番石榴汁和海藻糖抗炎、抗氧化、抗糖尿病的特性，補(bǔ)充番石榴汁和海藻糖可以減輕T2DM模型大鼠腎和胰腺的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞焦亡和自噬。此外，F(xiàn)an等[23]發(fā)現(xiàn)另有研究表明，氣體吸入異氟烷的老年小鼠海馬內(nèi)NLRP3炎性小體激活并檢測(cè)到GSDMD-N表達(dá)顯著性增多，而氣體吸入同時(shí)腹腔注射NLRP3炎性小體的抑制劑MCC950后發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬組織中GSDMD-N表達(dá)顯著性減少。上述研究提示NLRP3炎癥小體是改善細(xì)胞焦亡，減輕炎癥反應(yīng)的有效靶點(diǎn)。

結(jié)果顯示，12周抗阻訓(xùn)練可使胰島素抵抗小鼠海馬內(nèi)NLRP3、Caspase-1、ASC等蛋白減少，且焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、GSDMD-N以及炎癥因子IL-18、IL-1β等蛋白表達(dá)量也有顯著性的下降，提示抗阻運(yùn)動(dòng)可有效地緩解海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡。這可能是因?yàn)榭棺柽\(yùn)動(dòng)改善小鼠海馬的異常代謝，促進(jìn)AMPK磷酸化程度和SIRT 1蛋白表達(dá)量，抑制NF-κB表達(dá)，進(jìn)而阻礙NLRP3炎癥小體的激活。而12周抗阻運(yùn)動(dòng)后，GSDMD以及GSDMD-N的表達(dá)量均顯著性下降，這提示抗阻運(yùn)動(dòng)有效緩解細(xì)胞焦亡。GSDMD蛋白N端片段可轉(zhuǎn)移至胞膜結(jié)合磷脂等物質(zhì)致使胞膜成孔，標(biāo)志細(xì)胞焦亡的發(fā)生。目前仍不清楚GSDMD蛋白N端片段減少是抗阻運(yùn)動(dòng)減少GSDMD總蛋白表達(dá)量所致，還是抗阻運(yùn)動(dòng)抑制GSDMD蛋白自切割現(xiàn)象所致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗小鼠的海馬內(nèi)發(fā)生細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)。而12周的抗阻運(yùn)動(dòng)可增加AMPK與SIRT1的活性，抑制NF-κB表達(dá)和NLRP3炎癥小體的激活，從而減少焦亡相關(guān)蛋白和炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)，提示抗阻運(yùn)動(dòng)可有效改善胰島素抵抗小鼠海馬內(nèi)細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)海馬結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，為運(yùn)動(dòng)促進(jìn)腦健康提供新的參考依據(jù)。