吳云雪，李娟，高晴，董文明，和勁松

（云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明650201）

茶多酚是茶葉中有保健功能的主要成分，其中兒茶素類約占茶多酚總量的60%～80%[1]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是茶葉中含量最為豐富的一種兒茶素，約占茶葉中總兒茶素含量的50%～60%[2]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎、預防心腦血管疾病等活性，但穩(wěn)定性差的特點導致其生物利用率較低[3]。乳清蛋白是牛乳蛋白的主要成分之一[4]，將乳清蛋白高度濃縮可制得乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI），其蛋白質含量在90%以上[5]，是公認的人體優(yōu)質蛋白質補充劑之一。

食品中不同成分之間發(fā)生的相互作用會影響食品的營養(yǎng)、質地、安全性等，茶多酚與蛋白質的相互作用會影響茶多酚的抗氧化活性以及蛋白質的功能特性。Mariana 等[6]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白會影響綠茶的抗氧化活性和抑菌性。Avi 等[7]發(fā)現(xiàn)蛋白質與茶多酚的相互作用能夠提高茶多酚的穩(wěn)定性。徐潔瓊等[8]發(fā)現(xiàn)蛋白質空間結構的變化可影響其與茶多酚的相互作用。關于EGCG 與乳清蛋白間相互作用的研究未見報道。本試驗利用紫外吸收光譜、導數(shù)光譜、熒光光譜研究EGCG與WPI 間的相互作用，以期為功能食品的開發(fā)以及茶多酚在蛋白食品中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白粉（蛋白質含量＞95%）：美國Le Sueur Cheese 公司；EGCG（純度 98%）：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；所用分析用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

XK96-A 型快速混勻器：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；FE20 型實驗室2、3 計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UPG-752 紫外可見分光光度計：北京優(yōu)譜通用科技有限公司；F96Pro 型熒光分光光度計：上海棱光技術有限公司；601 型恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

用檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉配制不同pH（pH 范圍2.0～9.0、離子濃度為0.10 mol/L）和不同離子濃度（pH 為 3.0、離子濃度范圍 0.10 mol/L～0.20 mol/L）的磷酸鹽緩沖液，并以此為溶劑配制濃度為1.0 mg/mL的WPI 溶液，以及濃度為1.2 mg/mL 的EGCG 溶液。

1.3.2 光譜分析

1.3.2.1 紫外-可見吸收光譜分析

向試管中依次加入2.0 mL 磷酸鹽緩沖液，2.0 mL 1.0 mg/mL WPI 溶液和一定量1.2 mg/mL EGCG 溶液，用磷酸鹽緩沖液補充至5.0 mL，在25 ℃恒溫水浴鍋中保溫1 h 后取出，掃描260 nm～340 nm 波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜；對吸收曲線求二階、四階導數(shù)，得到相應導數(shù)光譜。

1.3.2.2 熒光光譜分析

配制上述溶液，選擇激發(fā)波長280 nm、掃描速率3 000 nm/min，測定其在280 nm～440 nm 波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm/5 nm。

溶液中WPI 作為熒光物質分子和猝滅劑EGCG分子發(fā)生相互碰撞引起的熒光猝滅過程由Stern-Volmer 方程描述[9]：

式中：F0和F 分別是不存在和存在猝滅劑時WPI溶液的熒光強度；[Q]為猝滅劑濃度，mol/L；Ksv為Stern-Volmer 猝滅常數(shù)，L/mol；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)，L/（mol·s）；Ksv=Kq×τ0；τ0為不存在猝滅劑時熒光分子的壽命，生物大分子的平均壽命約為1×10-8s[10]。

當熒光體為生物大分子時，其最大擴散碰撞猝滅常數(shù)為2×1010L/（mol·s），將經(jīng)公式（1）計算得到的Kq與之比較，若Kq＞2×1010L/（mol·s），則屬于靜態(tài)猝滅；若Kq＜2×1010L/（mol·s），則屬于動態(tài)猝滅。

對于靜態(tài)猝滅，可采用下式計算結合常數(shù)KA和結合位點數(shù)n[11]：

式中：F0和F 分別是不存在和存在猝滅劑時WPI溶液的熒光強度；KA為表觀結合常數(shù)，L/mol；n 為結合位點數(shù)；[Q]為猝滅劑濃度，mol/L。

通過log[（F0-F）/F]和log[Q]作圖可求出結合常數(shù)KA和結合位點數(shù)n。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用Origin Pro 8.5.1 軟件進行繪圖，本文采用SPSS 19 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，結果以平均值±標準差表示，每個試驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 EGCG對WPI紫外吸收光譜的影響

紫外吸收光譜是研究蛋白質結構變化的一種簡單可靠的方法[12]。小分子與蛋白質的相互作用會引起蛋白質吸收譜的紅移與藍移，或信號的增強與減色。圖1 顯示了pH 值為7.0、離子濃度為0.10 mol/L 和pH值為3.0、離子濃度為0.15 mol/L 條件下不同濃度EGCG 對WPI 紫外吸收光譜的影響。

圖1 不同濃度EGCG 對WPI 溶液紫外吸收光譜的影響Fig.1 Effect of EGCG concentration on the UV-Vis absorption spectrum of WPI

如圖1，當 WPI 溶液中不含 EGCG 時，WPI 在 280 nm附近有最大吸收峰，隨著WPI 溶液中EGCG 濃度的增加，WPI 的紫外吸收光譜峰值隨之增大，并且發(fā)生藍移，最大吸收峰波長由280 nm 移至276.4 nm。此外，在離子濃度為0.10 mol/L，不同pH 值（分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0）條件下以及 pH 值為 3.0，不同離子濃度（分別為0.10、0.20 mol/L）條件下均觀察到類似現(xiàn)象，如圖2、圖3。

孟麗艷等[13]研究了大黃酚與牛血清白蛋白的相互作用機制，發(fā)現(xiàn)加入大黃酚可使牛血清白蛋白的紫外吸收光譜發(fā)生明顯的變化。劉勤勤等[14]研究了茶多酚對大豆分離蛋白紫外吸收光譜的影響，發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的紫外吸收光譜峰值隨加入茶多酚濃度的增加而升高，并且發(fā)生藍移。本研究結果與上述基本一致，表明加入EGCG 可使WPI 生色團所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進而導致WPI 吸光度增大。

圖2 不同pH 值條件下，不同濃度EGCG 對WPI 溶液紫外-可見吸收光譜的影響Fig.2 Effect of different concentration EGCG on the UV-Vis absorption spectra of WPI at different pH

圖3 不同離子濃度條件下，不同濃度EGCG 對WPI 溶液紫外-可見吸收光譜的影響Fig.3 Effect of different concentration EGCG on the UV-Vis absorption spectra of WPI at different ion concentration

2.2 EGCG對WPI導數(shù)光譜的影響

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是天然氨基酸中僅有的在近紫外光區(qū)具有吸收光譜的3 種組分，但由于它們在240 nm～300 nm 范圍內(nèi)的吸收峰會發(fā)生重疊[15]，因此選用高靈敏度、高分辨率和具有良好再現(xiàn)性的導數(shù)光譜法[16]進一步探究EGCG 對WPI 結構的影響。不同濃度EGCG 對WPI 溶液導數(shù)光譜的影響見圖4。

圖4 不同濃度EGCG 對WPI 溶液導數(shù)光譜的影響Fig.4 Effect of EGCG concentration on the derivative spectrum of WPI

由圖4 可知，WPI 的四階導數(shù)光譜在284 nm 和291 nm 附近有兩個尖銳的波峰，分別是酪氨酸和色氨酸的特征重疊峰以及色氨酸的特征吸收峰[17]，隨著加入EGCG 濃度的增大，這兩種峰的位置發(fā)生了變化。當pH 值為7.0、離子濃度為0.10 mol/L 時，分別由284.6 nm 和 291.5 nm 移至 284.8 nm 和 291.6 nm 處；當pH 為3.0、離子濃度為0.15 mol/L 時，分別由281.1 nm和287.9 nm 移至281.9 nm 和287.7 nm 處。同樣地，WPI 的二階導數(shù)光譜在284 nm 和291 nm 附近相應位置處有這兩種氨基酸的負吸收峰。隨著加入EGCG 濃度的增大，對應特征峰的位置發(fā)生了類似的變化。當pH 為7.0、離子濃度為0.10 mol/L 時，分別由284.1 nm和 291.7 nm 移至 284.2 和 291.6 nm 處；當 pH 為 3.0、離子濃度為0.15 mol/L 時，酪氨酸和色氨酸的特征重疊峰的位置由284.1 nm 移至283.7 nm 處，而色氨酸特征峰波長則無明顯變化。在離子濃度為0.10 mol/L，不同pH（分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0）條件下以及pH 為 3.0，不同離子濃度（分別為 0.10、0.20 mol/L）條件下均觀察到兩種峰位變化的類似現(xiàn)象（圖略）。

寧愛民等[18]利用導數(shù)光譜研究了牛血清白蛋白與十二烷基硫酸鈉的相互作用，發(fā)現(xiàn)隨著十二烷基硫酸鈉濃度的增大，牛血清白蛋白分子中芳香族氨基酸微環(huán)境極性的變化趨勢不同。本研究結果進一步表明，EGCG 通過影響WPI 分子中酪氨酸和色氨酸所處的微環(huán)境使WPI 分子構象發(fā)生改變，紫外吸收發(fā)生明顯變化，EGCG 與WPI 之間存在相互作用。

2.3 EGCG對WPI熒光光譜的影響

蛋白質分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸能夠發(fā)射熒光，含有這3 種氨基酸的蛋白質均屬于內(nèi)源性熒光物質，因此熒光光譜法常被用于探究蛋白質與小分子間的相互作用。在280 nm 激發(fā)波長下，色氨酸和酪氨酸均能發(fā)射熒光，但當激發(fā)波長為295 nm 時，只有色氨酸能夠發(fā)射熒光[19]。不同濃度EGCG 對WPI 溶液熒光發(fā)射光譜的影響見圖5。

由圖5 可知，當激發(fā)波長為280 nm 時，WPI 在波長330 nm 附近發(fā)射熒光。固定WPI 溶液濃度不變，向其中加入EGCG，結果表明隨著EGCG 濃度的增加，WPI 的內(nèi)源熒光強度逐漸降低，最大發(fā)射波長發(fā)生輕微移動。在離子濃度為0.10 mol/L，不同pH 值（分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0）條件下以及 pH 為 3.0，不同離子濃度（分別為0.10 mol/L、0.20 mol/L）條件下均觀察到相同現(xiàn)象，這說明EGCG 對WPI 的內(nèi)源熒光有猝滅作用。

圖5 不同濃度EGCG 對WPI 溶液熒光發(fā)射光譜的影響Fig.5 Effect of EGCG concentration on fluorescence emission spectrum of WPI

2.4 熒光猝滅機制分析

根據(jù)不同pH 值和不同離子濃度條件下WPI 的熒光猝滅光譜，繪制F0/F 隨[Q]變化的Stern-Volmer 關系圖，經(jīng)線性擬合得圖6，由圖中直線的斜率可計算出EGCG 與 WPI 相互作用的 Ksv和 Kq，結果見表1、表2。

圖6 不同pH 值和不同離子濃度條件下EGCG 猝滅WPI 的Stern-Volmer 曲線圖Fig.6 Stern-Volmer plots of WPI quenched by EGCG at different pH and different ion concentrations

表1 不同pH 值條件下EGCG-WPI 復合物的熒光猝滅常數(shù)及線性相關系數(shù)Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of EGCG and WPI at different pH

表2 不同離子濃度條件下EGCG-WPI 復合物的熒光猝滅常數(shù)及線性相關系數(shù)Table 2 Quenching rate constants and correlation coefficients of EGCG and WPI at different ion concentrations

由圖6 可知，EGCG 對 WPI 的 Stern-Volmer 曲線大部分呈非直線關系（R2＜0.98），表明 EGCG 對 WPI 的猝滅機制并不完全是動態(tài)猝滅，且雙分子猝滅常數(shù)都在1013L/（mol·s）數(shù)量級（表1、表2），均遠大于最大散射碰撞猝滅速率常數(shù)2×1010L/（mol·s），說明EGCG 對WPI 的熒光猝滅機制屬于生成了不發(fā)光復合物的靜態(tài)猝滅。

在不同pH 值條件下，Stern-Volmer 猝滅常數(shù)隨pH 值的增大呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。這可能與pH值影響蛋白質分子表面電荷量有關，β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分，等電點在5.13 附近[20]，此時蛋白質分子表面不帶電荷，因此pH 5.0 時Stern-Volmer 猝滅常數(shù)最小。在不同離子濃度條件下，Stern-Volmer 猝滅常數(shù)隨離子濃度的增大而增大，這可能是因為增大離子濃度能夠屏蔽靜電排斥作用，但不會影響EGCG 與WPI 之間的靜電吸引作用，導致EGCG 與WPI 之間的吸附量增加。由此推測在EGCG 與WPI 的相互作用中存在靜電作用力。

2.5 EGCG與WPI結合常數(shù)和結合位點數(shù)的計算

根據(jù)公式（2），繪制lg[（F0-F）/F]隨lg[Q]變化的雙對數(shù)關系圖，經(jīng)線性擬合得圖7，由直線截距和斜率可計算出EGCG 與WPI 間相互作用的表觀結合常數(shù)KA和結合位點數(shù)n，結果見表3、表4。

表3 不同pH 值條件下EGCG-WPI 復合物的表觀結合常數(shù)、結合位點數(shù)及線性相關系數(shù)Table 3 Apparent binding constants，binding sites numbers and correlation coefficients of EGCG and WPI at different pH

表4 不同離子濃度條件下EGCG-WPI 復合物的表觀結合常數(shù)、結合位點數(shù)及線性相關系數(shù)Table 4 Apparent binding constants，binding sites numbers and correlation coefficients of EGCG and WPI at different ion concentrations

如圖7 所示，EGCG 對WPI 猝滅的雙對數(shù)圖呈現(xiàn)出較好的線性關系。不同條件下EGCG 與WPI 的結合位點數(shù) n 均在 1 左右（表3、表4），說明 WPI 僅提供一個位點與EGCG 結合。在不同pH 值條件下，結合常數(shù)KA隨pH 值的增大呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢；在不同離子濃度條件下，結合常數(shù)KA隨離子濃度的增大而增大，進一步表明EGCG 與WPI 的相互作用中存在靜電作用力。

3 結論

EGCG 可改變WPI 分子中芳香族氨基酸的微環(huán)境，使WPI 的分子構象發(fā)生改變，并能有規(guī)律的猝滅WPI 的內(nèi)源熒光，猝滅機制為靜態(tài)猝滅，二者形成了復合物，結合位點數(shù)約為1。pH 值和離子濃度都是影響EGCG 與WPI 相互作用的外界因素，EGCG 與WPI結合常數(shù)在pH 2.0～9.0 范圍內(nèi)隨pH 值的增大先減小后增大，在離子濃度0.10 mol/L～0.20 mol/L 范圍內(nèi)隨離子濃度的增大而增大，基于以上可知，EGCG 與WPI間存在靜電相互作用。