劉金虎 趙國(guó)慶 毛會(huì)秀 方園 陶然 張瑞 史磊 王集會(huì)

摘 ?????要：比較全蝎白術(shù)白頭翁組合發(fā)酵品（SAPZFP）與未發(fā)酵品（SAPZP）水提液不同截留分子量?jī)龈煞刍钚猿煞旨绑w外抗腫瘤活性的差異。分別測(cè)定各截留分子量段水溶性氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖的含量，并采用MTT法研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7的抑制作用。SAPZFP截留分子量<5、5 ～ 10、>10 kDa凍干粉對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7的IC₅₀分別為0.854、0.315、0.071 mg·mL^-1;SAPZP的分別為1.128、0.360、0.115 mg·mL^-1。SAPZFP截留分子量>10 kDa的抗腫瘤活性顯著，球孢白僵菌雙向固體發(fā)酵技術(shù)可顯著增強(qiáng)本組合物的體外抗腫瘤活性。

關(guān) ?鍵 ?詞：中藥組合品;超濾;水溶性活性成分;抗腫瘤

中圖分類號(hào)：R285.5 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2020）01-0032-05

Study on the Active Constituents?and Anti-tumor Activity in Vitro of Water Extracts?With Different Molecular Weight Cut-off Segments of Chinese Medicine Scorpio，?Atractylodes Macrocephala and Pulsatillachinensis

Mixture?Before and After Fermentation

LIU Jin-hu¹，ZHAO Guo-qing¹， MAO Hui-xiu¹， FANG Yuan¹， TAO Ran¹， ZHANG Rui¹， SHI Lei¹， WANG Ji-hui^2*

（1. College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong?Jinan 250355， China;

2. Center of Experiment， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong Jinan 250355， China）

Abstract： The active constituents and anti-tumor activity in vitro among different molecular weight range of lyophilized powders of SAPZFPs and SAPZPs water extract were compared. The contents of water-soluble amino acid， protein and polysaccharide in various molecular weight ranges?were determined and the inhibitory effect of the drugs on mammary cancer cells strain MCF - 7 was studied by MTT assay. The IC₅₀?of SAPZFP with < 5， 5 ～ 10，> 10 kDa on mammary cancer cells strain MCF - 7 were 0.854， 0.315， 0.071 mg·mL^-1， respectively. The IC₅₀?of SAPZP were 1.128， 0.360， 0.115 mg·mL^-1， respectively. The anti-tumor activity of SAPZFP with > 10 kDa was significant， and the bidirectional solid fermentation technology of Beauveria bassiana can markedly enhance the anti-tumor activity in vitro.

Key words： Chinese medicine composition; Ultrafiltration; Water-soluble active constituents; Anti-tumor

全蝎白術(shù)白頭翁組合發(fā)酵品（SAPZFP），是將中藥全蝎、白術(shù)、白頭翁按一定配伍比例混合后作為培養(yǎng)基，通過球孢白僵菌（Beauveria bassiana（Bals.）Vuill）雙向固體發(fā)酵技術(shù)制得的中藥組合發(fā)酵品。文獻(xiàn)報(bào)道，全蝎的抗腫瘤活性與可溶性蛋白質(zhì)、多糖^[1]、氨基酸^[2]的含量有關(guān)，有報(bào)道白僵菌發(fā)酵可提高全蝎的多糖含量^[3];白術(shù)多糖具有抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫的作用^[4];白頭翁糖蛋白具有免疫增強(qiáng)作用^[5]。前期研究表明，在最佳水提工藝條件下，SAPZFP具有體外抗乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7的活性。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)借助超濾膜分離技術(shù)，將SAPZFP、SAPZP的水提液分別制備成不同截留分子量段的凍干粉，并對(duì)其進(jìn)行水溶性活性成分含量分析及體外抗腫瘤研究，以確定經(jīng)球孢白僵菌發(fā)酵后是否影響本中藥組合品不同截留分子量段的活性成分含量并增強(qiáng)其體外抗腫瘤活性，進(jìn)而為后續(xù)有效成分的分離純化及發(fā)酵技術(shù)機(jī)制的探究提供理論依據(jù)。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?儀器

生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限

公司）;HPS - 5型卷式超濾組件、HPS - 10型卷式超濾組件、MSM - 1812型實(shí)驗(yàn)室用膜分離設(shè)備（上海摩速科學(xué)器材有限公司）;UV9100B型紫外可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）;CKX41型奧林巴斯顯微鏡（Made in Philippines）;DNM - 9602型酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）等。1.2 ?試劑

牛血清蛋白（上海伯奧生物科技有限公司）;RPMI Medium Modified培養(yǎng)基（HyClone）;PBS（1×）PH7.2（SparkJade）;胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）;MTT（BioFROXX賽國(guó)生物科技）;胰酶細(xì)胞消化液（biosharp）;福林酚（上海源葉生物科技有限公司）;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 ?藥材與細(xì)胞株

全蝎均為野生成年活蝎，購自山東臨沂，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民副教授鑒定為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎（Buthus martensii?Karsch）;白術(shù)、白頭翁均購自河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民副教授鑒定符合2015版中國(guó)藥典要求;乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7由山東省立醫(yī)院饋贈(zèng);球孢白僵菌桃5活化菌種（Beauveria bassiana（Bals.）Vuill）由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所饋贈(zèng)。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?SAPZFP的制備

2.1.1 ?全蝎凍干粉的制備

采用凍干非鹽蝎制法^[6]，取野生成年活蝎，除去雜質(zhì)，洗凈，于–?80℃凍結(jié)，打碎成漿，冷凍干燥即得，并低溫密封保存。

2.1.2 ?PDA培養(yǎng)基的制備

根據(jù)張莉等^[7]方法，稱定200 g洗凈去皮的馬鈴薯，切成小塊，加水煮爛至能被玻璃棒戳破，用八層紗布過濾，加入20.00 g瓊脂，繼續(xù)加熱，攪拌混勻，待瓊脂溶解完全后，加入20.00 g葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后補(bǔ)水至1000 mL，分裝至大試管中，于115℃滅菌25 min，制成斜面培養(yǎng)基。

2.1.3 ?球孢白僵菌孢子懸液的制備

將球孢白僵菌桃5活化菌種（Beauveria bassiana（Bals.）Vuill）用接種針無菌轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基，于25 ℃培養(yǎng)7?d后，將二代菌種用無菌水稀釋至1×10⁸個(gè)孢子·mL^-1，得球孢白僵菌孢子懸液。

2.1.4 ?SAPZFP的制備

精密稱定“2.1.1”項(xiàng)中經(jīng)鈷 - 60滅菌過的全蝎

凍干粉、白術(shù)粗粉、白頭翁粗粉各10.00 g，加入“2.1.3”項(xiàng)中球孢白僵菌孢子懸液，攪拌均勻至適宜濕度，于溫度25 ℃、濕度不低于95% 、光照自然的條件下，約發(fā)酵7 d至菌絲長(zhǎng)滿后適時(shí)取出，冷凍干燥即得，并低溫密封保存。

2.2 ?SAPZFP、SAPZP不同截留分子量段的凍干粉制備

2.2.1 ?超濾原液的制備

根據(jù)最佳提取工藝進(jìn)行超聲水提（待發(fā)表資料），取“2.1”項(xiàng)中制備的SAPZFP約20 g，精密稱定，置2 000 mL錐形瓶中，精密加入蒸餾水800 mL，調(diào)節(jié)pH值為11，于40 ℃下恒溫超聲提?。ㄝ斎牍β?00 W，頻率80 kHz）60 min后，在4 ℃、4 000 r·min^-1條件下離心15 min，取上清液先用中速濾紙初步抽濾，以除去水不溶性雜質(zhì)，再用5 μm水系微孔濾膜預(yù)處理，并重復(fù)提取一次，兩次濾液合并，并加水定容至4 000 mL，即得SAPZFP的超濾原液。SAPZP同法處理作為對(duì)照。

2.2.2 ?超濾系統(tǒng)的預(yù)處理

將使用1%甲醛溶液密封保存于冰箱冷藏室的卷式超濾組件放至室溫后，于蒸餾水中浸泡30 min，組裝超濾系統(tǒng)，于室溫、0.1 MPa條件下純水運(yùn)輸30 min，以洗凈超濾組件的保護(hù)劑。

2.2.3 ?超濾原液的膜分離過程

依次用已預(yù)處理的公稱分子量截留值為10和5 kDa的超濾系統(tǒng)，于室溫、0.1 MPa條件下對(duì)“2.2.1”項(xiàng)中SAPZFP的超濾原液進(jìn)行超濾，在平衡循環(huán)4 倍原液體積后^[8]，使超濾組件膜表面存在的吸附和解吸附達(dá)到平衡，進(jìn)而完全超濾，得到SAPZFP的< 5、5 ～ 10、> 10 kDa的超濾藥液，于40 ℃旋蒸濃縮后，冷凍干燥備用。SAPZP同法制備。

2.3 ?水溶性活性成分的含量測(cè)定

2.3.1 ?水溶性氨基酸的含量測(cè)定

采用茚三酮顯色法^[9]進(jìn)行水溶性氨基酸的含量測(cè)定。以吸光度A₁為縱坐標(biāo)，甘氨酸質(zhì)量濃度C₁（mg·mL^-1）為橫坐標(biāo)，得甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A₁?= 34.756C₁?- 0.006 9（R²?= 0.998 1），質(zhì)量濃度在0 ～ 0.02 mg·mL^-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。分別取“2.2”項(xiàng)中不同截留分子量段的凍干粉約50 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶，用蒸餾水溶解定容，搖勻后精密量取5 mL置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度、搖勻，得不同截留分子量段的供試品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行水溶性氨基酸的含量測(cè)定，各截留分子量段的供試品溶液平行測(cè)定3次，重復(fù)2組。

2.3.2 ?水溶性總蛋白的含量測(cè)定

采用Lowry法^[10]測(cè)定水溶性總蛋白的含量，以

吸光度A₂為縱坐標(biāo)，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度C₂

（mg·mL^-1）為橫坐標(biāo)，得牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的

回歸方程為A₂?= 1.839 5 C₂?+ 0.004 3（R²?= 0.998 1），

質(zhì)量濃度在0 ～ 0.4 mg·mL^-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。分別取“2.2”項(xiàng)中不同截留分子量段的凍干粉約50 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶，用蒸餾水溶解定容，得不同截留分子量段的供試品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行水溶性總蛋白的含量測(cè)定，各截留分子量段的供試品溶液平行測(cè)定3次，重復(fù)2組。

2.3.3 ?水溶性總多糖的含量測(cè)定

采用苯酚—硫酸法^[11]測(cè)定水溶性總多糖的含量，以吸光度A₃為縱坐標(biāo)，以葡萄糖質(zhì)量濃度C₃（mg·mL^-1）為橫坐標(biāo)，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為：

A₃= 9.816 7C₃?+ 0.019 4 （R²?= 0.998 2）

質(zhì)量濃度在0 ～ 0.1 mg·mL^-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。分別取“2.2”項(xiàng)中不同截留分子量段的凍干粉約50 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶，用蒸餾水溶解定容，搖勻后精密量取3 mL置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度、搖勻，得不同截留分子量段的供試品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行水溶性總多糖的含量測(cè)定，各截留分子量段的供試品溶液平行測(cè)定3次，重復(fù)2組。

2.4 ?SAPZFP、SAPZP不同截留分子量段的凍干粉的體外抗腫瘤研究

2.4.1 ?不同截留分子量段的凍干粉溶液的配制

取SAPZFP與SAPZP不同截留分子量段的凍干粉各約10 mg，精密稱定，溶于RPMI Medium Modified培養(yǎng)基，配成2 mg·mL^-1的初始藥物濃度，無菌環(huán)境下用0.22 μm針式過濾器濾過后，用RPMI Medium Modified培養(yǎng)基依次2倍稀釋至所需藥物濃度，用于體外抗腫瘤研究。

2.4.2 ?凍干粉溶液對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7抑制率的測(cè)定

采用MTT法進(jìn)行體外抗腫瘤研究，按照文獻(xiàn)^[12]方法接種細(xì)胞，配制陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、各劑量加藥組（每個(gè)劑量5個(gè)復(fù)孔），當(dāng)凍干粉溶液與細(xì)胞作用24 h后，進(jìn)行呈色、比色，根據(jù)OD值計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=

[1 -（OD_加藥組-OD_{調(diào)零組}）/（OD_{陰性對(duì)照組}?- OD_{調(diào)零組}）]×100%

2.5 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全文數(shù)據(jù)均以表示，SAPZFP與SAPZP兩樣本的顯著性檢驗(yàn)，在雙側(cè)F檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)。全文分析中，以P<0.05表示兩樣本有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。同時(shí)，借助SPSS 17.0中l(wèi)ogit模型計(jì)算體外抗腫瘤研究的IC₅₀。

3 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 ?SAPZFP、SAPZP不同截留分子量段的凍干粉的水溶性活性成分比較

3.1.1 ?截留分子量<5 kDa凍干粉的水溶性活性成分比較

SAPZFP與SAPZP截留分子量<5 kDa凍干粉的水溶性活性成分比較見表1。SAPZFP與SAPZP的各活性成分含量均有極顯著性差異，其中SAPZFP組水溶性氨基酸、水溶性總蛋白含量較SAPZP組升高，水溶性總多糖含量較SAPZP組降低。

3.1.2 ?截留分子量5 ?～ 10 kDa凍干粉的水溶性活性成分比較

SAPZFP與SAPZP截留分子量5 kDa ～ 10 kDa凍干粉的水溶性活性成分比較見表2。SAPZFP組與SAPZP組的各活性成分含量均有極顯著性差異，其中SAPZFP組水溶性氨基酸、水溶性總蛋白含量較SAPZP組升高，水溶性總多糖含量較SAPZP組降低，兩組截留分子量5 ～ 10 kDa凍干粉的活性成分含量變化規(guī)律與截留分子量< 5 kDa凍干粉的活性成分含量變化規(guī)律相同。

3.1.3 ?截留分子量> 10 kDa凍干粉的水溶性活性成分比較

SAPZFP與SAPZP截留分子量> 10 kDa凍干粉的水溶性活性成分比較見表3。SAPZFP組與SAPZP組比較，水溶性氨基酸、水溶性總多糖含量升高，且具有顯著性差異，而SAPZFP組與SAPZP組的水溶性總蛋白含量無顯著性差異。

3.2 ?SAPZFP、SAPZP不同截留分子量段的凍干粉的體外抗腫瘤研究

3.2.1 ?截留分子量<5 kDa凍干粉對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7的抑制作用

SAPZFP與SAPZP截留分子量<5 kDa凍干粉對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用見表4。在各試驗(yàn)藥物濃度下，SAPZFP組與SAPZP組對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用有顯著性差異，SAPZFP組對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7的IC₅₀為0.854 mg·mL^-1，SAPZP組對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的IC₅₀為1.128 mg·mL^-1。

3.2.2 ?截留分子量5 ～ 10 kDa凍干粉對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7的抑制作用

SAPZFP與SAPZP截留分子量5 ～ 10 kDa凍干粉對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用見表5。在試驗(yàn)藥物濃度（0.062 5～1 mg·mL^-1）范圍內(nèi)，SAPZFP組與SAPZP組均對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7有抑制作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。SAPZFP組對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7的IC₅₀為0.315 mg·mL^-1，SAPZP組對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7的IC₅₀為0.360 mg·mL^-1，兩者具有極顯著性的差異。

3.2.3 ?截留分子量> 10 kDa凍干粉對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7的抑制作用

SAPZFP與SAPZP截留分子量> 10 kDa凍干粉對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用見表6。SAPZFP組對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的IC₅₀為0.071 mg·mL^-1，SAPZP組對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的IC₅₀為0.115 mg·mL^-1。在試驗(yàn)藥物濃度（0.031 25 ～ 0.5 mg·mL^-1）范圍內(nèi)，SAPZFP組與SAPZP組對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制作用均呈現(xiàn)量效關(guān)系，且SAPZFP組對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的抑制率與SAPZP組比較，差異在各藥物濃度下均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

4 ?結(jié)論

超濾膜分離技術(shù)已在多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，其原理是依靠膜兩側(cè)壓力差為驅(qū)動(dòng)力，借助濾膜的微小孔徑對(duì)混合體系實(shí)現(xiàn)目的性分離純化和濃縮^[8]。在膜分離過程中，不發(fā)生相變、無溶劑污染，能夠較好保持分子的生物活性，但是，由于溶質(zhì)分子形態(tài)、溶質(zhì)與膜材料親和性及架橋作用的影響，不同分子量的溶質(zhì)只能被大體分開。相關(guān)研究表明，全蝎蛋白藥效組分由20 ～ 80個(gè)氨基酸組成，分子量分布于3 kDa左右或6 ～ 9 kDa或大于10 kDa^[3];周家容等^[4]研究表明，白術(shù)多糖的分子量多分布于10 kDa以下，且< 6 kDa和10 kDa ～ 30 kDa分子量的多糖具有較好生物活性;陳振華等^[5]綜述中兩種白頭翁糖蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量均大于10 kDa。故本研究選用公稱分子量截留值為10 kDa和5 kDa的超濾系統(tǒng)進(jìn)行兩步超濾研究，基本上可將主要活性成分通過超濾加以區(qū)分研究。

在各種藥物的篩選中，IC₅₀常作為標(biāo)志藥效的重要定量指標(biāo)。文中SAPZFP與SAPZP不同截留分子量段的凍干粉均對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7具有抑制作用，其中截留分子量> 10 kDa凍干粉的抗腫瘤活性最強(qiáng)。通過比較，SAPZFP組的各分子量段的IC₅₀均低于SAPZP組，說明球孢白僵菌雙向固體發(fā)酵技術(shù)可能在提高其抗腫瘤活性方面起到了一定的作用。究其原因首先是發(fā)酵過程使球孢白僵菌形成多種極具活性的次生代謝產(chǎn)物和數(shù)十種胞外酶，胞外酶使藥性基質(zhì)的細(xì)胞破壁，可增進(jìn)活性成分溶出，同時(shí)可對(duì)藥性基質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和生物轉(zhuǎn)化，從而獲得活性物質(zhì)。其次，球孢白僵菌產(chǎn)生的蛋白酶可將藥性基質(zhì)中的蛋白類大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為更多小分子物質(zhì)，從而產(chǎn)生活性更強(qiáng)的小分子肽類物質(zhì)^{[13，14]}。真菌在生長(zhǎng)的過程中可利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷合成自身的菌絲體，這可能是提取物中多糖增加的主要來源。通過對(duì)水溶性活性成分分析可知，發(fā)酵使截留分子量< 10 kDa的凍干粉水溶性氨基酸、水溶性總蛋白含量升高，水溶性總多糖含量降低;使截留分子量> 10 kDa的凍干粉水溶性氨基酸、水溶性總多糖含量升高，而水溶性總蛋白含量無顯著性差異。據(jù)此推測(cè)發(fā)酵過程使大分子蛋白質(zhì)部分肽鍵斷裂，產(chǎn)生更多具有游離氨基的多肽類成分;且發(fā)酵過程使非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類物質(zhì)，或小分子寡糖不斷聚合形成更大分子量的多糖。

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