劉英翠，張春媛，梁愛軍，史 鵬，馬 倩

(山西省林業(yè)和草原科學(xué)研究院， 山西 太原 030012)

我國(guó)是沙棘分布面積最大、種類最多的國(guó)家。沙棘已被列入藥食同源植物，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和黃酮類等生物活性物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，沙棘黃酮具有抗心肌缺血、降低血清膽固醇、降血糖、降血脂、抗氧化等藥理功效。據(jù)報(bào)道沙棘葉中黃酮含量最高，而對(duì)沙棘葉利用的研究較少，為了充分利用沙棘資源，對(duì)沙棘葉中總黃酮的提取及深加工利用進(jìn)行研究具有重要意義。

目前，總黃酮的提取方法主要有索氏提取法、有機(jī)溶劑回流法、微波法等，這些方法存在溶劑使用量大，操作繁瑣、提取率低等缺點(diǎn)。利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、攪拌作用、空化效應(yīng)等可加速有效成分的溶出、擴(kuò)散，從而縮短提取時(shí)間，增加提取率，節(jié)約溶劑，避免高溫加熱萃取對(duì)黃酮成分的影響，最大程度保持沙棘黃酮的生物活性。筆者在傳統(tǒng)高溫加熱超聲提取方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)得出低溫加熱或常溫超聲條件下提取沙棘葉總黃酮的最佳工藝條件，保證了沙棘葉總黃酮的生物活性。該方法具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)約能耗、效率高等優(yōu)點(diǎn)，可為提取沙棘葉黃酮類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用沙棘葉采于山西省右玉縣。試驗(yàn)試劑包括蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)、蒸餾水、乙醇(95%)，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(BSA223S-CW)、紫外可見分光光度計(jì)(UV-3100PC上海美譜達(dá))、超聲波清洗機(jī)(SB-25-12DTDN)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅)、粉碎機(jī)、抽濾泵。

2 試驗(yàn)方法

2.1 原料預(yù)處理

挑選沙棘葉，去刺，整理后于60 ℃條件下恒溫烘干，用食品研磨機(jī)研磨，過(guò)60目篩，得到干燥的沙棘葉粉末，密封待用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品20 mg，加適量60%乙醇，水浴溶解后放冷，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻。精密量取25 mL溶液，置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁對(duì)照品溶液，濃度為0.2 mg/mL，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.3 mL，0.6 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，3.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1.求得回歸方程為y=10.790 0x-0.000 5，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差R2= 0.999 9.

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 沙棘葉總黃酮提取

稱取沙棘葉粉1.00 g，共3份，置于三角瓶中，分別加入60%乙醇溶液30 mL，超聲30 min，靜置過(guò)濾，收集濾液于100 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度。精密量取25 mL于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.5 總黃酮含量的測(cè)定

精密量取供試品溶液0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加30%乙醇至6 mL；加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；之后加4%氫氧化鈉溶液4 mL，并用30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min.同時(shí)，取供試品溶液0.5 mL于25 mL容量瓶中，加30%乙醇定容，作為空白溶液。用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定樣品吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響

稱取1.00 g沙棘葉粉15份(同一條件3次重復(fù)，結(jié)果取平均值)，1∶30的料液比，分別在100 W，80 W，60 W，40 W，20 W功率條件下，室溫超聲提取30 min，結(jié)果見圖2.

圖2 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響

超聲波可以加速有效成分的釋放與溶出，提高有效成分的提取率。由圖2可知，隨著超聲功率的增高總黃酮提取率增大，當(dāng)功率達(dá)到80 W時(shí)總黃酮提取率最高，功率達(dá)100 W時(shí)提取率不變。因此，從節(jié)約能耗考慮，適宜功率為80 W.

3.2 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

稱取1.00 g沙棘葉粉15份(同一條件3次重復(fù)，結(jié)果取平均值)，1∶30的料液比，功率80 W，分別在30 ℃(室溫)，40 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃溫度條件下超聲30 min，結(jié)果見第3頁(yè)圖3.

由圖3可知，溫度對(duì)沙棘葉總黃酮提取率有一定的影響，隨著水溫的升高提取率先增后減。當(dāng)水溫由室溫升至40 ℃時(shí)，總黃酮提取率升高。當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃，總黃酮提取率有所降低，可能是強(qiáng)烈的熱效應(yīng)會(huì)破壞沙棘葉中黃酮類化合物的緣故。溫度超過(guò)50 ℃之后，提取率變化比較平緩。故最佳提取溫度為40 ℃.

圖3 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

3.3 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

稱取1.00 g沙棘葉粉15份(同一條件3次重復(fù)，結(jié)果取平均值)，1∶30的料液比，功率80 W，室溫下分別超聲提取5 min，10 min，15 min，20 min，30 min，結(jié)果見圖4.

圖4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖4可知，超聲時(shí)間對(duì)沙棘葉總黃酮的提取率影響較大，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)總黃酮提取率先增加后持平。超聲時(shí)間20 min內(nèi)總黃酮提取率增加比較明顯，呈上升趨勢(shì)。超過(guò)20 min后提取率無(wú)變化，說(shuō)明超聲20 min黃酮全部溶出。因此，浸提時(shí)間宜選擇20 min.

3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響

稱取1.00 g沙棘葉粉15份(同一條件3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值)，分別加入40%，50%，60%，70%，80%乙醇水溶液30 mL，功率80 W，在室溫下超聲提取30 min，結(jié)果見圖5.

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)乙醇濃度由40%增加到60%時(shí)，總黃酮提取率緩慢增加，大于60%后提取率極速下降。原因是乙醇濃度過(guò)低時(shí)不能完全溶解出黃酮類化合物，但當(dāng)濃度過(guò)大時(shí)，又會(huì)阻礙黃酮類化合物的溶出。因此，選擇 60% 乙醇溶液為宜。

3.5 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

稱取 1.00 g 沙棘葉粉 15 份(同一條件 3 個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值)，分別加入 10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，30 mL 的 60% 乙醇水溶液，在功率 80 W，室溫條件下超聲提取 30 min，結(jié)果見圖 6.

圖6 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖6可以看出，料液比對(duì)總黃酮提取率有一定的影響，當(dāng)料液比升高時(shí)總黃酮提取率也會(huì)升高，但當(dāng)料液比達(dá)到 1∶20后總黃酮提取率變化不大。原因是料液比較低時(shí)不易充分稀釋溶解出沙棘葉中的總黃酮，但當(dāng)溶劑大于 1∶20 之后，會(huì)將雜質(zhì)溶出。因此，選擇 1∶20 料液比較為合適。

3.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，全面考慮提取工藝條件對(duì)沙棘葉總黃酮提取率的相互影響，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比為研究因素，以沙棘葉總黃酮提取率來(lái)確定超聲提取總黃酮的最佳工藝條件，因素水平設(shè)計(jì)見第4頁(yè)表1.根據(jù)正交試驗(yàn)表操作，試驗(yàn)結(jié)果見第4頁(yè)表2.

表1 正交試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)

表2 L9(34)正交試驗(yàn)記錄及結(jié)果

由表1和表2可以看出，各因素對(duì)沙棘葉總黃酮提取率影響的大小順序依次為料液比(A)﹥超聲時(shí)間(C)﹥超聲溫度(D)﹥乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)。正交試驗(yàn)最優(yōu)水平為：A2B2C3D2，即料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間20 min，超聲溫度40 ℃.

3.7 工藝條件驗(yàn)證及結(jié)果

最佳工藝條件不在正交試驗(yàn)中，為了確定優(yōu)化條件的精密度與可靠性，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。按照得出的最佳工藝條件，對(duì)沙棘葉中總黃酮進(jìn)行了 3 次平行提取試驗(yàn)，計(jì)算黃酮得率，結(jié)果如表 3 所示。

由表3可知，3次平均得率為5.97%，與正交試驗(yàn)中處理 5的結(jié)果一致，說(shuō)明室溫下也能得到較高的黃酮提取率?？赡苁怯捎诔暡ㄕ駝?dòng)產(chǎn)生的熱能，使水溫升高，加速了黃酮溶出。為節(jié)約能耗也可常溫下超聲提取。RSD值為0.97%，說(shuō)明該結(jié)果可靠。

表3 沙棘葉黃酮測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

試驗(yàn)采用超聲波法提取沙棘葉總黃酮，以乙醇水溶液為提取劑，通過(guò)單因素與正交試驗(yàn)考察了超聲功率、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素對(duì)沙棘葉中總黃酮提取率的影響。優(yōu)化后的最佳工藝條件為料液比 1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%，超聲時(shí)間 20 min，超聲溫度 40 ℃. 該方法不僅可保證沙棘葉總黃酮的生物活性，且具有操作簡(jiǎn)單、提取速度快、耗能低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)沙棘葉黃酮具有一定的參考價(jià)值。