任志軍,康 茜,常麗云,陳穎彬,王紫燕,夏 穎,秦建華,趙月蘭 (河北農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院,

河北保定071001)

牛病毒性腹瀉/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一種極為復雜、呈多種臨床類型的疾病。臨床上以發(fā)熱、黏膜糜爛、潰瘍、白細胞減少、腹瀉、急性死亡、孕畜流產、免疫耐受、持續(xù)性感染和免疫抑制為主要特征[1-2]。BVDV 不僅感染牛,也能感染綿羊、山羊、豬、鹿和其他反芻動物,此外還可以人工感染家兔[3-4]。病毒感染可以激活宿主細胞中的許多信號傳導途徑,從而引起宿主細胞內細胞因子的表達變化[5-6]。COX-2即環(huán)氧合酶2,是一完整的膜結合蛋白,在正常生理條件下,COX-2 處于不表達或低表達狀態(tài),而在病理條件下COX-2 能夠迅速表達上調,且COX-2被激活后,能夠催化花生四烯酸產生多種前列腺素,參與機體多種生理及病理過程[7]。IL-8 是一種強有力的活化因子和中性粒細胞趨化因子,當機體出現(xiàn)炎癥反應時,IL-8 表達增加,通過血管內皮層滲透到組織間隙和炎癥區(qū)域[8]。MIP-3α,即巨噬細胞炎性蛋白3α,2000年以后開始稱為CC亞族趨化因子配體20,即CCL20,為CC 亞族的趨化細胞因子,主要表達于巨噬細胞、淋巴粒細胞和樹突狀細胞。MIP-3α可以誘導白細胞到炎癥反應部位,并通過淋巴回路對白細胞的數(shù)量進行調節(jié)。有研究結果顯示,該種因子與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,血管生成和局部的炎性細胞浸潤有關,并且與癌細胞的轉移與播散也有較為密切的聯(lián)系[9]。生長調節(jié)致癌基因α(growth-regulated oncogene alpha,GRO-α)蛋白,是由107個氨基酸組成的細胞因子,其受體主要是與IL-8 共用的CXCR2[10]。為了解BVDV 感 染Madin-Darby 牛 腎 細 胞(Madin-Darby bovine kidney cells,MDBK)和家兔后的炎癥因子變化,本試驗從MDBK 細胞和家兔小腸、脾臟中分別擴增出炎癥反應關鍵酶COX-2 和炎癥因子IL-8、MIP-3α、GRO-α的基因片段,建立實時熒光相對定量RT-PCR 方法用于檢測這4種炎癥因子在細胞和組織中感染病毒前后的表達變化,以便在RNA轉錄水平上揭示BVDV 感染后的炎癥因子變化,為研究BVDV 感染宿主細胞的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株、試驗動物、試劑及儀器MDBK 細胞,由本實驗室保存；BVDV NADL 毒株,購自中國獸藥監(jiān)察所。試驗家兔,選擇1 月齡雄兔,購自保定兔場。胎牛血清,購自杭州四季青公司；DMEM、胰蛋白酶,購自索萊寶科技有限公司；總RNA 提取試劑、反轉錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、p MD19-T載體等,購自Ta KaRa公司；SYBR GreenⅠ實時定量PCR 試劑盒,購自北京全式金生物有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(DHP9032),哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司產品；生物安全柜(ZHIJ-1112C),鄭州南北儀器設備有限公司；實時熒光定量PCR 儀,Roche公司LightCycler?96。

1.2 引物設計及合成根據(jù)GenBank中的炎癥因子GAPDH、COX-2、IL-8、MIP-3α 和GRO-α 登錄序列,運用Primer 5.0軟件設計合成引物,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物的序列如表1。

表1 PCR 引物序列與退火溫度

1.3 BVDV的增殖取已凍存的MDBK 細胞進行復蘇,待其培養(yǎng)穩(wěn)定后,取1瓶長勢為單層的細胞,將病毒原液稀釋10倍接種于細胞上,37℃吸附1 h后,棄上清液,加入含2%胎牛血清維持液,繼續(xù)培養(yǎng)觀察；2 d后將細胞反復凍融3次,收集病毒懸液,并測定其TCID50。

1.4 BVDV感染MDBK 細胞模型的建立將長勢良好的細胞,PBS清洗3遍,胰酶消化后,接種于6孔板,一組接種1 m L病毒懸液(100TCID50)作為試驗組,另一組吸取1 m L 無血清DMEM 作為對照組。置于5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中37℃吸附2 h后棄去吸附液,換上細胞維持液(即含有2%胎牛血清的DMEM),37℃培養(yǎng)8 h。

1.5 BVDV 感染家兔模型的建立用無血清DMEM (含雙抗)將純化病毒稀釋至105.5TCID50/m L。將10只家兔隨機分為2組,一組為對照組,每只耳靜脈注射2 m L 含雙抗的無血清DMEM；另一組為試驗組,每只家兔耳靜脈注射2 m L 病毒懸液。攻毒7 d后,將全部家兔處死,分別取各組的小腸組織和脾臟。

1.6 細胞總RNA的提取

1.6.1 BVDV 感染MDBK 細胞RNA 的提取 收獲BVDV 感染前后的MDBK 細胞,提取MDBK 細胞總RNA,具體操作步驟按總RNA 提取試劑盒說明書進行。

1.6.2 家兔脾細胞和小腸細胞的分離和RNA 的提取 將取下的小腸組織去除系膜之后,先用PBS 溶液沖洗數(shù)次,除去腸內容物；縱向剖開腸道,用PBS洗數(shù)次；然后將腸段剪碎約1 mm3,轉入50 m L 尖底離心管中,3 000 r/min離心5 min；去上清,沉淀即小腸細胞。分別分離各組的小腸細胞,提取總RNA,具體操作步驟按總RNA 提取試劑盒說明書進行。

將脾臟組織用PBS清洗后,剪切成1 mm3的小塊；加入0.25% 胰酶液,37℃條件下消化30 min；在300目篩上輕輕研磨組織,得到濾液,2 000 r/min離心10 min；棄上清液,加入紅細胞裂解液0.5 m L,常溫裂解5 min,離心5 min；PBS 2 m L 重懸,離心5 min；棄上清液,加入PBS 5 m L,再離心1次,棄上清,沉淀即為脾細胞。分別分離各組的脾細胞,提取總RNA,具體操作步驟按總RNA 提取試劑盒說明書進行。

1.7.1 cDNA 的合成 按照1 g×DNA Eraser Buffer 1.0 m L、gDNA Eraser 1.0μL、RNA Free Water 3μL、RNA 5.0μL 于冰上配成反應體系,42℃水浴鍋中反應2 min,即為去除基因組后的RNA；最后放于冰上備用。并按如下反轉錄體系進行反轉錄：去除基因組DNA 反應液10μL、Primer-Script RT Enzyme Mix 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×PrimerScript Buffer 4.0μL、RNA Free Water 4.0μL,加入液體后輕輕搖晃后放置于PCR儀中進行作用：42℃15 min,85℃5 min。最后將反轉錄產物cDNA 放于－20℃留存。

1.7.2 相關炎癥因子基因的擴增克隆和鑒定 PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃20 s,60℃20 s,72℃20 s,35 個循環(huán)；72℃延伸5 min,4℃終止反應。經1.5% 瓊脂凝膠電泳回收目的片段,與p MD19-T 載體16℃過夜連接,轉化DH5α感受態(tài)細胞,通過Amp板37℃過夜培養(yǎng),挑取單菌落培養(yǎng)后提取質粒,PCR 鑒定為陽性后送博邁德基因技術有限公司測序。

1.7.3 實時熒光相對定量PCR 檢測相關炎癥因子方法的建立 分別以目的基因和內參基因的重組質粒為模板以10 倍梯度稀釋后進行實時熒光定量PCR,實時熒光定量PCR 反應程序：95℃20 s,60℃20 s,72℃20 s,退火延伸時收集熒光信號。獲得擴增各基因的標準曲線,擴增效率E 值,通過溶解曲線分析擴增的特異性。45個循環(huán)后進行溶解曲線分析,每個樣品設3個重復。

1.7.4 相關炎癥因子m RNA 表達量的檢測 取反轉錄后cDNA,以GAPDH 基因為內參,按上述所建立的相對定量PCR 方法檢測各個樣品中COX-2和IL-8、MIP-3α、GRO-α的相對轉錄水平。采用比較Ct法(ΔΔCt)法分析相對定量結果。首先計算各個樣品中目的基因與內參基因Ct差值,然后設各試驗條件中對照組COX-2的表達量為1,通過Ct值計算公式：ΔΔCt＝(Ct目的基因－Ct內參基因)試驗組－(Ct目的基因－Ct內參基因)對照組,計算相對差異倍數(shù),即QR＝2－ΔΔCt,并進行統(tǒng)計學分析。?表示差異顯著(P＜0.05),??表示差異極顯著(P＜0.01)。

2 結果

2.1 目的基因PCR 擴增與鑒定結果提取的總RNA 經過反轉錄和PCR 擴增,結果見圖1。得到與預期大小相符的單一擴增條帶,GAPDH 為248 bp,COX-2 為208 bp,IL-8 為212 bp,MIP-3α為172 bp,GRO-α為163 bp。將目的基因回收純化后,連接到p MD19-T 載體中。經測序GAPDH 大小為248 bp,COX-2 為208 bp,IL-8 為212 bp,MIP-3α為172 bp,GRO-α為163 bp,與預期結果一致。通過BLAST 發(fā)現(xiàn)測序所得序列與GenBank中登錄序列相比同源性均在97%以上,證明擴增和回收的片段是目的基因片段(圖2)。

圖1 目的基因擴增的結果 M.DL2000 DNA Marker；1～5.分別為MIP-3α、COX-2、GRO-α、IL-8 和GAPDH 的 目標片段

2.2 實時熒光PCR產物的特異性分析經儀器分析軟件得到PCR 產物的溶解曲線見圖3,炎癥反應關鍵酶COX-2和炎癥因子IL-8、MIP-3α、GRO-α和內參基因GAPDH 的溶解溫度分別是84～91℃,均成單峰,無引物二聚體或其他雜峰,表明特異性良好。

2.3 目的基因與內參基因的擴增效率通過儀器分析軟件獲得目的基因及內參基因的標準擴增曲線,見圖4,擴增效率E 值分別為EGAPDH＝2.03,EMIP-3α＝2.05,ECOX-2＝2.07,EGRO-α＝2.07,EIL-8＝2.05,對應的擴增相關系數(shù)R2分別為1.00,1.00,0.99,1.00,0.99,表明Ct值與模板濃度的線性關系較好。

2.4 BVDV 感染MDBK 前后COX-2、IL-8、MIP-3α、GRO-α 表達譜BVDV 感染MDBK 細胞8 h前后各炎癥因子的表達量見圖5,在BVDV 感染MDBK 細胞8 h后,COX-2、IL-8、GRO-α基因表達量均顯著高于對照組(P＜0.01),而MIP-3α 在BVDV 感染MDBK 細胞前后沒有顯著差異；表明BVDV 感染正常MDBK 細胞會促進COX-2、IL-8、GRO-α基因的表達。

圖2 測序序列BLAST 比對結果 A.內參基因GAPDH；B.MIP-3α基因；C.COX-2基因；D.GRO-α基因；E.IL-8基因

圖3 4種炎癥因子與內參基因相對定量PCR 擴增的溶解曲線 A.內參基因GAPDH；B.MIP-3α基因；C.COX-2 基因；D.GRO-α基因；E.IL-8基因

2.5 BVDV感染家兔前后脾細胞和小腸細胞COX-2、IL-8、MIP-3α、GRO-α表達譜家兔小腸和脾細胞感染前后各炎癥因子的表達量見圖6,7。在BVDV 感染家兔7 d后,家兔小腸細胞中MIP-3α表達量與健康家兔無明顯差異,而脾臟中MIP-3α的表達量相比健康家兔明顯上升,為2.84 倍(P＜0.01)。在BVDV 感 染 家 兔7 d 后,COX-2、IL-8、GRO-α基因表達量也均顯著高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)。表明BVDV 感染正常家兔后會促進小腸細胞中COX-2、IL-8、GRO-α基因的表達以及脾細胞中COX-2、IL-8、MIP-3α、GRO-α 基因的表達。

3 討論

免疫機能健全的健康易感牛群中發(fā)生的首次BVDV 感染通常為急性感染。BVDV 急性感染會造成病毒血癥、繁殖障礙、免疫抑制等,導致機體繼發(fā)感染幾率大大增加[4,11]。本試驗通過模擬BVDV急性感染,對BVDV 感染前后COX-2、IL-8、MIP-3α、GRO-α的表達量進行測定,發(fā)現(xiàn)感染后COX-2、IL-8、GRO-α的表達量均顯著高于未感染前。從BVDV 感染后COX-2 m RNA 的顯著升高可以得出結論,COX-2參與了BVDV 感染宿主的病理過程。COX-2 的啟動子序列中含有核轉錄因子κB(NFκB)特異結合序列,該序列與NF-κB 結合后可以促進COX-2 基因的轉錄,因而COX-2 表達的上調伴隨NF-κB 的活化[7]。參與IL-8誘導的經典轉錄因子是NF-κB。在人體胃癌中,NF-κB 通過正反饋作用調控IL-8 轉錄進而刺激腫瘤血管生成,促進腫瘤的浸潤和轉移[12]。IL-8 在胃癌中通過上調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)表達來促進腫瘤轉移,高度表達的IL-8 參與促結腸癌的生長轉移。在結腸癌中,NF-κB 刺激IL-8 產生,且內源性IL-8 又能激活NF-κB[13]。FREDERICKSEN等[14]發(fā)現(xiàn)BVDV-1能夠通過NF-κB信號傳導途徑誘導牛細胞中IL-8的產生。另有報道發(fā)現(xiàn)GRO-α在結腸癌肝轉移的細胞中誘導的信號轉導通路主要與NF-кB及AKT 相關[10]。COX-2、IL-8及GROα的調控都與NF-кB信號通路相關,推測BVDV 感染宿主的過程中是通過激活NF-к 途徑來促使COX-2、IL-8和GRO-αm RNA 表達上調。

圖4 炎癥因子與內參基因PCR 擴增標準曲線 A.內參基因GAPDH；B.MIP-3α基因；C.COX-2基因；D.GRO-α基因；E.IL-8基因

圖5 BVDV 感染MDBK 細胞前后COX-2、IL-8、MIP-3α、GRO-α的m RNA 表達譜 與對照組相比,?P ＜0.05；??P＜0.01。下同

圖6 BVDV 感染家兔小腸細胞前后COX-2、IL-8、MIP-3α、GRO-α的m RNA 表達譜

圖7 BVDV 感染家兔脾細胞前后COX-2、IL-8、MIP-3α、GRO-α的mRNA 表 達譜

MIP-3α在BVDV 感染MDBK 前后并無顯著性差異(P＞0.05),而在感染后的家兔脾臟細胞中表達量有顯著升高(P＜0.01)；這就說明BVDV 感染細胞并不會直接誘導MIP-3α的增加,可能是通過機體的免疫途徑誘導產生。作為重要的新型免疫細胞之一,輔助性T 淋巴細胞17(Th17)所介導的炎癥反應在纖維化發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。在局部組織病灶募集Th17 的過程中,需要大量趨化因子。作為一類小分子質量趨化因子,巨噬細胞炎性蛋白3α(MIP-3α)能有效結合Th17 表面高表達的趨化因子受體6,并形成趨化軸,能有效招募Th17[9]。脾臟中有免疫細胞如巨噬細胞,在細胞受到病毒感染后激活免疫途徑促使MIP-3α表達量增加。推測MIP-3α在脾臟抗BVDV 感染過程中發(fā)揮著重要的作用。

健康牛犢通過鼻腔感染BVDV 的試驗證明,病毒集中存在的部位依次是腸細胞、淋巴結、胸腺、脾臟淋巴結、扁桃體和肝臟[15]。本試驗通過分離BVDV 感染前后小腸細胞和脾細胞,檢測發(fā)現(xiàn)家兔感染后小腸細胞和脾細胞中COX-2、IL-8、GRO-α m RNA 表達量顯著高于未感染組(P＜0.01或P＜0.05),而只有脾細胞中MIP-3αm RNA 表達量顯著高于未感染組(P＜0.01)。從BVDV-1感染宿主細胞差異基因分析了解到,差異基因參與的分子功能主要有催化活性、結合活性、酶調節(jié)活性、分子轉導活性和蛋白結合轉錄因子活性等,并且差異表達基因主要參與細胞自噬、細胞凋亡、免疫調節(jié)因子等相關的信號通路[16]。然而這些基因的表達到底是由哪種信號通路的哪種功能調節(jié)的,仍然值得去探索。