于少帥 趙文霞 姚艷霞 淮穩(wěn)霞 覃偉權(quán) 閻偉

摘要：根據(jù)全基因組測序已完成的栽培蘋果基因組，設(shè)計、篩選針對新疆野蘋果的特異性SSR引物。通過PCR擴增、基因測序篩選了15對可以在新疆野蘋果和栽培蘋果中擴增出穩(wěn)定性高且具備多態(tài)性目的條帶的特異性SSR引物;其中8對僅能在栽培蘋果中擴增出特異性目的條帶。15對特異性SSR引物對新疆野蘋果和栽培蘋果不同居群的SSR分析表明，新疆野蘋果遺傳多樣性較為豐富，與栽培蘋果不同居群分化程度較為顯著，基因流水平較低。聚類分析表明，這15對特異性SSR引物可以將新疆野蘋果和栽培蘋果不同居群清晰區(qū)分。本研究利用新開發(fā)的SSR引物不僅可以揭示新疆野蘋果和栽培蘋果的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對初步了解SSR變異位點的生物學(xué)功能以及豐富新疆野蘋果和栽培蘋果基因組的認識也有一定的作用，從而為更好地有效利用相關(guān)資源提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：新疆野蘋果;栽培蘋果;SSR標記;遺傳多樣性

中圖分類號：S661.101?文獻標志碼：A?文章編號：1002-1302（2020）21-0068-06

新疆野蘋果（Malus sieversii）屬第三紀孑遺植物，是林果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要天然種質(zhì)基因庫。近年來，受人類活動的干擾和蘋果小吉丁蟲等病蟲害威脅，新疆野蘋果自然種群無法更新，大面積衰敗和死亡。因此，探究新疆野蘋果林生態(tài)退化機制，篩選抗病蟲害、抗逆性新疆野蘋果株系，加強新疆野蘋果資源的保護和利用已成為新疆野蘋果生產(chǎn)上亟待解決的迫切問題。這對于新疆野果林的生態(tài)保育與修復(fù)、蘋果優(yōu)質(zhì)新品種培育和我國果品產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展具有一定的理論意義和應(yīng)用價值。

近年來，新疆野蘋果的生存狀態(tài)受人類活動、病蟲害等影響嚴重[1-3]。自然條件下植物的健康狀況往往不是受單一因子的影響，而是受病害、蟲害、生境、植物自身特征等多種因子綜合影響[4]。研究發(fā)現(xiàn)，受蘋果小吉丁蟲危害枯死的新疆野蘋果枝干上分布著大量蘋果腐爛病菌，蘋果小吉丁蟲往往和蘋果腐爛病等混合發(fā)生，復(fù)合危害新疆野蘋果林的生存狀態(tài)[3]。因此，在新疆野蘋果保育過程中采取單一的防治手段較難起到較為理想的保護、防治效果。在尋找引起新疆野蘋果種群退化的關(guān)鍵因子，保護新疆野蘋果的同時，保護、選育和栽培具有抗逆性新疆野蘋果遺傳資源應(yīng)該是控制其種群衰退最為經(jīng)濟有效的措施。

新疆野蘋果的遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育研究表明，新疆伊犁哈薩克自治州鞏留縣、新源縣等地的新疆野蘋果種群存在豐富的遺傳多樣性，種群內(nèi)部遺傳分化程度較高。新疆野蘋果種群內(nèi)不同個體葉形等表型性狀的變異與簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）標記的位點有一定的相關(guān)性[5-9]。Klabunde等用11對SSR引物對152份不同蘋果葉斑病抗性的巴西栽培蘋果接穗的遺傳多樣性進行評估發(fā)現(xiàn)，不同抗性栽培蘋果間存在豐富的遺傳多樣性，其中在蘋果葉斑病抗病、感病品種間遺傳結(jié)構(gòu)差異顯著，有120個等位位點是抗病品種獨有的[10]。作為一種分辨率高、遺傳信息量大、操作相對簡單的標記方法，SSR標記被廣泛應(yīng)用于新疆野蘋果遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育和表型性狀相關(guān)性研究中[5，7-8，11-13]。但是，應(yīng)用于新疆野蘋果遺傳變異研究的SSR引物均為非特異性引物，SSR引物擴增序列的功能未知，因此，新疆野蘋果種群或個體間遺傳差異的具體序列及生物學(xué)作用難以確定。

因新疆野蘋果全基因組尚未測序，對于其基因的認識尚不全面。本研究根據(jù)全基因組測序已完成的栽培蘋果基因組，篩選與蘋果抗逆性相關(guān)的功能基因序列。根據(jù)選擇的模板設(shè)計SSR引物，篩選在新疆野蘋果和栽培蘋果中具備擴增特異性、穩(wěn)定性和多態(tài)性的SSR引物。通過新開發(fā)的SSR引物，豐富對新疆野蘋果基因組的了解。通過開發(fā)的特異性SSR引物對新疆野蘋果或栽培蘋果進行遺傳多樣性分析，可以明確新疆野蘋果種群或個體間在基因水平或生物學(xué)功能方面的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品調(diào)查采集 新疆野蘋果枝葉樣品分別于2016年8月至2017年9月采自新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州鞏留縣和新源縣，栽培蘋果枝葉樣品于2017年7月至8月采自山東省青島市和煙臺市。包括11類44份樣品，每個類群采4份樣品，樣品信息如表1所示。

1.1.2 試劑和儀器 植物基因組DNA提取試劑盒、SYBR Green I染料購自北京艾德萊生物科技有限公司，2×Taq Mix購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司，Hi-Di去離子甲酰胺、POP-7 Polymer、GS-500LIZ 分子量內(nèi)標購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，LongGene A200型基因擴增儀、DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠，乙醇等其他化學(xué)試劑購自國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 樣品干燥粉碎后取0.1 g，通過十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取新疆野蘋果和栽培蘋果葉片基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白檢測儀檢測DNA質(zhì)量與濃度，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物設(shè)計 采用NCBI上已報道的栽培蘋果品種金冠基因組為模板設(shè)計SSR引物。栽培蘋果品種金冠基因組序列號為NC024253[14]。根據(jù)已報道的栽培蘋果品種金冠的蘋果基因組，篩選與蘋果抗逆性相關(guān)的基因片段，用SSRHunter軟件對獲得的與蘋果抗逆性相關(guān)的基因片段進行掃描獲得微衛(wèi)星片段。用掃描獲得的微衛(wèi)星片段為模板，采用Primer Pemier 5軟件設(shè)計了49對SSR引物，初步篩選獲得34對能擴增出SSR片段的引物，34對引物信息如表2所示。引物合成及DNA測序由北京睿博解碼生物科技有限公司完成。

1.2.3 PCR擴增 毛細管電泳PCR反應(yīng)體系是 30 μL，包括1 μL DNA模板、1 μL forward/reverse 引物（10 μmol/L）、15 μL 2× PCR Master Mix （包括 0.05 U/μL Taq DNA polymerase、4 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs），剩余用ddH2O補齊。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min;然后是95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s和 72 ℃ 30 s，循環(huán)35次;最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增結(jié)束后，取0.3 μL PCR產(chǎn)物用ABI 3730XL DNA analyzer進行毛細管電泳分析。DNA測序PCR反應(yīng)體系25 μL：1 μLDNA模板、0.5 μL forward/reverse 引物（10 μmol/L）、12.5 μL 2×PCR Master Mix （包括 0.05 U/μL Taq DNA polymerase、4 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs），最后用ddH2O補齊。PCR擴增條件是95 ℃ 5 min;然后是95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，循環(huán)35次;最后72 ℃延伸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

利用GeneMarker 2.2.0軟件通過植物分析類型GS500大小的標準對等位基因進行定位。SSR位點的多態(tài)性通過多態(tài)性等位基因百分比和等位基因數(shù)量來評估。不同類群間的遺傳多樣性通過觀察雜合度（Ho）和期望雜合度（He）來評估，通過Na、Ne、香農(nóng)指數(shù)（I）和Nei's遺傳多樣性指數(shù)（H）來分析，這些參數(shù)由POPGENE1.32軟件完成[15]?；蚍只酵ㄟ^基因分化指數(shù)（Fst）和基因流（Nm）來評估?；贜ei's無偏差遺傳距離和簡單匹配系數(shù)（SM）通過UPGMA法則計算。利用MEGA 7.0軟件和NTSYSpc 2.10e軟件（Exeter Software，Setauket，NY）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物PCR擴增分析

通過PCR擴增驗證新設(shè)計的SSR引物的特異性、穩(wěn)定性和多態(tài)性。結(jié)果表明，34對SSR引物能在新疆野蘋果或栽培蘋果中穩(wěn)定擴增出SSR目的條帶，而其他SSR引物為非特異性擴增。34對引物中，8對引物只能在栽培蘋果中擴增出SSR目的條帶，引物信息如表2所示;26對引物既能在栽培蘋果又能在新疆野蘋果中擴增出SSR目的條帶。這26對既能在栽培蘋果又能在新疆野蘋果中擴出目的條帶的SSR引物中，具有多態(tài)性的引物有15對，引物信息如表2所示，其他11對引物無多態(tài)性。

2.2 新疆野蘋果、栽培蘋果遺傳分化和SSR位點多態(tài)性分析

在新疆野蘋果和栽培蘋果11個居群44個個體中，15對SSR引物共擴增出62個等位基因，平均每個位點擴增出4.13個等位基因。根據(jù)基因多樣性Na、Nei指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、He、Ho等遺傳多樣性參數(shù)可知，檢測的新疆野蘋果樣品遺傳多樣性較為豐富。一般認為Fst值為0～0.05時，遺傳分化低;Fst值為0.05～0.25時，為中等程度遺傳分化;Fst值>0.25，表明其具備顯著的遺傳分化水平[17]。11個居群間的遺傳分化指數(shù)（Fst）為0.250 3，基因流（Nm）為0.749 0，說明居群間具有較高程度的分化水平，基因流較低，11個居群的分化水平較為顯著，結(jié)果如表3所示。15對SSR引物在44份樣品中共擴增出62個等位基因，平均每對引物擴增出4.13個等位基因。引物XS72-1-1和XS71-1-4擴增出的等位基因個數(shù)相對較多，分別為9個和8個;引物XS24-1-5-2擴增出的等位基因個數(shù)相對較少，僅有2個等位基因，結(jié)果如表4所示。引物XS72-1-1和XS71-1-4所在基因序列編碼的蛋白分別為類轉(zhuǎn)錄因子TCP8X4型和類TMV抗性蛋白N，SSR引物XS24-1-5-2所在基因序列編碼的蛋白則為轉(zhuǎn)錄因子RAX3[14]。

2.3 新疆野蘋果和栽培蘋果系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，新疆野蘋果和栽培蘋果Nei's無偏差遺傳距離在-0.001 5～0.808 4之間，如表5所示。新疆新源縣的新疆野蘋果XY（0）與新疆鞏留縣的新疆野蘋果GL2的遺傳距離值最小，2個新疆野蘋果居群具有較高的遺傳相似性。新疆野蘋果GL（0）種群與山東青島的栽培蘋果LS種群的遺傳距離值最大，說明2個種群遺傳分化較大?；贜ei's無偏差遺傳距離通過UPGMA法構(gòu)建了新疆野蘋果和栽培蘋果不同種群的系統(tǒng)發(fā)育樹。通過新開發(fā)的15對SSR引物，可將11個新疆野蘋果和栽培蘋果居群清晰分開，共形成2個大的進化分枝。采自山東煙臺、青島的栽培蘋果種群LS和LY單獨位于一個進化分枝，采自新疆新源和鞏留的新疆野蘋果種群單獨聚于一個進化分枝（圖1）?；赟M相似性系統(tǒng)構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹表明，不同種群新疆野蘋果和栽培蘋果44個個體聚于不同的進化分枝，可以清晰區(qū)分。采自新疆鞏留和新源的新疆野蘋果36個個體聚在一個進化分枝，栽培蘋果8個個體聚于一個進化分枝（圖2）。

3 結(jié)論與討論

本研究根據(jù)栽培蘋果金冠的基因組，選擇與蘋果抗逆性相關(guān)的DNA序列為模板設(shè)計SSR引物[14]。最終，成功設(shè)計并篩選到15對SSR引物可在新疆野蘋果和栽培蘋果中穩(wěn)定擴增出特異性、多態(tài)性的目的條帶;8對SSR引物僅能在栽培蘋果中特異性擴增出SSR目的條帶，并且差異的SSR目的條帶編碼的蛋白產(chǎn)物也是已知的。因此，通過新開發(fā)的SSR引物?可以初步篩選出一些抗源材料或抗性基因，這些材料對于新疆野果林生態(tài)恢復(fù)和優(yōu)良抗性品種創(chuàng)制具有一定的作用。通過15對SSR引物對我國不同地區(qū)新疆野蘋果和栽培蘋果進行遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析，揭示了新疆野蘋果和栽培蘋果種群內(nèi)存在豐富的遺傳多樣性。新疆野蘋果和栽培蘋果遺傳關(guān)系較近，但遺傳分化較為明顯。新疆野蘋果不同種群親緣關(guān)系較近，遺傳分化不明顯。栽培蘋果不同類群遺傳關(guān)系較近。

研究表明，新疆野蘋果2個居群的Nei's無偏差遺傳距離為負值，2個類群分別是1個采自新源的新疆野蘋果居群和1個采自鞏留的新源野蘋果居群。已有研究表明，生活在天山公路兩邊的馬鹿種群之間遺傳距離為負值，種群間雜合度、基因型數(shù)量無差異;馬鹿棲息地被公路隔絕，棲息地內(nèi)雜合度、基因型數(shù)量降低，馬鹿遷徙交流受公路影響而導(dǎo)致種群退化[18]。受人類活動影響，近交導(dǎo)致種群內(nèi)雜合度降低，遺傳距離為負值。由此可見，適當增加不同種群新疆野蘋果間的基因交流，有利于增加不同居群的雜合度，增加基因型數(shù)量，且能有效防止種群退化現(xiàn)象的發(fā)生。

目前引起新疆野蘋果枯死的脅迫因子尚不清楚，因此，同一災(zāi)害條件下，表現(xiàn)出健康狀態(tài)的個體所具有的抗性類型也不明確。通過不同癥狀新疆野蘋果個體的分子遺傳變異特征，或許可以找到一些與新疆野蘋果抗逆相關(guān)的線索。DNA分子標記在不同抗逆性植物乃至栽培蘋果的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究中有很好的應(yīng)用[19-24]。DNA分子標記有顯性分子標記和共顯性分子標記2種，共顯性標記揭示的遺傳信息更全面、細膩，其中，由于植物體內(nèi)存在大量的簡單重復(fù)序列，因此，共顯性的SSR標記揭示的遺傳信息更為豐富，并且檢測成本低、周期短，對DNA質(zhì)量要求不苛刻，操作相對簡便[25]。SSR標記在不同抗性植物乃至栽培蘋果的分子遺傳檢測中有很好的應(yīng)用[8，10，26]。

本研究采用SSR分子標記用于新疆野蘋果不同抗性材料的分子遺傳和系統(tǒng)發(fā)育研究。但目前用于新疆野蘋果遺傳多樣性分析的SSR引物擴增的目的片段均為非特異性擴增，目的條帶的功能及編碼的蛋白尚不明確，因此通過SSR引物對新疆野蘋果或栽培蘋果不同種群、不同個體進行分析，所揭示的遺傳差異片段具備的生物學(xué)功能有待確定。而本研究基于確切基因模板設(shè)計的SSR引物，所得序列編碼的蛋白均已知，如SSR引物XS72-1-1和XS71-1-4所在基因序列編碼的蛋白分別為類轉(zhuǎn)錄因子TCP8X4型和類TMV抗性蛋白N，SSR引物XS24-1-5-2所在基因序列編碼的蛋白為轉(zhuǎn)錄因子RAX3[14]。基于本研究設(shè)計的15對SSR分子標記，不僅可以揭示新疆野蘋果或栽培蘋果不同種群、不同個體間豐富的遺傳多樣性及彼此之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，而且差異片段的生物學(xué)功能也一目了然，有利于深刻了解植物間的遺傳變異。

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