袁建彬,王訢丞,徐佩戎,胡惠潔,楊煥民,郭景茹 (黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院,黑龍江 大慶163319)

運輸是一種復雜的應激源,其中動物暴露于一系列負面刺激,如振動,新的環(huán)境,溫度和濕度的變化,噪音等其他不良因素,都可能導致福利問題以及經(jīng)濟損失。肉牛的運輸是現(xiàn)代多站點養(yǎng)殖業(yè)必不可少的必然過程。運輸對肉牛來說是一種強烈的應激過程,可能誘發(fā)多種疾病甚至死亡,從而造成巨大的經(jīng)濟損失。然而,肉牛運輸應激發(fā)生的分子機制尚不清楚。在應激發(fā)生過程中,生物系統(tǒng)會激活不同的機制以維持其相應的各種應激功能。研究表明,應激條件可以使miRNAs表達發(fā)生變化,進而影響生物學功能。miRNAs是一類長度為20～24個核苷酸的小型非編碼RNA,可以在轉錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達,并在各種生物過程中發(fā)揮關鍵的調(diào)節(jié)作用,例如發(fā)育,細胞分化,細胞凋亡,腫瘤發(fā)生以及各種生物中的免疫和應激反應。了解運輸動物中的miRNAs表達模式可能有助于闡明運輸應激反應的調(diào)節(jié)機制,這將有助于設計增強運輸應激抵抗力的策略。miR-31在眾多癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關鍵性的作用。研究發(fā)現(xiàn),miR-31可以作為一個重要的促癌基因[1],同時,有研究表明,miR-31的過表達可以促進細胞增殖并增強癌細胞的遷移和侵襲能力[2],在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著致癌作用[3]。探究運輸應激與miR-31 可能的潛在關系,是本試驗的目的所在。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器CFX96型熒光定量PCR 儀(美國Bio-rad公司)；反轉錄試劑盒RR047A(日本Takara公司)；核酸蛋白測定儀(美國Thermo 公司)；混合型球磨儀MM400(德國Retsch公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)。

1.2 實驗動物及分組本試驗以體況良好的雜交肉牛為試驗對象,以速度80 km/h公路運輸。隨機將10頭試驗牛平均分為運輸0 h組和運輸6 h組,每組5頭。運輸過程中禁食、禁水,采集肝臟組織,儲存于－80℃條件,用于后續(xù)試驗。

1.3 引物設計及合成依照miR-31的序列設計引物,序列見表1,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。試驗將U6作為內(nèi)參。

表1 miRNA 的引物序列

1.4 肝臟組織總RNA提取和cDNA合成取0.1 g肝臟組織樣品,使用球磨儀加入適量液氮研磨破碎,利用Trizol一步法提取肝臟組織中總RNA；將測定濃度后的RNA 進行反轉錄,反轉錄的具體操作步驟依照Ta KaRa RR047A 反轉錄試劑盒說明進行。

1.5 肝臟組織中miR-31表達的檢測使用CFX96型熒光定量PCR 儀(Bio-rad)對肉牛肝臟組織中miR-31表達進行檢測,按照Ta KaRa熒光定量PCR試劑盒步驟進行操作。25μL體系依次加入如下試劑,見表2。循環(huán)參數(shù)設置如下：首先95℃條件預變性30 s；95℃條件變性5 s,接下來60℃條件退火延伸30 s,按照上述條件進行40個循環(huán)。建立融解曲線,在合適的區(qū)間進行溶解試驗。

1.6 統(tǒng)計學分析采用2－ΔΔCt法對所得qRT-PCR結果進行統(tǒng)計學分析。使用獨立t檢驗對數(shù)據(jù)進行顯著性分析,P＜0.01差異極顯著,P＜0.05差異顯著。

表2 熒光定量PCR 反應體系

1.7 對miR-3 進行生物信息學分析應用Targetscan、miRWalk、miRDB 和miRTarBase 4 款軟件對miR-31的靶基因進行預測分析,再對miR-31參與的生物學進程進行Geneontology(http：//geneontology.org/)分析,從而篩選出與運輸應激相關性強的靶基因。

1.8 miR-31候選靶基因功能富集分析利用Gene ontology進行靶基因的功能研究,以牛(bos taurus)基因組作為背景基因,對miR-31 靶基因生物學過程進行富集分析。

2 結果

2.1 肝臟組織中miR-31 表達量的變化使用qRT-PCR 方法檢測肉牛肝臟中miR-31 的相對表達量,結果顯示,與運輸0 h組相比,運輸6 h組肝臟組織中miR-31相對表達量極顯著上升(P＜0.01)。

2.2 Go 富集分析結果應用Targetscan、miRWalk、miRDB 和miRTar Base 4 款 軟 件 對miR-31靶基因進行預測,結果如圖2所示,Targetscan中預測到427種靶基因；miRWalk中預測到1 261種靶基因；miRDB 中預測到122種靶基因；miRTarBase中預測到307種靶基因。

圖2 miR-31靶基因預測統(tǒng)計圖

2.3 生物信息學分析結果通過GO 分析(http：//amigo.geneontology.org/amigo/search/annotation)繪制出miR-31靶基因參與的生物進程。結果顯示,miR-31參與多種生物過程,其中細胞過程,生物調(diào)節(jié),代謝過程,多細胞生物過程,對刺激的反應等富集靶基因較多。

圖3 miR-31參與的生物學進程

3 討論

運輸作為肉牛從養(yǎng)殖到深加工過程中一項關鍵環(huán)節(jié)已成為影響肉牛品質的常見應激源,對動物內(nèi)環(huán)境有著巨大影響。運輸應激會改變某些細胞因子、熱休克蛋白和急性期蛋白的表達水平[4-5]。運輸過程中特定指標的變化證明其可用于運輸過程中動物福利的評估[6],這些指標被認為是應激診斷的參考標記。然而,迄今為止,尚未確定能夠全面準確地評估應激發(fā)生的單一指標。研究已經(jīng)證實了生物體中miRNAs的變化以響應不同的應激。miRNA 因其具有高度的保守性、時序性和組織特異性,眾多研究人員將miRNAs作為多種疾病候選診斷標志物。動物中miRNAs的表達因環(huán)境應激而變化,包括熱應激和冷應激等[7-9]。有研究表明,火雞運輸應激期間miR-22、miR-155和miR-365 3種miRNAs表達上調(diào),表明循環(huán)miRNAs的表達水平可能具有區(qū)分應激和無應激動物的診斷價值。肝臟是身體的重要代謝器官,在受到外界不良刺激時,機體會迅速調(diào)動肝臟的活動性,抵御應激。檢測動物肝臟中miRNAs的表達變化,可以為動物應激評估帶來新的方式與手段。

miRNAs通過其微調(diào)基因表達的能力,成為抗應激反應過程中強大的適應性反應的關鍵參與者。已有大量研究在小鼠、牛、其他哺乳動物體內(nèi)探討了miRNAs在環(huán)境應激反應中的作用[10]。然而,在運輸應激條件下,對于肉牛肝臟miRNAs的研究內(nèi)容仍很淺顯。本試驗以運輸應激的肉牛為研究對象,分析發(fā)生運輸應激反應后肉牛肝臟中miR-31的變化,為深入探討肉牛運輸應激的分子基礎和運輸應激相關miRNAs的變化提供線索。GO 富集功能分析表明,運輸應激相關的miRNAs參與了許多生物過程,其中細胞過程,生物調(diào)節(jié),代謝過程,多細胞生物過程,對刺激的反應等富集靶基因較多,推測miR-31通過參與上述生物過程參與應激反應。有研究人員發(fā)現(xiàn),應激時能量代謝的加快與肝臟密切相關,所以選取肝臟組織作為樣品,探究運輸應激與肝臟miRNAs間的關系。研究miR-31在運輸肉牛肝臟中的表達模式,這將有利于動物運輸和航空航天研究,并可將miR-31 作為潛在的運輸應激診斷生物標志物。

miRNAs通常以負調(diào)控的方式作用于靶基因。RAB27A、PPP2R2A 和ARID1A 可 能 是 與 應 激 聯(lián)系密切的miR-31 的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)miR-31 可以調(diào)控細胞凋亡。Rab27A 能夠促進細胞的增殖和侵襲,并抑制細胞凋亡。PPP2R2A 是一種蛋白磷酸酶,其與細胞生長、凋亡和分化密切相關,同時其活性異常會導致腫瘤發(fā)生。目前已證明PPP2R2A 可抑制MAPK/ERK 信號途徑中的MAK、MAPK 和ERK 去磷酸化,促使MAPK ERK 信號通路失活[11]。另有研究表明PPP2R2A 能直接調(diào)節(jié)腫瘤細胞中凋亡抑制因子BCL-2和凋亡促進因子Bad的活性達到抑制腫瘤細胞的目的[12]。ARID1A 是染色質重塑復合物SWI/SNF 中的一種非催化亞基,具有非序列特異性DNA 結合活性,參與DNA 的復制、轉錄、修復和重組等,其異常表達影響著胚胎發(fā)育、組織生長、細胞增殖、分化和凋亡,并參與DNA合成及DNA 損傷后修復,同樣作為一種抑癌基因。有研究表明,氧化應激可降低ARID1A 的表達[13]。我們發(fā)現(xiàn)ARID1A 表達的敲低導致細胞內(nèi)ROS水平增加[14]。同樣,有研究表明,ROS 通過調(diào)節(jié)其啟動子的甲基化降低ARID1A 基因的表達水平[15]。

本試驗中對運輸應激肉牛肝臟miR-31的相對表達量進行檢測,發(fā)現(xiàn)miR-31 顯著上升。在運輸應激條件下,miR-31可能通過作用于生物調(diào)節(jié),代謝過程,多細胞生物進程,對刺激的反應等生物學進程來抵抗應激,并且對細胞增殖和凋亡可能有重要影響。了解運輸動物miRNA 的表達模式可能有助于闡明運輸應激反應的調(diào)節(jié)機制,這將有助于設計增加運輸壓力抵抗力的策略。本試驗對探究運輸應激與miR-31的關系具有重要意義,為miR-31在肉牛肝臟組織中調(diào)控應激反應的研究提供參考。