董 兵，樸俊杰,2，楊 洋,2，朱 光，秦云植，林貞花,2

胃癌是我國(guó)第二大常見腫瘤[1]，其侵襲性強(qiáng)、惡性程度高，患者5年生存率僅為10%[2-3]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期的、多階段、多因素共同參與的過(guò)程，如環(huán)境因素引起的幽門螺旋桿菌感染等[4]。隨著蛋白組學(xué)和基因組學(xué)的飛速發(fā)展，血清CEA、CA19-9、CA72-4等大量生物學(xué)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提高胃癌的早期診斷，但這些標(biāo)志物仍存在特異性低和敏感性差等問(wèn)題亟待解決[5-6]。

人類羥基類固醇脫氫酶樣蛋白2(hydroxysteroid dehydrogenase like 2, HSDL2)是短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超家族的成員之一[7]。HSDL2在人體組織中廣泛表達(dá)，尤其在肝臟、腎臟及前列腺中的表達(dá)水平較高。研究顯示，HSDL2異常表達(dá)與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，可參與乳腺癌、卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展[8-9]，目前HSDL2在胃癌中的表達(dá)及作用尚未見報(bào)道。本文旨在探討HSDL2蛋白在胃癌中的表達(dá)，并分析HSDL2過(guò)表達(dá)與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2003年10月～2015年10月延邊大學(xué)腫瘤研究中心存檔的胃癌組織標(biāo)本90例、正常胃組織標(biāo)本20例(部分組織標(biāo)本購(gòu)自上海芯超公司)，患者臨床病理資料均完整。所有組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。90例胃癌患者中男性65例，女性25例；年齡<50歲者19例，≥50歲者71例；腫瘤直徑≤5.0 cm者55例，>5.0 cm者35例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例；高分化4例，中分化50例，低分化36例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期70例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP兩步法檢測(cè)HSDL2蛋白的表達(dá)，HSDL2兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司(15631-1-AP)。染色步驟：組織4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，熱檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復(fù)，滴加一抗HSDL2(稀釋比1 ∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，DAB顯色，Mayer蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。為證明HSDL2抗體免疫組化的特異性，選用HSDL2蛋白強(qiáng)陽(yáng)性染色的切片，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌及正常組織中HSDL2 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.2免疫熒光 免疫熒光染色用于檢測(cè)HSDL2在SGC-7901和AGS胃癌細(xì)胞中的定位。當(dāng)SGC-7901、AGS細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)，經(jīng)4%多聚甲醛固定。使用0.5%TritonX-100透化細(xì)胞后，3%牛血清白蛋白V(A8020，北京索萊寶公司)封閉。滴加一抗HSDL2(稀釋比1 ∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜。滴加Alexa Fluor 488孵育山羊抗兔IgG(H+C)(A11008，1 ∶1 000，Invitrogen公司)室溫孵育1 h。PBS洗滌后，DAPI染色(C1006，上海碧云天生物公司)，蓋玻片封固。IF信號(hào)可視化，并用BX53 Olympus顯微鏡記錄。

1.3 結(jié)果判斷根據(jù)Beesley分級(jí)法，HSDL2蛋白以細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()；其中≤4分為HSDL2低表達(dá)，>4分為HSDL2高表達(dá)。

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)分析通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析HSDL2 mRNA表達(dá)水平，通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析HSDL2表達(dá)與患者生存期的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間陽(yáng)性率差異的比較及與臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)及P值修正。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSDL2蛋白在胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS中的表達(dá)為確定HSDL2的亞細(xì)胞定位，分別在SGC-7901和AGS胃癌細(xì)胞中進(jìn)行HSDL2蛋白的免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示：HSDL2的強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)主要定位于胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS的細(xì)胞質(zhì)(圖1)。

2.2 HSDL2在胃癌組織中的表達(dá)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，胃癌組織中HSDL2 mRNA表達(dá)水平高于正常胃組織(P<0.05，圖2)。為了進(jìn)一步明確HSDL2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，分別對(duì)90例胃癌組織及20例正常胃組織進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果顯示：HSDL2蛋白在正常胃組織中低表達(dá)或不表達(dá)；在胃癌組織中過(guò)表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖3)。HSDL2蛋白在胃癌組織中的強(qiáng)陽(yáng)性率為(58.9%，53/90)，高于正常胃組織(5.0%，1/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

表1 胃癌及正常胃組織HSDL2蛋白的表達(dá)

**P<0.01：胃癌組織陽(yáng)性率vs正常胃組織的陽(yáng)性率；##P<0.01：胃癌組織強(qiáng)陽(yáng)性率vs正常胃組織的強(qiáng)陽(yáng)性率

圖1免疫熒光檢測(cè)HSDL2蛋白在胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS中的定位

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析HSDL2 mRNA表達(dá)水平

圖3免疫組化檢測(cè)HSDL2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，SP兩步法：A.正常胃組織中HSDL2蛋白呈陰性；B.胃癌組織中HSDL2蛋白呈弱陽(yáng)性；C.胃癌組織中HSDL2蛋白呈陽(yáng)性；D.胃癌組織中HSDL2蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性，染色定位于細(xì)胞質(zhì)并有核周聚集現(xiàn)象

2.3 HSDL2蛋白過(guò)表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系為探討HSDL2過(guò)表達(dá)在胃癌惡性演進(jìn)過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)分析HSDL2蛋白過(guò)表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HSDL2過(guò)表達(dá)與胃癌分化程度、臨床分期及腫瘤直徑密切相關(guān)，與患者性別、年齡及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性。其中，HSDL2在低分化組織中的強(qiáng)陽(yáng)性率(91.7%)明顯高于高分化組織(0)和中分化組織(46.0%，P<0.01)，HE染色結(jié)果與之一致(圖4)；HSDL2在晚期(Ⅲ+Ⅳ期)胃癌組織中的強(qiáng)陽(yáng)性率(72.9%)高于早期(Ⅰ+Ⅱ期)胃癌組織(20.0%，P<0.01)；HSDL2在胃癌腫瘤直徑>5.0 cm組織中的強(qiáng)陽(yáng)性率(68.6%)高于腫瘤直徑≤5.0 cm組織(54.5%，P<0.05，表2)。上述結(jié)果提示HSDL2蛋白可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)判斷胃癌的進(jìn)展有重要的臨床價(jià)值。

表2 胃癌臨床病理特征與HSDL2蛋白過(guò)表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

*P<0.05，**P<0.01

2.4 HSDL2蛋白過(guò)表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系本實(shí)驗(yàn)經(jīng)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，HSDL2蛋白過(guò)表達(dá)的胃癌患者無(wú)瘤生存期(圖5A)低于HSDL2蛋白低表達(dá)者(P<0.05)，但兩組總生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)；提示HSDL2蛋白表達(dá)水平可能對(duì)胃癌患者的預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

3 討論

HSDL2最早分離、鑒別于人胎腦組織的cDNA文庫(kù)，其cDNA全長(zhǎng)3 211 bp，定位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂的32區(qū)[10]。HSDL2蛋白由418個(gè)氨基酸構(gòu)成，包含N末端SDR結(jié)構(gòu)域、C末端甾醇載體蛋白2(sterol carrier protein 2, SCP2)結(jié)構(gòu)域和過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)(ARL)，可催化多種底物(如類固醇和脂肪酸等)氧化還原反應(yīng)[11]，其中過(guò)氧化物酶體是脂質(zhì)代謝的核心，可通過(guò)結(jié)合類固醇脫氫酶其他亞族促進(jìn)膽固醇代謝及甾體激素的合成[12]。Gallegos等[13]發(fā)現(xiàn)HSDL2過(guò)表達(dá)可加快細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，提高體內(nèi)總膽固醇的含量；對(duì)小鼠進(jìn)行高膽固醇喂食后，其體內(nèi)HSDL2蛋白的表達(dá)量也明顯升高，提示HSDL2蛋白可能參與膽固醇代謝的信號(hào)傳導(dǎo)并控制其合成。Kowalik等[7]報(bào)道HSDL2蛋白在人類、大鼠和小鼠的過(guò)氧化物酶體和線粒體中發(fā)揮重要作用，并可能與脂肪酸代謝相關(guān)，參與脂質(zhì)代謝，而脂質(zhì)代謝異常是癌癥的主要標(biāo)志之一，提示HSDL2蛋白可能與一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示HSDL2在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，且沉默HSDL2可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力[8]。值得注意的是，Zhang等[14]通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建膽管癌HSDL2過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)HSDL2過(guò)表達(dá)可以抑制膽管癌細(xì)胞的增殖能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；提示HSDL2蛋白是一把雙刃劍，在不同癌癥中發(fā)揮不同作用。目前，HSDL2蛋白在胃癌中的表達(dá)尚未見報(bào)道。

圖4免疫組化檢測(cè)HSDL2蛋白在低、中、高分化胃癌組織中的表達(dá)；HE染色觀察低、中、高分化胃癌組織形態(tài)學(xué)之間的差異

圖5 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析HSDL2表達(dá)與患者生存期的關(guān)系：A.無(wú)瘤生存期；B.總生存期

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中HSDL2 mRNA表達(dá)水平高于正常胃組織，與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSDL2蛋白表達(dá)主要定位于胃癌細(xì)胞胞質(zhì)，且在胃癌組織中過(guò)表達(dá)，強(qiáng)陽(yáng)性率(58.9%)高于正常胃組織(5.0%)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HSDL2過(guò)表達(dá)與胃癌分化程度(P=0.01)、臨床分期(P=0.07)及腫瘤直徑(P=0.017)密切相關(guān)；提示隨著胃癌的發(fā)生、發(fā)展，HSDL2蛋白的表達(dá)也呈逐漸升高的趨勢(shì)，這與Zeng等[15]在甲狀腺乳頭狀癌中HSDL2表達(dá)的結(jié)果一致。以上研究結(jié)果均提示HSDL2蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，可能發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)HSDL2過(guò)表達(dá)的胃癌患者無(wú)瘤生存期低于HSDL2低表達(dá)患者(P<0.05)，但兩組的總生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Sun等[9]在卵巢癌中的研究結(jié)果相符。其總生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與數(shù)據(jù)庫(kù)樣本數(shù)有關(guān)。以上結(jié)果提示HSDL2蛋白過(guò)表達(dá)，可能是胃癌患者預(yù)后評(píng)估的重要分子標(biāo)志物之一。

綜上所述，HSDL2蛋白可能參與胃癌的惡性演進(jìn)過(guò)程，對(duì)判斷胃癌的進(jìn)展及預(yù)后具有重要的臨床價(jià)值。目前，HSDL2在胃癌中過(guò)表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。因此深入分析腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及具體分子機(jī)制，為胃癌的靶向治療提供可靠、有效的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。