邴狄祥 張琳 郭世堂 劉利利

摘 ?????要：根據(jù)不同生長(zhǎng)因子的促生長(zhǎng)效果，研究了沸石粉、麥飯石、番茄汁、菊粉對(duì)提高植物乳桿菌固體發(fā)酵終點(diǎn)益生菌數(shù)量的影響。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：在復(fù)合生長(zhǎng)因子番茄汁和菊粉添加量分別為1%、0.5%時(shí)，終點(diǎn)益生菌數(shù)量最高為137×10⁸ cfu/g，是對(duì)照組的6.5倍，是分別單獨(dú)添加時(shí)的2倍左右，實(shí)現(xiàn)了植物乳桿菌固體發(fā)酵的高密度培養(yǎng)，為下一步的低溫烘干制取高活性菌粉打下了基礎(chǔ)。

關(guān) ?鍵 ?詞：生長(zhǎng)因子;沸石粉;番茄汁;菊粉;高活性

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ921.1 ???????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2020）01-0212-04

Effect of Different Growth Factors?on Solid Fermentation

of Lactobacillus Plantarum

BING?Di-xiang， ZHANG?Lin， GUO?Shi-tang， LIU?Li-li

（COFCO Biotechnology Co.， Ltd.， Anhui Bangbu?233010， China）

Abstract： According to the growth promoting effect of different growth factors， the effect of zeolite powder， medical stone， tomato juice and inulin on increasing the number of terminal probiotics of Lactobacillus plantarum in solid fermentation was?studied. The results showed that，when?the dosages of compound growth factor tomato juice and inulin were 1% and 0.5%， respectively， the maximum number of terminal probiotics was 137×10⁸ cfu/g， which was 6.5 times as much as that of control group， and about 2 times as much as that of single addition. The high-density culture of Lactobacillus plantarum solid fermentation was realized， which laid a solid foundation for next low-temperature drying to produce high-activity bacterial powder.

Key words：?Growth factor;?Zeolite; Tomato juice;?Inulin;?High activity

植物乳桿菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性乳桿菌，在自然界中廣泛存在，厭氧或兼性厭氧，菌種為直或彎的桿狀，單個(gè)、有時(shí)成對(duì)或成鏈狀，最適pH 6.5左右，屬于同型發(fā)酵乳酸菌（圖1）。

植物乳桿菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素、有機(jī)酸、雙乙酞、過(guò)氧化氫等多種天然抑菌物質(zhì)，具有平衡腸道內(nèi)菌群，提高免疫力，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收等功能^[1]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第105號(hào)公布的允許使用的飼料添加劑品種目錄中，飼料級(jí)微生物添加劑有12種，植物乳桿菌是其中一種。在飼料中添加植物乳桿菌菌劑，其能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用在胃腸道內(nèi)占位、定植，抑制致病菌對(duì)胃腸道侵害，不僅可以改善動(dòng)物腸道生態(tài)，還可以用于飼料的防腐，是目前公認(rèn)的具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值的天然生物性防腐劑^[2，3]。

本文試圖從不同生長(zhǎng)因子特有的促生長(zhǎng)功能出發(fā)，以篩選出最佳生長(zhǎng)因子及其最適添加量。各促生長(zhǎng)因子主要功能如下：

沸石粉：硅鋁酸鹽礦物，可以很好地平衡pH值，同時(shí)含有離子狀態(tài)的常量元素和大部分微量元素，易于吸收。

麥飯石：麥飯石是一種高效無(wú)毒的藥物礦石，含有多種對(duì)生物生長(zhǎng)發(fā)育有益的常量元素、微量元素以及被稱(chēng)作動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的稀土元素和微量氨基酸^[4]。

番茄汁：番茄含有多種活性物質(zhì)，?如維生素C、黃酮、多酚、番茄紅素、有機(jī)酸、氨基酸、礦物質(zhì)、類(lèi)胡蘿卜素和維生素等^[5]。

菊粉：水溶性膳食纖維，可刺激微生物代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對(duì)益生菌的生長(zhǎng)起到一定的促進(jìn)作用^[6]。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌種與培養(yǎng)基

菌種：中糧生物科技股份有限公司保存菌種。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，吐溫80 1.0 mL，牛肉提取物10.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，酵母提取物5.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，MnSO₄·H₂O 0.05 g，K₂PO₄?2.0 g，配成1 000 mL的溶液，用NaOH調(diào)pH值至6.5，121 ℃，滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基： 蛋白胨10.0 g，吐溫80 1.0 mL，牛肉提取物10.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖5.0，乙酸鈉5.0 g， 酵母提取物5.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，MnSO₄·H₂O 0.05 g，K₂PO₄?2.0 g，瓊脂16 g，配成1 000 mL的溶液，用NaOH調(diào)pH值至6.5，121 ℃，滅菌20 min。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備

AB204-S電子分析天平、YX600W臥式全自動(dòng)高壓滅菌鍋、海德雙人單面超凈工作臺(tái)、722型分光光度計(jì)、LRH-150電熱恒溫生化培養(yǎng)箱、XH-C旋渦混合器、Seveneasy臺(tái)式pH計(jì)、Innova43往復(fù)式搖瓶柜。

1.2 ?方法

1.2.1 ?液體種子培養(yǎng)

將保存在超低溫冰箱中的植物乳桿菌提前0.5 h自然解凍活化，之后按照4%接種量接種于121?℃、20?min滅菌，冷卻至室溫的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜止培養(yǎng)，測(cè)種子液pH、OD值和13 h后益生菌數(shù)量^[7]。

（1）菌液OD₆₀₀值的測(cè)定

將培養(yǎng)好的菌液，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min（4 ℃），離心10 min，收集菌體，生理鹽水洗滌2次，懸浮于等體積生理鹽水，取樣稀釋26倍后，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD值。

（2）益生菌數(shù)量的測(cè)定

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，取1 mL菌液以10倍依次遞增稀釋至適宜稀釋度，選擇3個(gè)合適稀釋度，各取1 mL稀釋液于空的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，各傾注15 mL已溶化并冷卻至45 ℃左右的培養(yǎng)基，立即放在桌上混勻，每個(gè)稀釋度做3個(gè)培養(yǎng)皿，凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)24h取出記錄菌落數(shù)。

具體操作嚴(yán)格按照GB4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》執(zhí)行。

1.2.2 ?固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制

將麩皮、玉米芯粉、稻殼粉分別粉碎過(guò)60目篩后，按麩皮∶玉米芯粉∶稻殼粉=1∶2∶2混合均勻。玉米漿、葡萄糖、大豆蛋白胨及磷酸氫二鉀加水溶解后與上述固體原料再次混合均勻，加水至45%水分， 用NaOH調(diào)pH值至6.5后得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.3 ?促生長(zhǎng)因子的篩選

采用單因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將沸石粉、麥飯石、番茄汁、菊粉分別按0.5%、1.5%的添加量加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基，121?℃、20?min滅菌，冷卻至室溫，接種10%的液體種子，同時(shí)做空白對(duì)照試驗(yàn)，空白對(duì)照組不加促生長(zhǎng)因子。以相同周期的活菌數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出具有明顯增殖效果的生長(zhǎng)因子（圖2）^[8]。

1.2.4 ?復(fù)合生長(zhǎng)因子添加量的確定

將篩選得到的兩種增殖效果最好的生長(zhǎng)因子按不同配比加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，進(jìn)行固體發(fā)酵試驗(yàn)，運(yùn)用方差分析，以相同周期的活菌數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選得到復(fù)合促生長(zhǎng)因子的最適添加量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?種子培養(yǎng)周期確定

從圖3可以看出，液體種子培養(yǎng)16～17 h時(shí)pH降至4.0以下，之后緩慢降低;OD值達(dá)到最大值后基本保持穩(wěn)定狀態(tài)，可認(rèn)為菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。

由圖4益生菌數(shù)量變化趨勢(shì)可以看出，液體種子培養(yǎng)至16～17 h時(shí)，益生菌數(shù)量在45×10⁸ cfu/g左右且趨于穩(wěn)定，結(jié)合圖1可認(rèn)為此時(shí)種子到達(dá)穩(wěn)定期，下步試驗(yàn)可選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期前期的液體種子接種發(fā)酵，即液體種子培養(yǎng)14～17 h。

2.2 ?促生長(zhǎng)因子的初步篩選

從表1可以看出，不同促生長(zhǎng)因子對(duì)固體發(fā)酵的影響存在著周期上的明顯差異。

具體促生長(zhǎng)表現(xiàn)為：

沸石粉和麥飯石在80 h全發(fā)酵周期內(nèi)對(duì)益生菌增殖的促進(jìn)作用表現(xiàn)平穩(wěn)，其中沸石粉添加組略好于麥飯石添加組，0.5%、1.5%的添加比例對(duì)發(fā)酵益生菌數(shù)量增殖影響不顯著，80 h時(shí)益生菌數(shù)量最高為對(duì)照組的1.7倍;

番茄汁添加組發(fā)酵前期益生菌數(shù)量較對(duì)照組增殖明顯，48～64 h后趨于穩(wěn)定，80 h時(shí)益生菌數(shù)量最高為對(duì)照組的3.4倍;

菊粉添加組發(fā)酵前期益生菌數(shù)量較對(duì)照組無(wú)明顯提高，48 h后開(kāi)始增殖較為迅速，至80 h時(shí)仍在快速增殖，最高為對(duì)照組的3.1倍。

利用Minitab進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，沸石粉、麥飯石與空白組對(duì)照相比，P值分別為0.212和0.073，均大于0.05，故認(rèn)為兩者對(duì)終點(diǎn)益生菌數(shù)量影響不顯著。而番茄汁和菊粉的P值分別為0.017和0.039，小于0.05，可認(rèn)為番茄汁和菊粉相對(duì)空白對(duì)照組對(duì)終點(diǎn)益生菌數(shù)量影響都極為顯著。鑒于此，下步復(fù)合促生長(zhǎng)因子試驗(yàn)時(shí)擬采用番茄粉和菊粉的組合，同時(shí)將發(fā)酵周期延長(zhǎng)至96 h（表2、圖5-6）。

2.3 ?復(fù)合促生長(zhǎng)因子添加量的確定

從表3可以看出，96 h時(shí)益生菌數(shù)量最高可達(dá)166×10⁸ cfu/g，基本同80 h時(shí)的益生菌數(shù)量持平，故可認(rèn)為固體發(fā)酵80 h時(shí)已達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)，此時(shí)益生菌數(shù)量最高為165×10⁸ cfu/g，可結(jié)束發(fā)酵，經(jīng)低溫烘干、粉碎后制取植物乳桿菌菌粉。

利用Minitab進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，不同添加量情況下番茄粉和菊粉P值分別為0.001和0.011，均小于0.05，作為促生長(zhǎng)因子兩者對(duì)終點(diǎn)益生菌數(shù)量影響顯著，這同單因子方差分析結(jié)果保持一致。而兩者交互作用時(shí)的P值為0.776，大于0.05，可認(rèn)為兩者交互作用不存在（表4）。

由主效應(yīng)圖（圖7），進(jìn)一步分析可得知，番茄汁和菊粉添加量均為1.5%時(shí)，為該組合效應(yīng)的最佳水準(zhǔn)。但由于兩者交互作用不顯著，此時(shí)不設(shè)定最佳水準(zhǔn)。最終選取番茄粉、菊粉的添加量分別為1.0%、0.5%時(shí)，在生產(chǎn)成本不明顯增加的前提下，又可獲得較高的終點(diǎn)益生菌數(shù)量，80 h時(shí)益生菌數(shù)量可達(dá)137×10⁸ cfu/g，為對(duì)照組的6.5倍。

3 ?結(jié)論

通過(guò)不同促生長(zhǎng)因子對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵的影響，得出試驗(yàn)使用的4種促生長(zhǎng)因子對(duì)固體發(fā)酵都有不同程度的增殖作用，并進(jìn)一步采用對(duì)固體發(fā)酵增殖效果最好的番茄汁和菊粉作為復(fù)合促生長(zhǎng)因子，在綜合考慮生產(chǎn)成本和終點(diǎn)益生菌數(shù)量的情況下，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1.0%番茄粉、0.5%菊粉時(shí)，終點(diǎn)益生菌數(shù)量最高可達(dá)到137×10⁸cfu/g，是對(duì)照組的6.5倍，是分別單獨(dú)添加時(shí)的2倍左右，實(shí)現(xiàn)了植物乳桿菌固體發(fā)酵的高密度培養(yǎng)，為下一步的低溫烘干制取高活性菌粉打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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