白蘭蘭 駱倩倩 劉冉冉 張洪芹

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 山東 煙臺(tái) 264003；2 煙臺(tái)市中心血站；3 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；4 濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科

原發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)是指卵巢組織的功能過(guò)早衰竭，好發(fā)年齡≤40歲育齡期婦女，其特點(diǎn)是卵巢功能下降，促性腺激素升高，雌激素水平降低[1-3]?？紤]到該疾病不僅有一系列功能損傷，而且在大多數(shù)情況下沒(méi)有明確的結(jié)局，POI一詞被認(rèn)為比卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)更準(zhǔn)確。在臨床上，隨著腫瘤發(fā)病率的增加及年輕化趨勢(shì)，因化療導(dǎo)致卵巢功能低下和不孕的患者日漸增多，成為 POI發(fā)病的一個(gè)重要原因[4-5]。順鉑(cis-platin，CP)是目前常用的化療藥物之一，其通過(guò)形成CP-DNA加合物從根本上限制了 DNA復(fù)制，損傷顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞以及卵泡膜細(xì)胞，最終引起以卵泡閉鎖、細(xì)胞凋亡為特征的卵巢衰竭[6]。近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療成為臨床研究的熱點(diǎn)，為POI的臨床治療提供了新的希望。但目前MSCs，尤其是臍帶間間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymalstem cells，UCMSCs)對(duì)POI的作用機(jī)理研究甚少。另外，我們的前期研究證實(shí)，干細(xì)胞恢復(fù)POI的卵巢功能可能與干細(xì)胞分泌因子調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)[7]，而在卵泡發(fā)育過(guò)程中卵泡膜細(xì)胞的功能同樣重要，卵泡膜細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和抑制顆粒細(xì)胞的凋亡[8-9]，在卵泡閉鎖過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這提示卵泡膜細(xì)胞在卵巢功能調(diào)控，尤其是卵泡閉鎖過(guò)程中的作用有臨床實(shí)際意義。表達(dá)于各期卵泡的卵泡膜細(xì)胞孤兒核受體NR4A1在不同刺激因子作用下，主要通過(guò)磷酸化作用調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。有研究表明，在多囊卵巢綜合征中，NR4A1表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)抑制凋亡或增加有絲分裂引起卵巢中小卵泡的卵泡膜細(xì)胞過(guò)度增殖[10-11]。但人UCMSCs對(duì)POI大鼠的治療作用及卵巢中卵泡膜細(xì)胞表達(dá)的NR4A1在此治療過(guò)程中的機(jī)制研究甚少。因此，我們以CP構(gòu)建的化療性POI大鼠模型為對(duì)象，探討 NR4A1 在 UCMSCs治療POI過(guò)程中的作用機(jī)制，為臨床上UCMSCs 治療POI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為POI患者減輕病癥痛苦。

1 材料與方法

1.1 材料 5周齡雌性wistar大鼠(濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司)，E2、FSH ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，順鉑、蘇木精(sigma公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche公司)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Biosciences公司)，NR4A1抗體(proteintech公司)，SDS-PAGE配膠試劑盒(碧云天科技有限公司)，低糖DMEM培養(yǎng)基、McCoy’s 5A培養(yǎng)基、膠原酶、青霉素、鏈霉素(GIBCO公司)，胎牛血清(AusGeneX公司)。

1.2 CP誘導(dǎo)的POI大鼠模型 將5周齡雌性wistar大鼠30只隨機(jī)分為對(duì)照組、POI組、POI+UCMSCs組，每組10只。對(duì)照組腹腔注射等量的0.9%生理鹽水，POI組腹腔注射CP(2 mg/kg，溶于0.9%生理鹽水)，注射7 d。POI+UCMSCs組待注射CP觀察1周后，尾靜脈注射UCMSCs懸液(1×106個(gè)/mL)。 注射1 周后，取大鼠的血清及卵巢組織進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中雌激素(E2)、卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平 將3組大鼠的血液樣品4℃靜置過(guò)夜，3 000 r/min離心15 min后取上清，根據(jù)E2、FSH的ELISA說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組血清中E2、FSH的水平。

1.4 蘇木精‐伊紅(hematoxylin-eosin)染色 將3組大鼠的卵巢組織經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、石蠟切片，制備成5 μm厚的切片，經(jīng)烤片、脫蠟、蘇木精及伊紅染色后進(jìn)行封片，并在光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢的形態(tài)學(xué)改變。

1.5 TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)卵巢中細(xì)胞的凋亡情況 將3組大鼠卵巢組織制備成15 μm的冰凍切片，室溫過(guò)夜，根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凋亡檢測(cè)，并用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察卵泡膜細(xì)胞的凋亡情況。

1.6 大鼠卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞(theca-interstitial cells，TICs)的體外培養(yǎng)、鑒定 選用5周齡雌性wistar大鼠，4%水合氯醛麻醉后，取出大鼠的卵巢組織，在體視顯微鏡下用針頭將卵泡刺破，使顆粒細(xì)胞流出，收集剩余組織，用5 mg/mL的膠原酶在37℃溫箱消化1 h，然后用McCoy’s 5A培養(yǎng)液(McCoy’s 5A培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青、鏈霉素)1 500 r/min 離心5 min，在6孔板中用McCoy’s 5A培養(yǎng)液進(jìn)行離體培養(yǎng)。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞色素P450c17α(cytochrome P450, family 17, subfamily A, polypeptide 1，Cyp17a1)及卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)的表達(dá)對(duì)離體培養(yǎng)的TICs進(jìn)行鑒定[12-14]。

1.7 western blot檢測(cè)NR4A1的表達(dá)變化 將TICs隨機(jī)分為對(duì)照組、CP組、CP+UCMSCs組，CP組、CP+UCMSCs組分別用濃度為4 mg/L的CP，濃度為4 mg/L的CP及McCoy’s 5A培養(yǎng)液∶UCMSCs懸液(1×106個(gè)/mL)的體積比按照1∶1處理22 h，收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解法分離蛋白樣品，并用蛋白上樣緩沖液進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉等用NR4A1抗體(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜。次日用羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的HRP(1∶5 000)室溫孵育1 h后，用Tanon 5200進(jìn)行ECL曝光，并利用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CP及UCMSCs處理后TICs的凋亡情況 將TICs用CP及UCMSCs處理后，胰酶消化后收集各組的TICs，PBS洗滌2次，加入500 μL的Binding buffer將細(xì)胞重懸，加入Annexin V和FITC各5 μL，混勻。室溫避光反應(yīng)15 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血清中E2、FSH 水平和卵巢的形態(tài)學(xué)改變 卵巢的形態(tài)學(xué)改變及血清中E2、FSH水平反映了卵巢的功能。如圖1和表1、2所示，與對(duì)照組相比，POI組大鼠卵巢中各級(jí)卵泡的數(shù)目明顯減少，而“類黃體樣”結(jié)構(gòu)明顯增多，UCMSCs處理后卵巢中卵泡的數(shù)目明顯增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，POI組血清中E2水平明顯下降(P<0.01)、FSH水平升高(P<0.05)。與POI組相比，POI+UCMSCs組各級(jí)不同發(fā)育階段的卵泡數(shù)量明顯增多，血清中E2水平升高、FSH水平降低(P<0.05)。

A.三組大鼠卵巢木精‐伊紅染色圖像(× 100)；B. 三組大鼠卵巢中各級(jí)卵泡數(shù)目比較；C. 三組大鼠血清中E2水平比較；D. 三組大鼠血清中FSH水平比較。*P<0.05，**P<0.01。
圖1 三組大鼠血清中 E2、FSH水平及卵巢形態(tài)學(xué)的改變

表1 三組大鼠卵巢中各級(jí)卵泡數(shù)目比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01，與POI組比較，#P<0.05，##P<0.01。

表2 三組大鼠血清中E2、FSH水平

注： 與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01，與POI組比較，#P<0.05。

2.2 大鼠卵巢中細(xì)胞的凋亡情況 在卵泡閉鎖過(guò)程中，顆粒細(xì)胞比卵泡膜細(xì)胞更容易凋亡。如圖2和表3所示，三組大鼠卵巢中均有顆粒細(xì)胞凋亡的發(fā)生。并且與對(duì)照組相比，POI組大鼠卵巢中凋亡細(xì)胞的數(shù)目明顯增多(P<0.01)。POI+UCMSCs組顆粒細(xì)胞凋亡的數(shù)目明顯減少(P<0.01)，這提示UCMSCs能夠明顯減少顆粒細(xì)胞的凋亡。

A. 三組大鼠卵巢中凋亡的顆粒細(xì)胞TUNEL染色圖像(400×)，綠色顯示的是FITC標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，藍(lán)色顯示的是DAPI復(fù)染的細(xì)胞核；B.三組大鼠卵巢中凋亡的顆粒細(xì)胞數(shù)目比較，**P<0.01。
圖2 三組大鼠卵巢中凋亡的顆粒細(xì)胞數(shù)目分析

表3 三組大鼠卵巢中凋亡的顆粒細(xì)胞數(shù)目比較

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01，與POI組比較，##P<0.01。

2.3 TICs的形態(tài)學(xué)改變、鑒定及NR4A1的表達(dá)變化 如圖3所示，對(duì)體外離體培養(yǎng)的TICs的形態(tài)及特異性標(biāo)記分子Cyp17a1表達(dá)的觀察發(fā)現(xiàn)，P1代TICs呈長(zhǎng)梭形，免疫熒光和western blot結(jié)果顯示TICs細(xì)胞質(zhì)中Cyp17a1表達(dá)陽(yáng)性，而FSHR表達(dá)陰性。另外，在TICs的細(xì)胞核中有NR4A1的表達(dá)。其中FSHR、NR4A1、Cyp17a1、GAPDH的分子量分別是78、64、50、36 kd。通過(guò)western blot對(duì)CP及UCMSCs處理后NR4A1的表達(dá)變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CP處理后，TICs表達(dá)的NR4A1水平降低(P<0.01)，而CP+UCMSCs組NR4A1表達(dá)水平有所升高(P<0.05)(表4)。

A.TICs的形態(tài)觀察，P1代TICs呈長(zhǎng)梭形(200×)；B～C. 免疫熒光和western blot結(jié)果顯示TICs細(xì)胞質(zhì)中Cyp17a1表達(dá)陽(yáng)性，而FSHR表達(dá)陰性；D～E. western blot檢測(cè)CP及UCMSCs處理后TICs的NR4A1的表達(dá)變化，*P<0.05，**P<0.01。
圖3 TICs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、特異性分子Cyp17a1、FSHR的表達(dá)(400×)及CP及UCMSCs對(duì)TICs的NR4A1表達(dá)水平的影響

表4 CP及UCMSCs處理后TICs的NR4A1灰度值分析

注： 與對(duì)照組比較，**P<0.01，與CP組比較，#P<0.05。

2.4 CP及UCMSCs處理后TICs的凋亡情況 如圖4和表5所示，CP處理后能夠增加TICs的凋亡情況，而CP+UCMSCs組凋亡比例明顯下降(P<0.01)。

表5 三組TICs凋亡細(xì)胞數(shù)目分析

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01，與CP組比較，**P<0.01。

A～C. 流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)對(duì)照組、CP組、CP+UCMSCs組TICs各期凋亡細(xì)胞的數(shù)目；D. 三組TICs的凋亡細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，**P<0.01。
圖4 CP及UCMSCs處理后TICs的凋亡情況

3 討論

目前MSCs已應(yīng)用于多種疾病的治療過(guò)程中，并取得了一定的治療效果。POI患者常因閉經(jīng)或不孕進(jìn)行臨床就診，目前還沒(méi)有有效的方法恢復(fù)患者的卵巢功能，對(duì)患者的家庭及社會(huì)產(chǎn)生明顯的影響。因此本研究以CP誘導(dǎo)形成的POI大鼠動(dòng)物模型為研究對(duì)象，對(duì)UCMSCs治療POI的治療作用和可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。我們通過(guò)對(duì)CP和UCMSCs處理過(guò)的卵巢形態(tài)學(xué)改變及激素水平進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，UCMSCs能夠恢復(fù)POI卵巢中的各級(jí)卵泡的數(shù)目和血清中激素水平。這提示UCMSCs能夠恢復(fù)POI卵巢的功能，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。POI發(fā)生最重要的機(jī)制是卵泡功能障礙和以卵泡閉鎖、細(xì)胞凋亡為特征的卵巢衰竭，卵泡耗竭[15]。在卵泡閉鎖過(guò)程中，顆粒細(xì)胞比卵泡膜細(xì)胞更容易凋亡，顆粒細(xì)胞層在閉鎖的發(fā)展期急劇減少，而卵泡膜細(xì)胞過(guò)度增生。在閉鎖末期，顆粒細(xì)胞幾乎消失，卵泡膜細(xì)胞被纖維母細(xì)胞取代。這提示顆粒細(xì)胞的凋亡是卵泡閉鎖的首要指征，卵泡膜細(xì)胞改變是卵泡閉鎖發(fā)生的重要指征。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物體內(nèi)卵巢的凋亡結(jié)果顯示，顆粒細(xì)胞在三組大鼠的卵巢中均有凋亡的發(fā)生，而卵泡膜細(xì)胞未發(fā)生凋亡。在動(dòng)物體內(nèi)卵泡膜細(xì)胞的凋亡不易被檢測(cè)到，但卵泡膜細(xì)胞過(guò)度增生并被纖維母細(xì)胞取代的現(xiàn)象在POI卵巢中可被觀察到，有研究通過(guò)masson染色發(fā)現(xiàn)在POI卵巢的類黃體樣結(jié)構(gòu)中有明顯的纖維存在[16]。我們之前研究發(fā)現(xiàn)MSCs通過(guò)調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮其治療作用[17]。在卵泡發(fā)育過(guò)程中卵泡膜細(xì)胞的功能同樣重要，卵泡膜細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和抑制顆粒細(xì)胞的凋亡[8,18]，在卵泡閉鎖過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這提示卵泡膜細(xì)胞在卵巢功能調(diào)控，尤其是卵泡閉鎖過(guò)程中的作用有臨床實(shí)際意義。表達(dá)于各期卵泡卵泡膜細(xì)胞的NR4A1在不同刺激因子作用下，主要通過(guò)磷酸化作用調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。非磷酸化的NR4A1 表達(dá)于細(xì)胞核，而在一些刺激信號(hào)的作用下，NR4A1 發(fā)生磷酸化，表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。在其他組織發(fā)生凋亡過(guò)程中，磷酸化的 NR4A1 從細(xì)胞核移位至細(xì)胞質(zhì)，定位于線粒體，與 Bcl-2 結(jié)合使其構(gòu)象發(fā)生改變，與此同時(shí)，線粒體釋放細(xì)胞色素 C 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，最終胱天蛋白酶(caspase)作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，通過(guò)激活其他 caspase 分子，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19-20]。本實(shí)驗(yàn)的免疫熒光和western blot結(jié)果顯示在TICs中有NR4A1的表達(dá)，并且經(jīng)CP及UCMSCs處理后TICs表達(dá)的NR4A1水平明顯發(fā)生改變。TICs經(jīng)CP處理后，其細(xì)胞凋亡明顯增加，并且NR4A1的表達(dá)明顯下降，而UCMSCs處理明顯減少了TICs的凋亡數(shù)目，其表達(dá)的NR4A1水平也有所增加。這提示TICs表達(dá)的NR4A1在POI發(fā)生以及UCMSCs治療過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。有文獻(xiàn)指出MSCs通過(guò)旁分泌的作用恢復(fù)POI卵巢的功能[21-22]。因此，我們認(rèn)為：UCMSCs通過(guò)旁分泌的作用，調(diào)節(jié)TICs表達(dá)的NR4A1水平，繼而減少卵泡膜細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)目，增加卵泡膜細(xì)胞對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，改善POI卵巢的功能。