鄭 茂 綜述,劉 曉,袁成良 審校
(四川省德陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川德陽 618000)
寨卡病毒屬于黃病毒科黃病毒屬,為單股正鏈RNA包膜病毒,直徑為40~70 nm,核酸長(zhǎng)度約10.7 kb,分別編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M、E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)[1]。寨卡病毒進(jìn)入人體后,多以隱性感染為主,引起低熱、皮疹、結(jié)膜炎及關(guān)節(jié)肌肉痛等非特異性臨床癥狀,易與登革熱病毒、基孔肯雅熱病毒感染等相混淆,早期診斷十分困難。寨卡病毒能通過胎盤和血腦屏障,孕婦感染后可能導(dǎo)致胎兒嚴(yán)重先天性缺陷,其中以新生兒小頭畸形最為常見。宮內(nèi)感染寨卡病毒可能會(huì)使胎兒神經(jīng)發(fā)育遲緩,膀胱及腎臟發(fā)育不全,成人感染寨卡病毒可能會(huì)引起吉蘭-巴雷綜合征(GBS)。因此,建立靈敏且特異的寨卡病毒早期檢測(cè)技術(shù),對(duì)快速診斷病毒感染尤為必要,本文簡(jiǎn)要闡述了寨卡病毒的流行病學(xué)特征,并重點(diǎn)對(duì)近年來寨卡病毒的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述。
寨卡病毒感染的患者或其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物均可作為病毒傳染源,通過蚊媒傳播、母嬰傳播、性傳播等方式擴(kuò)散[2]。寨卡病毒最早于1947年在東非烏干達(dá)寨卡森林的恒河猴體內(nèi)分離成功,并因此而得名,不久后在非洲、太平洋島國等地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)人感染寨卡病毒的報(bào)道;2007年,在西太平洋的雅浦群島出現(xiàn)首次寨卡病毒大范圍疫情;2015年3月,巴西發(fā)生史上最大規(guī)模的寨卡病毒暴發(fā)、流行,導(dǎo)致超過20萬例患者感染,隨后在南美洲迅速傳播;2016年2月1日,WHO宣布寨卡病毒感染疫情已成為“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”,并于2016年11月18日將其轉(zhuǎn)為長(zhǎng)期機(jī)制應(yīng)對(duì)[2]。
2016年2月,我國發(fā)現(xiàn)首例輸入性寨卡病毒感染病例,隨后廣東、浙江、江蘇、北京、河南等省市陸續(xù)報(bào)道了輸入性病例,其中廣東省出入境人流量巨大,是我國最主要的流行地區(qū)[3]。如果不及時(shí)控制輸入性寨卡病毒疫情,極可能造成暴發(fā)、流行。根據(jù)寨卡病毒基因組序列的不同,將其分為亞洲型和非洲型,兩種亞型同源性在90%左右。亞洲型寨卡病毒可導(dǎo)致新生兒小頭畸形、成人GBS等嚴(yán)重疾病,尚未見非洲型寨卡病毒導(dǎo)致上述疾病的報(bào)道,我國目前分離的所有寨卡病毒株均為亞洲型,總體變異率不高[4]。
2.1病毒分離培養(yǎng) 病毒分離培養(yǎng)是應(yīng)用細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)從感染者血液、尿液、唾液、羊水、精液等各類標(biāo)本中分離出病毒,被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。寨卡病毒常用細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物體內(nèi)接種等方式進(jìn)行分離。多種細(xì)胞系均適合于寨卡病毒的培養(yǎng),如人胚腎細(xì)胞HEK293、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero等。動(dòng)物體內(nèi)接種是最早應(yīng)用的病毒培養(yǎng)方法,將病毒接種于易感動(dòng)物的皮下、腹腔、顱內(nèi)等部位,從而實(shí)現(xiàn)病毒的快速增殖,我國報(bào)道的首例寨卡病毒即采用乳鼠顱內(nèi)接種得以成功分離[5]。然而,寨卡病毒屬于第3類病原體,其分離培養(yǎng)必須在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,故普通實(shí)驗(yàn)室難以開展。
80%以上的寨卡病毒感染為隱性感染,送檢的臨床標(biāo)本中病毒載量往往偏低,需要經(jīng)過多次培養(yǎng)傳代才可能分離到病毒。因此,病毒分離培養(yǎng)雖然特異度高,具有確診意義,但靈敏度低、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),難以實(shí)現(xiàn)大批量標(biāo)本的快速檢測(cè),目前僅限于科研或其他鑒定方法的復(fù)核。
2.2血清學(xué)檢測(cè)
2.2.1單克隆抗體檢測(cè) 人體感染寨卡病毒3~5 d即可出現(xiàn)特異性IgM抗體,通過檢測(cè)IgM抗體可對(duì)病毒感染進(jìn)行早期診斷。IgG抗體在血清中出現(xiàn)較晚,存在時(shí)間長(zhǎng),若IgG抗體檢測(cè)陽性則可判斷為再次感染或慢性感染。NS1蛋白是寨卡病毒7種非結(jié)構(gòu)蛋白中唯一能以可溶性六聚體形式分泌至感染者外周血,在感染早期即可出現(xiàn)且存在時(shí)間長(zhǎng)的蛋白。BOSCH等[6]采用重組NS1蛋白免疫小鼠篩選出一系列特異性抗體,建立了針對(duì)NS1抗原的快速檢測(cè)試紙,靈敏度和特異度可分別達(dá)81.0%、86.0%。KIM等[7]進(jìn)一步研發(fā)出寨卡病毒首個(gè)單克隆抗體快速檢測(cè)試劑盒,作用靶點(diǎn)是E蛋白和NS1蛋白的IgG或IgM抗體,IgG抗體的檢測(cè)靈敏度和特異度分別為99.0%、99.3%,IgM抗體的檢測(cè)靈敏度和特異度分別為96.7%、98.7%,且與登革熱病毒IgG和IgM抗體的交叉反應(yīng)率僅為16.7%、5.6%,可見該試劑盒使用簡(jiǎn)便,且靈敏度和特異度均較高。我國學(xué)者向夢(mèng)蓉等[8]設(shè)計(jì)的NS1抗原免疫層析膠體金試紙可成功區(qū)分寨卡病毒和登革熱病毒,同樣具有較高的靈敏度和特異度。單克隆抗體檢測(cè)技術(shù)日趨成熟,有望作為全球寨卡病毒流行地區(qū)的即時(shí)診斷和大規(guī)模篩查工具,但后期也仍需大量臨床樣本的持續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)。
2.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 根據(jù)ELISA原理的不同可分為間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙抗體夾心法等。ELISA檢測(cè)病毒感染的優(yōu)點(diǎn)是成本低、易操作、對(duì)設(shè)備要求低、可廣泛應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室,故成為目前寨卡病毒最常見的血清學(xué)檢測(cè)方法。ELISA檢測(cè)寨卡病毒的特異性靶位主要集中于NS1蛋白和E蛋白。研究顯示,通過構(gòu)建NS1基因的原核表達(dá)質(zhì)粒,利用大腸桿菌表達(dá)重組NS1蛋白或構(gòu)建NS1基因的真核表達(dá)載體,利用HEK293F細(xì)胞表達(dá)重組NS1蛋白純化蛋白后免疫小鼠,均能制備出高純度的抗NS1單克隆抗體[9-10],這為建立ELISA檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)。
中國疾病預(yù)防控制中心的科研團(tuán)隊(duì)[11]選取寨卡病毒4種抗原(E蛋白胞外區(qū)、NS1蛋白、C蛋白、rE Ⅲ蛋白)進(jìn)行重組表達(dá)和純化,以間接法檢測(cè)相應(yīng)的IgG抗體,發(fā)現(xiàn)E蛋白胞外區(qū)和NS1蛋白的檢測(cè)靈敏度和特異度均達(dá)到較高水平,適合作為寨卡病毒的靶抗原。此外,該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)以NS1蛋白作為檢測(cè)抗原,采用間接法檢測(cè)感染者血清、尿液和唾液標(biāo)本中的IgA抗體,可以作為IgG抗體的替代指標(biāo)[12]。新加坡生物工程與納米技術(shù)研究所的科研團(tuán)隊(duì)[13]以單鏈DNA作為結(jié)合靶位點(diǎn),建立了針對(duì)寨卡病毒NS1蛋白的ELISA雙抗體夾心法,具有極高的靈敏度,檢出限可低至0.1 ng/mL。
E蛋白是寨卡病毒感染和復(fù)制的必需蛋白質(zhì),參與病毒與宿主受體細(xì)胞的識(shí)別,具有3種不同結(jié)構(gòu)域,包括β桶狀的Ⅰ區(qū)(E Ⅰ)、參與E蛋白二聚體形成的Ⅱ區(qū)(E Ⅱ)及具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的Ⅲ區(qū)(E Ⅲ),其中E Ⅰ/E Ⅱ可作為鑒定寨卡病毒的特異性B細(xì)胞表位[14]。柳紅妙等[15]設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)寨卡病毒E蛋白的非包被ELISA,該方法與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)結(jié)果基本一致,且與登革熱病毒無交叉反應(yīng),在抗寨卡病毒藥物篩選方面具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)。
除了常見的NS1蛋白和E蛋白的檢測(cè)外,國外學(xué)者利用多肽微陣列的篩檢方法發(fā)現(xiàn)寨卡病毒NS2b蛋白中1段20個(gè)氨基酸的多肽序列(NS2b-20),用于ELISA檢測(cè)的靈敏度和特異度可達(dá)96.0%、95.9%[16]。以該段特異性抗原多肽序列作為靶抗原,我國學(xué)者王天禹等[17]建立了一種高通量、高靈敏度的熒光素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(LISA),應(yīng)用于寨卡病毒的IgG抗體檢測(cè),為實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化檢測(cè)提供了基礎(chǔ),適合寨卡病毒感染的免疫學(xué)診斷與流行病學(xué)調(diào)查。此外,近期PAWLEY等[18]從巴西寨卡病毒感染者中分離出一種特異性抗體,可以直接結(jié)合寨卡病毒免疫顯性表位,從而設(shè)計(jì)出一種高效的ELISA檢測(cè)方法,適合多種體液標(biāo)本檢測(cè),如尿液、唾液、血清和全血,其中尿液標(biāo)本無基質(zhì)效應(yīng)且采集方便,可作為優(yōu)先檢測(cè)標(biāo)本。由此可見,多種寨卡病毒靶抗原可以應(yīng)用ELISA檢測(cè),感染者的各類體液標(biāo)本也適合作為檢測(cè)對(duì)象,有效拓展了血清學(xué)方法在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。
2.2.3中和試驗(yàn) 中和試驗(yàn)是病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合后,失去對(duì)易感動(dòng)物致病力的試驗(yàn)方法,主要檢測(cè)待檢標(biāo)本中病毒特異性中和抗體的水平。蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)在檢測(cè)寨卡病毒中和抗體方面的應(yīng)用較為廣泛。PRNT以使蝕斑數(shù)減少50%的血清稀釋度作為效價(jià),在確認(rèn)病毒陽性標(biāo)本上更具特異性。NASCIMENTO等[19]報(bào)道PRNT尤其適合于寨卡病毒感染者恢復(fù)期標(biāo)本的特異性檢測(cè)。因此,美國疾病控制和預(yù)防中心(CDC)建議寨卡病毒IgM抗體ELISA檢測(cè)陽性的血清標(biāo)本應(yīng)通過PRNT進(jìn)行確認(rèn)。
與病毒分離培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)相似,雖然PRNT特異度高,但試驗(yàn)過程非常耗時(shí)、耗力。為了彌補(bǔ)PRNT這一不足,KOISHI等[20]研發(fā)了基于高通量圖像熒光的寨卡病毒中和試驗(yàn),該方法檢測(cè)速度更快,并實(shí)現(xiàn)了多標(biāo)本同時(shí)檢測(cè),可用于寨卡病毒感染的臨床診斷確認(rèn)及臨床疫苗研究。
2.2.4其他血清學(xué)檢測(cè)技術(shù) LAURI等[21]報(bào)道了一種用于診斷寨卡病毒感染的新型血清學(xué)方法,利用時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET),用兩種發(fā)色基團(tuán)分別標(biāo)記NS1蛋白和細(xì)菌L蛋白,再與特定分子蛋白結(jié)合。這種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的血清學(xué)方法適用于診斷寨卡病毒感染,并易與其他黃病毒感染進(jìn)行鑒別。此外,還有研究報(bào)道可通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定血清中的寨卡病毒中和抗體[22]。
2.3核酸檢測(cè)
2.3.1反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR) 寨卡病毒感染者血液、尿液、唾液、精液、羊水或胎盤組織等標(biāo)本中均可檢出病毒RNA[23]。不同類型標(biāo)本檢出時(shí)間各有不同,血清在病毒感染后7 d內(nèi)可被檢出,尿液為20 d內(nèi),精液可長(zhǎng)達(dá)60 d。RT-PCR技術(shù)是從核酸水平檢測(cè)病毒RNA,相對(duì)于病毒分離培養(yǎng),鑒定周期縮短。在患者感染早期,特別是臨床癥狀出現(xiàn)的1周內(nèi),若檢測(cè)到寨卡病毒RNA即可快速確診[24]。但常規(guī)RT-PCR首先需要對(duì)病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,再進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增,最后通過凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物,該方法操作較為煩瑣,只能對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析,且易被污染,假陽性率偏高,目前已逐步被其他PCR技術(shù)代替。
2.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) RT-qPCR采用插入特異性熒光探針,實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒RNA的定量分析,具有操作簡(jiǎn)便,靈敏度、特異度高等特點(diǎn),無需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)分析,故可有效避免人為操作帶來的污染,與常規(guī)RT-PCR相比,極大提高了檢測(cè)效率。在巴西東南部寨卡病毒流行區(qū)域,AYRES等[25]通過RT-qPCR在埃及伊蚊、白紋伊蚊和庫蚊中檢測(cè)出寨卡病毒RNA,直接證實(shí)了蚊媒傳播是寨卡病毒感染的主要途徑。
RT-qPCR根據(jù)采集熒光方法的不同主要分為染料法和探針法。染料法是利用某些熒光染料(如SYBR Green)與雙鏈DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),從而被熒光檢測(cè)器檢出。XU等[26]通過優(yōu)化基于SYBR Green探針的PCR引物設(shè)計(jì)后,實(shí)現(xiàn)了RT-qPCR一步法檢測(cè)寨卡病毒RNA,甚至可以檢測(cè)低至1 PFU/mL滴度的寨卡病毒。探針法是能與目的片段特異性結(jié)合的熒光探針,用相應(yīng)酶水解探針后釋放熒光,從而實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增產(chǎn)物,最為常用的是TaqMan探針。JUDICE等[27]通過研發(fā)一種新型TaqMan探針,使RT-qPCR在檢測(cè)寨卡病毒NS5基因方面達(dá)到更高的靈敏度,并且在血液和尿液標(biāo)本中的檢測(cè)結(jié)果高度一致。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部核酸交叉污染可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈假陽性,為了提高寨卡病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性,也可對(duì)E基因、NS5基因等多個(gè)分子靶位同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),以涵蓋寨卡病毒多個(gè)譜系。
趙航等[28]通過分析寨卡病毒全基因組核酸序列,以NS5基因片段設(shè)計(jì)特異性引物,構(gòu)建重組質(zhì)粒,建立了基于RT-qPCR的寨卡病毒核酸檢測(cè)的高靈敏度方法,且該方法與登革熱病毒、丙型肝炎病毒無交叉反應(yīng)。此外,針對(duì)亞洲型和非洲型寨卡病毒,我國學(xué)者根據(jù)兩種亞型病毒基因組序列特征,分別設(shè)計(jì)了相應(yīng)的RT-qPCR檢測(cè)技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒載量的絕對(duì)定量,可有效用于感染者的病原分型、早期診斷[29]。
針對(duì)RT-qPCR在極低寨卡病毒載量檢測(cè)方面的不足,南方醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)[30]研發(fā)了一種微滴式數(shù)字PCR,在極低病毒載量的臨床標(biāo)本中也表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度。此外,廣東醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)[31]對(duì)PCR操作過程進(jìn)行簡(jiǎn)化,自主研發(fā)了直接反轉(zhuǎn)錄定量PCR(dirRT-qPCR),無需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理,可直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中的寨卡病毒RNA,檢測(cè)限可低至95個(gè)RNA,且標(biāo)本量?jī)H需5 μL。此外,dirRT-qPCR具有高通量和即時(shí)診斷的能力,還可以擴(kuò)展用于其他病毒檢測(cè),顯現(xiàn)出床旁檢測(cè)及快速現(xiàn)場(chǎng)篩查的巨大潛力。
2.3.3其他基因擴(kuò)增技術(shù) 近年來,在傳統(tǒng)RT-PCR基礎(chǔ)上,科學(xué)家們研發(fā)出了一系列高效、靈敏的基因擴(kuò)增技術(shù),如鏈侵入式擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)等,其中又以LAMP技術(shù)應(yīng)用較為廣泛。LAMP技術(shù)是在單一恒定溫度下(通常為65 ℃),使用4~6個(gè)引物,通過鏈置換DNA聚合酶快速擴(kuò)增獲得新DNA,在1 h內(nèi)即可完成檢測(cè)[32],且該方法僅需一臺(tái)普通加熱儀,可用于快速檢測(cè)及在一些資源匱乏地區(qū)對(duì)病毒的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。鐘響等[33]針對(duì)寨卡病毒NS5基因設(shè)計(jì)并篩選的LAMP引物可在64 ℃ 50 min內(nèi)特異性擴(kuò)增NS5基因,并且與基孔肯雅熱病毒、登革熱病毒、黃熱病毒均無交叉反應(yīng),檢測(cè)限達(dá)10 copy/μL,是普通PCR的100倍,可見改進(jìn)后的LAMP技術(shù)的靈敏度得到大幅提升。近期,ESTRELA等[34]在Bst DNA聚合酶基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化LAMP技術(shù)檢測(cè)條件,將寨卡病毒檢測(cè)時(shí)間縮短至10 min。對(duì)于寨卡病毒感染的急性期,CASTRO等[35]報(bào)道還可通過LAMP技術(shù)檢測(cè)感染者唾液標(biāo)本,從而實(shí)現(xiàn)快速診斷。
2.4生物傳感器檢測(cè) 生物傳感器是一種將生物元件與被測(cè)物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的物理化學(xué)效應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器。隨著計(jì)算機(jī)軟件模擬技術(shù)的迅速發(fā)展,生物傳感器技術(shù)已擴(kuò)展到了病毒早期診斷的領(lǐng)域。MOCO等[36]使用石墨電極平臺(tái)研發(fā)了一種電化學(xué)生物傳感器,檢測(cè)寨卡病毒RNA僅需20 min,檢測(cè)限達(dá)1.72 copy/mL,且該傳感器在60 d內(nèi)均具有良好的穩(wěn)定性。也有學(xué)者使用表面印跡聚合物和氧化石墨烯復(fù)合材料,研發(fā)出新型寨卡病毒電化學(xué)生物傳感器,檢測(cè)限甚至可達(dá)到RT-qPCR的水平[37]。有文獻(xiàn)報(bào)道了一種基于芯片的電位傳感器,采用3D分子印跡技術(shù)可快速檢測(cè)緩沖液中低至10 PFU/mL滴度的寨卡病毒[38]。
此外,針對(duì)寨卡病毒NS1蛋白,TAKEMURA等[39]研發(fā)出一種等離子體共振放大免疫熒光生物傳感器,可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。類似研究中,ZHANG等[40]還報(bào)道了一種基于生物檢測(cè)信號(hào)的新型乳液凝集試驗(yàn),該試驗(yàn)簡(jiǎn)便、廉價(jià),適合于寨卡病毒NS1蛋白的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
寨卡病毒是黃病毒屬中第一個(gè)被報(bào)道能通過母嬰傳播、性傳播的病毒。目前國內(nèi)外尚無抗寨卡病毒感染的靶向藥物,病毒疫苗也仍處于臨床試驗(yàn)階段。因此,建立經(jīng)濟(jì)、快速、特異度高的寨卡病毒檢測(cè)方法,對(duì)病毒感染的早期診斷尤為重要。病毒分離培養(yǎng)雖然是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但培養(yǎng)要求高,應(yīng)用極為局限,常規(guī)條件下難以開展,故普通實(shí)驗(yàn)室多通過血清學(xué)或核酸檢測(cè)寨卡病毒感染。血清學(xué)方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、易于推廣,但仍存在一定程度的假陰性及與其他黃病毒屬的交叉反應(yīng),故常將其與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,從而提高寨卡病毒的診斷效能。新興的生物傳感器技術(shù),雖然初期檢測(cè)寨卡病毒靈敏度方面與PCR技術(shù)相比尚有一定差距,但隨著該技術(shù)的日益發(fā)展,目前其檢測(cè)限已達(dá)到實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)要求,且其快速和高通量檢測(cè)潛力是常規(guī)方法無法比擬的,應(yīng)用空間極為廣闊,有望取代現(xiàn)有的主流檢測(cè)技術(shù)。隨著病毒檢測(cè)技術(shù)及病毒基因組學(xué)的蓬勃發(fā)展,寨卡病毒在不遠(yuǎn)的將來也能實(shí)現(xiàn)可預(yù)防、可控制、易治療。
國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2020年12期