李嘉欣，孟斌斌，朱 凱*

(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037; 2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

樟樹是樟科樟屬植物中經(jīng)濟(jì)價值較高的樹種之一,主要分布于中國南方各省的亞熱帶。從樟樹葉中提取的揮發(fā)性精油富含芳樟醇、 1,8-桉葉油素、樟腦、異-橙花叔醇和龍腦等重要天然成分[1]，且具有芳香、醫(yī)療和驅(qū)蟲等作用而成為醫(yī)藥衛(wèi)生、化工、食品、香料的重要原料。此外，樟樹葉為可再生資源，其應(yīng)用前景廣闊[2]。根據(jù)樟樹枝葉精油中所含主成分的不同，可將樟樹分為腦樟(主要含有樟腦)、芳樟(芳樟醇)、油樟(桉油素)、異樟(異-橙花叔醇)和龍腦樟(右旋龍腦)等5種化學(xué)類型[3-4]。生物體在自然代謝過程中均會產(chǎn)生自由基，自由基及其引發(fā)的氧化反應(yīng)，會加快食品氧化、加速人體衰老[5]，甚至還可能造成一系列疾病，如癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和炎癥[6-7]。因此，通過對體內(nèi)外自由基的清除，能夠起到延長食品保質(zhì)期、延緩人體衰老、減少疾病的作用。目前，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域大多使用合成的抗氧化劑，如Vc、丁基羥基茴香醚(BHA)和沒食子酸丙酯(PG)等[8]。這些合成的抗氧化劑都有一定的毒副作用，會造成或多或少的不利影響，長期服用，可能會對身體健康造成危害[9]。近年來，氧化應(yīng)激對人體健康的影響已經(jīng)被越來越多的人關(guān)注，人們更希望尋找綠色、天然、健康的抗氧化劑來代替合成的抗氧化劑[10-11]。迄今為止，很多植物的精油都含有豐富多樣的抗氧化活性成分，而精油含量豐富的芳香植物原料則成為目前研究的重點[12]。目前，對于不同化學(xué)類型樟樹精油的成分分析及抗氧化活性方面的研究很少，基于此，本研究采用GC-MS對異樟、腦樟、油樟和芳樟4種樟樹葉精油的化學(xué)組成進(jìn)行分析，并研究其成分差異和體外抗氧化活性，以期為樟樹資源高效高質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

新鮮樟樹葉片于2019年2月采自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，樟樹葉分別摘自4種樟樹(芳樟、腦樟、異樟和油樟)，自然風(fēng)干，粉碎，備用。

TRACE 1300-ISQ型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 樟葉精油的提取

分別稱取100 g經(jīng)粉碎的4種樟樹葉片，裝入1 000 mL四口燒瓶中，蒸餾水的料液比為1 ∶8(g ∶mL)，水蒸氣蒸餾5 h，待冷卻后用乙醚萃取，并分離后得到精油，置于4 ℃下保存待用。

1.3 GC-MS分析

色譜條件：色譜柱DB-5MS；初溫68 ℃，以15 ℃/min升溫至150 ℃，然后以5 ℃/min升溫至200 ℃，再以15 ℃/min升溫至280 ℃，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。FID檢測器溫度為280 ℃；0.1 μL進(jìn)樣量，載氣為氦氣。采用面積歸一法確定各化學(xué)組分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

質(zhì)譜條件： EI離子源250 ℃，四級桿150 ℃；電子能量70eV；電子倍增管電壓1 347 V，掃描質(zhì)量范圍45～450 u。

1.4 樟葉精油抗氧化活性測定

1.4.1DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基(DPPH·)在有機(jī)溶劑中較為穩(wěn)定，溶于乙醇呈紫色，在517 nm附近有強(qiáng)吸收。向DPPH溶液中加入抗氧化劑時，DPPH的單電子被配對，在517 nm處的吸光光度變小，顏色變淺，且顏色越淺說明所加入的抗氧劑對DPPH·的清除能力越強(qiáng)[13]。因此，可通過測定樣品在在517 nm處的吸光度值來判定其抗氧化能力。

稱取3.94 mg(0.01 mmol)DPPH，用無水乙醇溶解，配制成0.1 mmol/L 的DPPH乙醇溶液，貯存于棕色容量瓶中，并置于暗處備用。將4種化學(xué)類型樟樹葉精油樣品分別溶于無水乙醇中，配置成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g/L的精油溶液。分別取不同質(zhì)量濃度的精油溶液2 mL，加入 2 mL 配好的DPPH溶液，搖勻后，置于暗處反應(yīng)30 min，測定其在波長517 nm處的吸光度值，記為A1；用2 mL 無水乙醇代替樣品液作為對照組，測定其在波長517 nm處的吸光度值，記為A0。每組重復(fù)3次，取平均值,按以下公式計算DPPH·清除率：

y=(A0-A1)/A0×100%

式中：y—DPPH自由基清除率，%；A1—加入DPPH的精油溶液吸光度值；A0—加入DPPH的無水乙醇吸光度值。

1.4.2ABTS自由基清除能力測定 配好的ABTS溶液呈墨綠色，向其中加入抗氧化劑后，ABTS自由基(·ABTS+)的產(chǎn)生會被抑制，使在最大吸收波長734 nm處測得的吸光度值隨氧化劑氧化能力的增強(qiáng)而減小[14]，從而計算出樣品的抗氧化能力。

式中：y—ABTS自由基清除率，%;A′1—加入·ABTS+的精油溶液吸光光度值;A′0—加入·ABTS+的無水乙醇吸光光度值。

1.4.3總抗氧化能力測定 FRAP法是以氧化還原反應(yīng)為基礎(chǔ)，在酸性條件下，F(xiàn)e3+與三吡啶基三嗪(TPTZ)形成復(fù)合物(Fe3+-TPTZ)，當(dāng)加入抗氧化劑時，形成的復(fù)合物被還原為二價鐵而變?yōu)樗{(lán)色，且在其最大吸收波長593 nm處的吸光度值減小[15]。因此，可以將此法作為測定樣品總抗氧化能力的一種方法。精油的總抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP=1 mmol/L FeSO4，即樣品的抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的濃度。

分別取不同質(zhì)量濃度的FeSO4溶液0.1 mL，各加入2.9 mL TPTZ工作液，37 ℃ 下反應(yīng)10 min，測定其在波長為593 nm處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為Y=0.350 2+0.906 6X,R2=0.994 9。

分別取0.2 mL質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g/L 的精油溶液于5 mL離心管中，加入 3.8 mL TPTZ 工作液(0.3 mol/L 醋酸鹽緩沖液，10 mmol/L TPTZ 溶液，20 mmol/L FeCl3溶液以V(醋酸鹽緩沖液) ∶V(TPTZ溶液) ∶V(FeCl3溶液)=10 ∶1 ∶1混合，現(xiàn)用現(xiàn)配)，37 ℃下反應(yīng)10 min，測定其在波長為593 nm 處的吸光度。每組重復(fù)3次，取平均值。通過FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到4種不同化學(xué)類型樟樹葉精油的FRAP值。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟樹葉精油成分分析結(jié)果

采用GC-MS對不同化學(xué)類型樟樹葉精油化學(xué)組成進(jìn)行分析，GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1。

a.芳樟linalool; b.腦樟camphor; c.異樟isonerolidol; d.油樟cineol

按峰面積歸一化法計算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，經(jīng)計算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫檢索對比，同時參考有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工檢索，確定精油中的化合物組成，分析結(jié)果見表1。

表1 不同化學(xué)型樟葉油的化學(xué)組分

表1為不同樟樹葉精油的GC-MS分析結(jié)果，4種樟樹葉精油共檢測出46種主要化學(xué)成分，其中，共有的主要化學(xué)成分有24種，包括萜烯類15種、醇類5種。另外，有10種成分只在2種精油中被檢測到，有12種成分只在1種精油中被檢測到。

芳樟葉精油中共鑒定出33種化合物，占總揮發(fā)性物質(zhì)的97.47%，其中，萜烯類17種(13.88%)，醇類10種(80.40%)，精油主要成分為芳樟醇(71.91%)、牛兒烯(4.24%)、3-辛烯-2-醇(4.22%)等；腦樟葉精油中共鑒定出33種化合物，占總揮發(fā)性物質(zhì)的97.33%，其中，萜烯類20種(37.38%)，醇類8種(53.34%)，精油主要成分為樟腦(46.28%)、α-蒎烯(7.19%)、(+)-檸檬烯(5.18%)；異樟葉精油中共鑒定出35種化合物，占總揮發(fā)性物質(zhì)的94.19%，其中，萜烯類18種(25.05%)，醇類10種(56.90%)，精油主要成分為異橙花叔醇(29.48%)、桉油烯醇(11.42%)、芳樟醇(10.97%)、蒿酮(9.70%)，其中蒿酮為異樟葉精油中獨(dú)有的成分，且含量較高；油樟葉精油中共鑒定出33種化合物，其占總揮發(fā)性物質(zhì)的97.30%，其中萜烯類18種(42.9%)，醇類9種(23.64%)，精油主要成分為：1,8-桉葉油素(30.31%)、檜烯(15.52%)、α-松油醇(11.27%)、α-蒎烯(6.09%)，其中檜烯和α-松油醇的含量明顯高于其它幾種精油?？梢姡愓寥~精油中所檢測到的主要化學(xué)成分種類最多，芳樟葉精油中醇類物質(zhì)含量最高，油樟葉精油中萜烯類物質(zhì)含量最高。

2.2 樟樹葉精油的抗氧化活性

2.2.1DPPH自由基清除能力 4種樟樹葉精油的DPPH自由基清除能力比較如表2所示，4種精油的DPPH自由基清除能力均與濃度呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系。

表2 不同樟樹葉精油的DPPH·和·ABTS+清除能力

從表中數(shù)據(jù)可以看出，4種樟樹葉精油都具有一定的DPPH自由基清除能力，并且隨著精油質(zhì)量濃度的增加，精油的DPPH自由基清除率逐漸增加。4種精油中，腦樟葉精油的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為8 g/L時，腦樟葉精油的DPPH自由基清除率達(dá)到30.34%±1.25%；當(dāng)精油質(zhì)量濃度為0.5～4 g/L時，4種精油清除DPPH自由基能力大小順序為：腦樟葉精油>油樟葉精油>芳樟葉精油> 異樟葉精油，但當(dāng)精油質(zhì)量濃度為8 g/L時油樟葉精油清除DPPH自由基能力低于芳樟葉精油。BHA在較低質(zhì)量濃度(1 g/L)下自由基清除率為81.20%±0.75%，明顯好于樟樹精油。

2.2.2ABTS自由基清除能力 4種樟樹葉精油的ABTS自由基(·ABTS+)清除能力亦見表2，由數(shù)據(jù)可知4種精油的·ABTS+清除能力均與濃度呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系。

從數(shù)據(jù)可以看出，4種樟樹葉精油都具有一定的·ABTS+清除能力，并且隨著精油濃度的增加，精油的·ABTS+清除率逐漸增加。4種精油中，異樟葉精油的·ABTS+清除能力最強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為8 g/L時，異樟葉精油的·ABTS+清除率達(dá)到14.93%±2.32%。4種樟樹葉精油清除·ABTS+能力順序為：異樟葉精油>腦樟葉精油>芳樟葉精油>油樟葉精油。此外，隨著精油濃度的增加，異樟葉精油和腦樟葉精油的·ABTS+清除率增長速度明顯大于芳樟葉精油和油樟葉精油。對于·ABTS+，BHA在4 g/L的濃度下，自由基清除率為90.02%±0.06%，相同濃度下，異樟葉油的清除率為9.43%±0.43%。

2.2.3總抗氧化能力(FRAP) 根據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)得到4種樟樹葉精油抗氧化能力與精油濃度關(guān)系如圖2所示。

圖2 不同樟樹葉精油對Fe3+的還原能力Fig.2 Fe3+ reduction ability of four essential oils

從圖2中可以看出，4種樟樹葉精油均具有一定的Fe3+還原能力，并且，隨著精油濃度的增加，對Fe3+的還原能力也逐漸增加。4種精油中，腦樟的Fe3+還原能力相對較強(qiáng)，只在濃度為4 g/L時，F(xiàn)e3+還原能力略低于異樟精油，當(dāng)精油為8 g/L時，F(xiàn)RAP值達(dá)到(1.44±0.13)mmol/L，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。當(dāng)精油為0.5～4 g/L時，異樟葉精油的FRAP值與腦樟葉精油的FRAP值相近；當(dāng)精油為8 g/L時，異樟葉精油的FRAP值為(1.18±0.11)mmol/L，也具有較強(qiáng)的抗氧化能力。油樟葉精油與芳樟葉精油的FRAP值相近，當(dāng)精油質(zhì)量濃度為8 g/L時，F(xiàn)RAP值分別為(0.51±0.31)mmol/L和(0.52±0.24)mmol/L，抗氧化能力相對較弱。因此，4種精油總抗氧化能力順序為：腦樟葉精油>異樟葉精油>芳樟葉精油/油樟葉精油。

與BHA相比，4種不同類的樟樹精油綜合抗氧活性明顯不如BHA，但植物精油為天然物質(zhì)，具有綠色、清潔環(huán)保的優(yōu)勢，所以此研究預(yù)計有很好應(yīng)用前景。

目前，研究人員進(jìn)行了大量關(guān)于抗氧化作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，植物精油的抗氧化活性多與其豐富的酚類及萜類物質(zhì)有關(guān)[16-18]。而樟葉精油中雖幾乎不含有酚類物質(zhì)，但其富含萜烯類化合物，因此具有良好的抗氧化活性。由于樟葉精油中化學(xué)成分組成復(fù)雜，因此其抗氧化作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

3 結(jié) 論

3.1采用GC-MS分析鑒定樟樹葉精油成分，4種樟樹葉精油共檢測出46種主要化學(xué)成分，萜烯類占主要部分。芳樟葉精油中共鑒定出33種化合物，占總揮發(fā)性物質(zhì)的97.47%，其中，主要成分芳樟醇為71.91%，萜烯類17種(13.88%)，醇類10種(80.40%)；腦樟葉精油中共鑒定出33種化合物，占總揮發(fā)性物質(zhì)的97.33%，其中，主要成分樟腦為46.28%，萜烯類20種(37.38%)，醇類8種(53.34%)；異樟葉精油中共鑒定出35種化合物，占總揮發(fā)性物質(zhì)的94.19%，其中，主要成分異橙花叔醇為29.48%，萜烯類18種(25.05%)，醇類10種(56.90%)；油樟葉精油中共鑒定出33種化合物，占總揮發(fā)性物質(zhì)的97.30%，其中，主要成分1,8-桉葉油素為30.31%，萜烯類18種(42.9%)，醇類9種(23.64%)。

3.24種樟樹葉精油對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力及總抗氧化能力的結(jié)果表明：4種精油均具有一定的抗氧化能力，且隨精油濃度的增加，其抗氧化能力增強(qiáng)。其中，腦樟葉精油的DPPH自由基清除能力及Fe3+還原能力最強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為8 g/L時，腦樟葉精油的DPPH自由基清除率為30.34%±1.25%，F(xiàn)RAP值為(1.44±0.13)mmol/L；而異樟葉精油的ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為8 g/L時，異樟葉精油的ABTS自由基清除率為14.93%±2.32%。