董 浩,韓 燾,徐 琦,吳方達(dá),劉林青,陳亞娜,原 霖,宋曉暉,王傳彬? (.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京068；.寧德市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,福建 寧德35000)

布魯菌病(簡(jiǎn)稱布病)是一種由布魯菌感染引起的危害嚴(yán)重的人獸共患病,是我國(guó)法定撲殺的3種動(dòng)物疫病(口蹄疫、結(jié)核病、布病)之一。布魯菌的宿主廣泛,家畜中主要危害牛、羊、豬等。家畜感染布病主要引起雌性動(dòng)物的流產(chǎn)和不孕,雄性動(dòng)物主要引起睪丸腫大。人感染布病主要表現(xiàn)為波浪熱、關(guān)節(jié)疼痛、虛汗、乏力、肝脾腫大等。該病嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的公共衛(wèi)生安全,每年全世界新發(fā)布人感染病病例數(shù)超過(guò)50萬(wàn)[1]。

病原分離是檢測(cè)布病的金標(biāo)準(zhǔn),但是由于分離率低、周期長(zhǎng)、生物安全風(fēng)險(xiǎn)高等因素,應(yīng)用并不廣泛。通過(guò)血清學(xué)方法檢測(cè)動(dòng)物血液中的抗體是目前檢測(cè)布病的主要手段。目前現(xiàn)行的《動(dòng)物布魯菌病檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T18646－2002)中規(guī)定的血清學(xué)檢測(cè)方法有虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)等,然而OIE 陸生動(dòng)物診斷和疫苗手冊(cè)中,很早就將間接ELISA 和競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法納入了國(guó)際通用的布病血清學(xué)檢測(cè)方法[2]。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委2018年2號(hào)公告,新發(fā)布的《動(dòng)物布魯菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646－2018)將于2018年9月1日開(kāi)始實(shí)施,首次將間接ELISA 和競(jìng)爭(zhēng)ELISA 兩種方法納入了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

間接ELISA 和競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法是OIE 推薦的布病檢測(cè)方法,然而,商品化布病ELISA 檢測(cè)試劑盒的市場(chǎng)被IDEXX、SVANOVA 等國(guó)外公司產(chǎn)品長(zhǎng)期壟斷。2015年以來(lái),我國(guó)逐步實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物布病高通量和快速檢測(cè)試劑的國(guó)產(chǎn)化。根據(jù)國(guó)家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//124.126.15.169：8081/cx/),我國(guó)已有獲得新獸藥證書(shū)的ELISA 檢測(cè)試劑盒3種(布魯菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒、牛布魯菌間接ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒和布魯菌cELISA 抗體檢測(cè)試劑盒)和布魯菌抗體檢測(cè)試紙條1種。值得注意的是,目前尚無(wú)任何一家國(guó)外企業(yè)的布病檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了進(jìn)口獸藥注冊(cè)。

為了評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)的間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 和膠體金試紙條方法的敏感性和特異性,我們將這3種檢測(cè)方法與現(xiàn)行的RBT 以及血清學(xué)檢測(cè)方法金標(biāo)準(zhǔn)CFT 進(jìn)行了比對(duì)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品牛布病抗體陰陽(yáng)性血清的樣品和用于臨床檢測(cè)的300份奶牛血清樣品均采自我國(guó)未免疫的奶牛場(chǎng)。

1.2 診斷試劑RBT 抗原、布魯菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒、牛布魯菌間接ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒、CFT 抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清、溶血素和補(bǔ)體均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛布魯菌抗體檢測(cè)卡購(gòu)自上海快靈生物科技有限公司。

1.3 牛布病抗體陰陽(yáng)性血清樣品的準(zhǔn)備選取未免疫的奶牛場(chǎng),收集牛血清樣品,分別用RBT、試管凝集試驗(yàn)和CFT 對(duì)樣品陰陽(yáng)性進(jìn)行判定。最終收集牛布病抗體陽(yáng)性血清60份,牛布病抗體陰性血清60份用于后續(xù)試劑盒比對(duì)工作。

1.4 間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 和膠體金試紙條的比較為比較間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 和膠體金試紙條3種方法的敏感性和特異性,采用上述3種檢測(cè)方法分別對(duì)已知陰陽(yáng)性的陰性血清和陽(yáng)性血清各60份進(jìn)行檢測(cè)。使用不同試劑盒檢測(cè)血清樣品時(shí)嚴(yán)格按照商品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 4種血清學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)臨床樣品效果的比較

為了比較RBT、間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 和膠體金試紙條的檢測(cè)效果,分別用4種方法對(duì)300份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),對(duì)檢測(cè)結(jié)果不一致的樣品采用CFT 進(jìn)行確診。RBT 和CFT 按照GB/T18646－2002 進(jìn)行操作與判定。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)已知陰陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果為了評(píng)價(jià)間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 和膠體金試紙條方法的敏感性和特異性,對(duì)已知陰陽(yáng)性的奶牛血清樣品各60份進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)60份已知的陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果如表1所示,間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試劑盒和膠體金試紙條的敏感性分別為96.67%,100.00%和98.33%；對(duì)60份已知的陰性血清的檢測(cè)結(jié)果如表1所示,間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試劑盒和膠體金試紙條的特異性分別為98.33%,93.33%和93.33%。

2.2 4種血清學(xué)檢測(cè)方法的比對(duì)結(jié)果分別采用RBT、間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA和膠體金試紙條4種檢測(cè)方法對(duì)300份牛的臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示：4種檢測(cè)方法檢測(cè)均為陽(yáng)性的樣品為27份,檢測(cè)均為陰性的樣品為210份,整體符合率為79%。

通過(guò)CFT 對(duì)63份檢測(cè)結(jié)果不一致的樣品進(jìn)行復(fù)核試驗(yàn)。結(jié)果表明,RBT 與CFT 相比,有61 份樣品檢測(cè)結(jié)果不符合,符合率僅為3.17%；間接ELISA 與CFT 相比只有1 份樣品檢測(cè)結(jié)果不符合,符合率為98.41%；競(jìng)爭(zhēng)ELISA 與CFT 相比有8份樣品檢測(cè)結(jié)果不符合,符合率為87.30%；膠體金試紙條與CFT 相比有9份樣品檢測(cè)結(jié)果不符合,符合率為85.71%(表2)。

表1 3種檢測(cè)方法的敏感性和特異性比較

表2 CFT 與RBT、間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、膠體金試紙條的符合情況

在現(xiàn)行《動(dòng)物布魯菌病檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T18646－2002)中,RBT 是推薦的動(dòng)物血清樣品初篩的方法,RBT 檢測(cè)陽(yáng)性后再通過(guò)特異性高的試管凝集試驗(yàn)或CFT 進(jìn)行確診。作為一種初篩方法,RBT 具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),多年來(lái)廣泛用于家畜布病的檢測(cè)。但是隨著敏感性更高的間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 和膠體金試紙條等檢測(cè)方法的逐漸成熟,RBT 較低的敏感性也引起了大家的重視。除此之外,由于受到溶血、試驗(yàn)溫度、交叉反應(yīng)以及反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等因素的干擾,RBT 也會(huì)出現(xiàn)相當(dāng)比例的假陽(yáng)性[3-5]。

2018年9月1日將開(kāi)始實(shí)施的《動(dòng)物布魯菌病檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T18646－2018)將間接ELISA 和競(jìng)爭(zhēng)ELISA 寫(xiě)進(jìn)了檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中,為了評(píng)價(jià)間接ELISA 和競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法檢測(cè)動(dòng)物血清樣品的效果,本試驗(yàn)采用臨床樣品對(duì)RBT、間接ELISA 和競(jìng)爭(zhēng)ELISA 的檢測(cè)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià),并采用血清學(xué)檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)CFT 進(jìn)行了確診。

3 討論

對(duì)120份已知布病抗體陰陽(yáng)性牛血清的檢測(cè)結(jié)果顯示,3種國(guó)產(chǎn)布病檢測(cè)試劑盒的敏感性均高于96%,特異性高于93%,結(jié)果比較理想,適用于血清樣品中布病抗體的檢測(cè)。對(duì)300份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果表明間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、膠體金試紙條3種方法與CFT 的符合率均顯著高于RBT,RBT不僅存在較高比例的假陰性,同時(shí)也存在一定比例的假陽(yáng)性,RBT 作為一種布病診斷初篩的方法,其敏感性和特異性均存在較高風(fēng)險(xiǎn)。

陽(yáng)性動(dòng)物是布病在畜群傳播的重要傳染源,不論是在家畜引種過(guò)程中,還是畜群布病凈化的過(guò)程中陽(yáng)性動(dòng)物的漏檢將對(duì)同場(chǎng)群的易感動(dòng)物造成巨大的感染風(fēng)險(xiǎn)。因此,建議在具備ELISA 檢測(cè)條件的實(shí)驗(yàn)室在GB/T18646－2018開(kāi)始實(shí)施后盡快采用ELISA 替換原始的RBT 方法進(jìn)行布病檢測(cè),在不具備ELISA 檢測(cè)條件的情況下可以選擇使用敏感性較高的膠體金試紙條進(jìn)行布病的初篩,或者增加畜群RBT 檢測(cè)的頻率從而盡可能減少陽(yáng)性動(dòng)物的漏檢。