鄧寬平 楊秀偉 楊勝偉 楊選輝 張永剛 陳榮輝 徐德林

摘要：為探索樹莓種內(nèi)個體之間和不同樹莓品種間的遺傳特性，應用SSR標記開展樹莓的遺傳多樣性分析。對引進、收集的樹莓種質(zhì)資源進行基因組DNA提取，然后應用PCR擴增和PAGE電泳檢測篩選材料間的多態(tài)性SSR標記，利用NTsys 2.10 e軟件進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，從75對SSR標記中篩選出22對多態(tài)性良好的標記引物，共擴增得到285個條帶，引物擴增出的清晰條帶數(shù)為7～25個，平均每對引物的多態(tài)性比率為96.8%。對引物的擴增結(jié)果進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，樹莓樣品在遺傳系數(shù)為0.71的水平上共聚類為兩大類群，第一類包括21份樹莓樣品，其中除sm46、sm85、sm102從遼寧省農(nóng)業(yè)科學院引種外，其余樹莓樣品均來自貴州省，從遼寧省農(nóng)業(yè)科學院引種的22份樹莓樣品，除上述歸為第一類的3份外，其余的與貴州省遵義市習水土城、貴州省雷山縣永樂、從廣東省引種的樹莓樣品歸為第二大類。45份樹莓具有較豐富的遺傳多樣性，篩選出的SSR可有效應用于貴州省樹莓品種的遺傳多樣性研究。

關(guān)鍵詞：樹莓;SSR標記;種質(zhì)資源;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號：S663.202?文獻標志碼：A?文章編號：1002-1302（2020）21-0062-06

樹莓（Rubus corchorifolius L.），別稱懸鉤子、托盤、馬林等，為薔薇科（Rosaceae）樹莓屬（Rubus，別稱懸鉤子屬）的多年生灌木漿果類植物，其果實具有外觀鮮艷、口感細膩、風味芳香等特點，除用作生食果品外，還可加工制成果醬、果酒、果汁、果凍、果羹及蜜餞等食品。此外，樹莓還是藥用植物，果實、莖、根皆可入藥，主要功效為醒酒、止渴、止血、解毒、鎮(zhèn)痛等。樹莓屬植物在我國27個省（自治區(qū)）均有分布，并以西南地區(qū)分布最為集中，其中分布最廣泛的省份是貴州省、云南省、四川省、廣西壯族自治區(qū)、廣東省、福建省，其次為湖南省、湖北省及西藏自治區(qū)、陜西省、甘肅省等[1-3]，且是貴州省山地農(nóng)業(yè)開發(fā)的重要經(jīng)濟作物。

我國約在20世紀80年代開始大面積栽培樹莓，但品種選育工作尚處于起步階段，再加上樹莓育種過程中，會受到多倍體、無融合生殖、花粉不親和、種子發(fā)芽率低等遺傳問題的影響[4-5]，樹莓育種工作變得漫長而復雜。因此，結(jié)合地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展實際，選擇根系發(fā)達、抗旱能力強的優(yōu)良樹種對改善樹莓種植業(yè)結(jié)構(gòu)、增加農(nóng)民受益、帶動地方經(jīng)濟發(fā)展等具有重大意義?；跇漭慕?jīng)濟和藥用價值以及育種過程中所遭遇的亟需解決的問題，從分子水平探討樹莓屬內(nèi)親緣關(guān)系，對種質(zhì)資源進行遺傳分析和種質(zhì)評價，可進一步了解樹莓親緣關(guān)系和遺傳差異，為樹莓遺傳多樣性研究、保育策略制定和雜交育種提供理論依據(jù)。

簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）是一類一般由1～6個堿基組成的基元串聯(lián)重復而成的DNA序列[6]。不同等位基因間的重復數(shù)存在豐富的差異，且重復序列兩側(cè)多是相對保守的單拷貝序列，可以通過設(shè)計特異引物，對基因組總DNA進行PCR擴增[7-8]，擴增片段的長度多態(tài)性可用作分子標記。SSR標記是以SSR多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標記，與其他分子標記相比，具有多態(tài)性高、共顯性、重復性高、數(shù)量豐富和對基因組有很好的覆蓋性等特點[9-10]，被廣泛地用于構(gòu)建植物遺傳圖譜[11]、遺傳多樣性分析[12-13]、基因定位[14]、輔助育種等基礎(chǔ)應用研究中[15-16]。利用SSR分子標記技術(shù)可為樹莓分類提供分子基礎(chǔ)，并了解其遺傳多樣性。

本試驗使用SSR分子標記技術(shù)對45份樹莓樣品的遺傳多樣性進行研究，旨在為樹莓的種群鑒別、資源評價與保護的策略制定、功能基因克隆以及雜交育種選育新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019年7月進行，采集新鮮、飽滿、無病蟲的樹莓嫩葉10～20 g，就地迅速保存于自封袋中，置于冰盒中，帶回實驗室于4 ℃冰箱內(nèi)保存，用于DNA的提取。樹莓種質(zhì)材料樣品信息見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 使用植物基因組DNA提取試劑盒（型號為DP350-02，本試劑盒采用的是可以特異性結(jié)合DNA的吸附柱和獨特的裂解液緩沖體系，能高效提取多種不同植物組織中的基因組DNA）對45份樹莓材料的DNA進行提取，并加入緩沖液保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2 SSR引物篩選 以sm43、sm95、sm96、sm99、sm103號樣品DNA為模板，進行引物篩選。先從筆者所在課題組合成的75對樹莓特異SSR引物中挑選出38對擴增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性明顯的SSR引物，然后進行體系優(yōu)化，從38對引物中篩選出22對重復性高的引物，用于45個樹莓樣品DNA的PCR擴增及多態(tài)性檢測。引物信息見表2。

1.2.3 SSR-PCR擴增 用篩選出的22對引物擴增45份DNA樣品。樹莓SSR-PCR反應體系為 10 μL，其中包括ddH2O 1 μL、DNA模板1.5 μL、Primer-F 和Primer-R各0.75 μL、Mix 6 μL。PCR擴增程序為95 ℃預變性4～5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火溫度30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min，最后4 ℃ 59 min。

1.2.4 電泳、染色 利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠對擴增產(chǎn)物在垂直電泳槽中進行電泳分離，條件為150 V 90 min。電泳后銀染顯色（染色劑：1 g AgNO3+500 mL H2O，顯色劑：2 mL甲醛、7.5 g NaOH，加ddH2O至250 mL，拍照記錄顯影圖片。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)顯影圖片，SSR位點按照位點順序以及等位基因片段大小排列，采用“0，1”統(tǒng)計方法進行試驗數(shù)據(jù)記錄[17]。

根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，利用NTsys 2.10e軟件得出樣品的遺傳相似系數(shù)和UPGMA聚類圖，進而得出樣品之間的遺傳關(guān)系[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

使用植物基因組DNA提取試劑盒（型號為DP350-02 ）提取 45份樹莓鮮嫩葉片樣品的基因組 DNA，結(jié)果（圖1）顯示，45份樹莓樣品基因組DNA的電泳條帶清晰、無降解、純度較高，說明提取的DNA質(zhì)量可滿足后續(xù)PCR擴增反應的要求。

2.2 SSR標記的多態(tài)性

以sm43、sm95、sm96、sm99、sm103號材料的基因組DNA為模板，對75對引物進行PCR擴增、篩選，其中有38對引物產(chǎn)生理想的PCR產(chǎn)物。部分引物篩選結(jié)果見圖2。

通過優(yōu)化體系，從38對引物中篩選出22對擴增條帶清晰、重復性高的SSR引物，用于45份樹莓樣品DNA的PCR擴增及多態(tài)性研究。結(jié)果表明，篩選出的22對SSR引物對45份樹莓樣品DNA進行PCR擴增后，共得到285個條帶，不同引物擴增出的清晰條帶在7～25個范圍內(nèi)，平均每對引物產(chǎn)生12.9個條帶，其中多態(tài)性條帶有276個，多態(tài)性比率為96.8%，各引物的多態(tài)性比率為85.71%～100.00%。引物Rubus25a對45份材料的檢測結(jié)果（圖3）表明，樹莓樣品的遺傳多樣性較為豐富。

2.3 居群遺傳結(jié)構(gòu)

根據(jù)45份樹莓樣品DNA的SSR PCR擴增結(jié)果得到的相似系數(shù)進行聚類分析結(jié)果（圖4）表明，當閾值為0.71時，45份樣品被分為兩大類群。

第一大類由編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、21、22、34等21份樹莓樣品組成，其中除19、21、34從遼寧省農(nóng)業(yè)科學院引種外，其余樹莓樣品均來自貴州省，它們可在閾值為 0.745 5 時，進一步分為6個亞類。第1亞類由編號為1、2、3、4、8、9、10、13、15、16、17、19的樣品組成;第2亞類僅有由編號為14的樣品組成;第3亞類由編號為6、7、11、12的樣品組成;第4亞類僅由編號為5的樣品組成;第5亞類由編號為21、22的樣品組成;第6亞類僅由編號為34的樣品組成。

第二大類由編號為18、20、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45等24份樹莓樣品組成。其中除18、20、23、24為貴州省品種、25引種自廣東省外，其余樹莓樣品均來自遼寧省農(nóng)業(yè)科學院。它們可在閾值為0.734 8時進一步分為5個亞類。第1亞類由編號為18、32、35、36、39的樣品組成;第2亞類由編號為20、24、26、27、41、42、43、44、45的樣品組成;第3亞類由編號為23、30、33、37、40的樣品組成;第4亞類由編號為25、28、29、31的樣品組成;第5亞類僅由編號為38的樣品組成。通過聚類分析結(jié)果可知，不同類型的樹莓品種之間遺傳相似性較小，不同來源的樹莓品種間親緣關(guān)系也比較遠。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，從遼寧省農(nóng)業(yè)科學院引種的樣品44和45親緣關(guān)系最近，其遺傳相似系數(shù)為0.917 6。來自赤水市金沙溝鎮(zhèn)的樣品12和從遼寧省農(nóng)業(yè)科學院引種的樣品32遺傳相似系數(shù)最小，為0.627 2。研究表明，遺傳距離與雜種優(yōu)勢存在相關(guān)關(guān)系，遺傳相似系數(shù)越小，其雜種優(yōu)勢越大[19]，因此育種時可選取樣品12和樣品32作為親本進行雜交，選育優(yōu)良品種應用于生產(chǎn)。

同時來自不同省份的樹莓樣品親緣關(guān)系可以很近，如播州區(qū)楓香鎮(zhèn)的樣品1和從遼寧省農(nóng)業(yè)科學院引種的樣品19，二者雖生長在不同地區(qū)，但二者遺傳相似系數(shù)為0.799 3，親緣關(guān)系很近，推測樣品1和樣品19雖然來自不同地區(qū)，但存在樹莓品種相互引進種植等問題，同一種屬的樹莓因生長在不同的土壤、養(yǎng)料、溫度和水分環(huán)境下，其遺傳性狀發(fā)生了變化，具體原因需進一步研究。與此同時，采集自同一省份同一地區(qū)的樹莓樣品親緣關(guān)系也會相距甚遠，如遵義市習水民化鎮(zhèn)的樣品14和遵義市習水土城的樣品18親緣關(guān)系較遠，遺傳相似系數(shù)為0.673 8，推測可能是因其種子以及花粉的散布，出現(xiàn)種內(nèi)或種間的雜交，導致種內(nèi)甚至種間基因交流。

遺傳多樣性是植物種質(zhì)資源研究的重要內(nèi)容之一，全面地掌握現(xiàn)有種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可以減少育種工作中親本選配的盲目性，從而提高育種效率[18-19]。遺傳多樣性的研究最可靠的是基因水平的研究，其中進行基因測序是最直接、最具說服力的方法，但是對于一個物種或一個種屬中的每個樣品都進行基因組測序的可行性較低。SSR、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、簡單重復序列間擴增（ISSR）等技術(shù)的出現(xiàn)使得分子標記技術(shù)得到高速發(fā)展。

本研究通過SSR技術(shù)對樹莓進行遺傳多樣性分析，該方法可直接通過樣本DNA鑒別不同地區(qū)材料間的差異性，相對于傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定歸類方法，用時較短且不受季節(jié)、環(huán)境限制。此外，還有利于樹莓現(xiàn)有優(yōu)良種質(zhì)資源的研究，同時可為構(gòu)建樹莓遺傳連鎖圖譜奠定基礎(chǔ)。選用SSR分子標記技術(shù)對45份樹莓品系進行遺傳多樣性研究，從75對引物中篩選出22對進行PCR擴增，共得到285個條帶，不同引物擴增出的清晰條帶在7～25個范圍內(nèi)，平均每對引物產(chǎn)生12.9個條帶，其中多態(tài)性條帶276條，多態(tài)性比率為96.8%，各引物的多態(tài)性比率為85.71%～100.00%。同時本研究初步明晰了貴州省部分樹莓品種的親緣關(guān)系，并應用22對SSR引物將貴州省推廣種植的45個樹莓品種區(qū)分開。表明SSR標記技術(shù)是一種對于樹莓遺傳多樣性研究較為合適的方法。開發(fā)樹莓的SSR標記不僅可進一步提高遺傳多樣性分析的可靠性，而且更容易實現(xiàn)數(shù)據(jù)的共享，可有力促進樹莓優(yōu)良品種選育進程和產(chǎn)業(yè)延伸。今后可根據(jù)聚類分析結(jié)果鑒定與分析特定優(yōu)良品種的抗性或農(nóng)藝性狀，培育出適合生產(chǎn)應用推廣的高質(zhì)量樹莓品種。

參考文獻：

[1]左經(jīng)會，向 紅，王緒英，等. 貴州西部懸鉤子屬植物資源研究及開發(fā)利用[C]//中國植物學會第十六次全國會員代表大會暨85周年學術(shù)年會論文摘要匯編，2018.

[2]楊鼎元，張群英，陳 哲，等. 懸鉤子屬植物的組培快繁技術(shù)研究進展[J]. 現(xiàn)代園藝，2019（11）：16-18.

[3]桂明珠，胡寶忠. 小漿果栽培生物學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：36-38.

[4]郭清明. 優(yōu)良樹莓品種及當?shù)匾吧鷺漭囊N比較研究[J]. 低碳世界，2017（34）：344-345.

[5]劉 會，彭春鈺，武忠亮，等. 植物SSR標記開發(fā)及應用研究進展[J]. 科學技術(shù)創(chuàng)新，2018（36）：18-20.

[6]徐德林，陳紅波，馬 激，等. 白及SSR-PCR擴增體系的優(yōu)化[J]. 中成藥，2018，40（12）：2672-2676.

[7]Li L，F(xiàn)ang Z W，Zhou J F，et al. An accurate and efficient method for large-scale SSR genotyping and applications[J]. Nucleic Acids Research，2017，45（10）：e88.

[8]Xu D L，Chen H B，Aci M，et al. De Novo assembly，characterization and development of EST-SSRs from Bletilla striata transcriptomes profiled throughout the whole growing period[J]. PLoS One，2018，13（10）：e0205954.

[9]李媛媛，郭修武，代漢萍，等. 樹莓SSR體系的建立及優(yōu)化[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40（4）：478-480.

[10]Dong H，Shang X D，Zhao X Y，et al. Construction of a genetic linkage map of Lentinula edodes based on SSR，SRAP and TRAP markers[J]. Breeding Science，2019，69（4）：585-591.

[11]Adjebeng-Danquah J，Manu-Aduening J，Asante I K，et al. Genetic diversity and population structure analysis of Ghanaian and exotic cassava accessions using simple sequence repeat （SSR） markers[J]. Heliyon，2020，6（1）：e03154.

[12]忻 雅，方獻平，王淑珍，等. 簡單重復序列標記和序列相關(guān)擴增多態(tài)性標記在草莓遺傳多樣性分析中的比較[J]. 浙江大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2019，45（3）：278-287.

[13]張懷山，鄢秀芹，魯 敏，等. 基于EST-SSR標記的貴州野生刺梨居群遺傳多樣性分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2017，50（6）：1098-1108.

[14]吳 晶，項顯波，陸開形，等. 水稻超短根突變體ssr1的遺傳分析和基因定位[J]. 西北植物學報，2015，35（4）：701-706.

[15]單紅麗，李文鳳，黃應昆，等. 甘蔗抗褐銹病基因定位親本間多態(tài)性SSR標記篩選[J]. 核農(nóng)學報，2019，33（11）：2119-2125.

[16]Dipnarayan S，Rajeev S R，Sukla C，et al. Development of a set of SSR markers for genetic polymorphism detection and interspecific hybrid jute breeding[J]. The Crop Journal，2017，5（5）：416-429.

[17]Qi Z，Mu K M，Ni Z X，et al. Analysis of genetic diversity of ancient ginkgo populations using SSR markers[J]. Industrial Crops and Products，2020，145：111942.

[18]蘇一鈞，王 嬌，霍愷森，等. 甘薯引進種SSR遺傳多樣性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2018，34（5）：984-997.

[19]張鶴山，陳志宏，田 宏，等. 49份白三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析[J]. 種子，2019，38（11）：1-6.于少帥，趙文霞，姚艷霞，等. 新疆野蘋果和栽培蘋果特異性SSR標記開發(fā)及應用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（21）：68-73，83.