丁寶娟 安利佳 蘇 喬

(大連理工大學生物工程學院，大連 116023)

鉀是植物生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)元素之一，占植物干重的2%～10%，參與多種生理生化過程，包括蛋白質合成、光合作用和滲透調節(jié)等[1～2]。地殼中鉀含量豐富，但能被植物吸收利用的速效鉀不足[3]。玉米(ZeamaysL.)作為世界三大糧食作物之一，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。土壤缺鉀嚴重影響了玉米的產(chǎn)量和品質。通過遺傳改良的方式提高玉米的鉀營養(yǎng)是解決這個問題的有效途徑之一。

植物對鉀的吸收主要依靠鉀離子通道和鉀離子轉運體兩大鉀轉運系統(tǒng)，前者主要包括Shaker通道、TPK通道和Kir-like通道[4]，后者主要包括KUP/HAK/KT轉運體，Trk/Ktr/HKT轉運體、KEA轉運體和CHX轉運體[5～7]。其中，Shaker通道和KUP/HAK/KT轉運體是目前研究最為廣泛的兩大家族。目前已從棉花(Gossypiumhirsutum)[8]、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)[9]、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)[10]、霸王(Zygophyllumxanthoxylum)[11]和水稻(Oryzasativa)[12]等植物中分離得到AKT1基因。Ahmad等[12]研究發(fā)現(xiàn)過表達OsAKT1基因可以提高水稻的鉀營養(yǎng)吸收。Duan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，過表達SsAKT1基因在低鉀條件下能夠提高鹽地堿蓬的鉀吸收能力。KUP/HAK/KT鉀轉運體家族存在于植物、真菌和細菌中，參與植物體內(nèi)K+的吸收和轉運，提高植物的耐鹽性以及對干旱脅迫的反應[13]。KUP/HAK/KT鉀轉運體在植物的發(fā)育過程也起到重要的作用，例如根毛的生長和生長素的分布等[14]。目前，研究人員已從碧桃(Prunuspersica)[15]、木薯(Manihotesculenta)[16]、棉花(Gossypiumhirsutum)[17]和柳杉(Cryptomeriajaponica)[18]等植物中克隆得到鉀轉運蛋白基因。譚穎等[19]在煙草中過表達NtHAK1基因顯著提高了轉基因煙草的鉀吸收能力。Han等[20]的研究表明，過表達KUP7基因能夠提高轉基因擬南芥的K+吸收。Song等[21]在水稻中過表達空心蓮子草的ApKUP3基因，提高了轉基因水稻的K+吸收。Wang等[17]在擬南芥中過表達GhKT2基因，低鉀條件下轉GhKT2基因擬南芥的干重和K+含量顯著高于野生型。

TrkH是一種細菌鉀轉運蛋白，其在細菌中的結構和功能已進行了詳盡的研究[22]，但在植物中的功能未知。本實驗室前期從海洋微生物宏基因組DNA中克隆得到細菌鉀轉運蛋白基因trkH(Accession Number:MK863632)，在酵母和煙草中驗證了功能。本研究采用農(nóng)桿菌介導的幼胚侵染法，以Hi-Ⅱ基因型的玉米為受體品種，將trkH基因導入玉米中，通過鉀耗竭實驗分析了轉trkH基因玉米的K+吸收功能，為獲得鉀營養(yǎng)高效的玉米新品種奠定基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 植物材料和表達載體

植物材料為Hi-Ⅱ基因型玉米。植物表達載體為pTF101:trkH，含有目的基因trkH和篩選標記基因Bar，為本實驗室構建和保存(圖1)。

1.2 培養(yǎng)基

玉米轉化培養(yǎng)基及其組成見表1。

1.3 農(nóng)桿菌介導的玉米遺傳轉化

參照Frame等[23]的方法進行玉米轉化，方法略有修改，農(nóng)桿菌菌液濃度為OD550=0.35～0.45，抗生素為200 mg·L-1的頭孢噻肟。

圖1 pTF101:trkH載體結構簡圖Fig.1 Schematic representation of pTF101:trkH vector

表1 培養(yǎng)基組成

1.4 T0代轉化植株的PCR檢測

采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒進行玉米基因組DNA的提取，利用表2中trkH和Bar基因的引物分別進行PCR擴增。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

表2 PCR檢測的引物序列

1.5 T1代轉基因植株Bar試紙條檢測

根據(jù)QuickStixTMKit for LibertyLink?(bar) Cotton Leaf & Seed說明書進行Bar基因的蛋白水平檢測。

1.6 T1代轉基因植株的半定量RT-PCR檢測

將部分T0代轉基因植株與玉米骨干自交系PH6WC雜交，獲得8個T1代株系。采用TRIZol試劑提取玉米葉片總RNA，根據(jù)大連寶生物公司PrimerScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進行反轉錄反應。以反轉錄得到的cDNA為模板進行半定量RT-PCR檢測，以EF-1α為內(nèi)參基因，trkH和EF-1α引物序列見表2。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，27個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.7 T1代轉基因植株的遺傳分析

選取籽粒飽滿的8個T1代轉基因株系玉米種子各30粒，播種到含有營養(yǎng)土的花盆中，待玉米幼苗長至三葉一心期時，噴灑除草劑，統(tǒng)計T1代轉基因株系的分離比。選取分離比接近1∶1的轉基因株系進行PCR檢測，trkH引物序列見表2，PCR反應條件同1.4。統(tǒng)計PCR檢測結果并進行χ2測驗。

1.8 T1代轉基因植株的鉀離子耗竭分析

切取少量玉米胚乳組織，采用堿煮法[24]提取L3、L5和L7轉基因株系T1代種子的基因組DNA。為保證遺傳背景盡量一致，經(jīng)PCR檢測后，以PCR檢測陽性材料為轉基因玉米，以PCR檢測陰性材料為野生型進行鉀離子耗竭實驗。將玉米種子進行簡單的表面消毒后于托盤中萌發(fā)3～5 d。萌發(fā)的玉米幼苗定植到1/2 Hoagland[25]營養(yǎng)液中進行通氣培養(yǎng)，pH6.0，每3天更換一次營養(yǎng)液。待幼苗長至四葉一心期時，分別將轉基因植株和野生型植株轉移至缺鉀的1/2 Hoagland營養(yǎng)液中，其中，KH2PO4用NaH2PO4替代，KNO3用Ca(NO3)2替代，其余成分相同，饑餓處理48 h。饑餓處理后，將玉米幼苗轉移至耗竭液(0.2 mmol CaSO4，1 mmol KCl)中，每隔12 h取樣一次，每次吸取1 mL溶液，并用雙蒸水補足體積，耗竭處理72 h，玉米幼苗在處理期間保持通氣狀態(tài)。采用原子吸收光譜儀測定樣品中的鉀離子含量。

2 結果與分析

2.1 轉基因玉米植株的獲得

采用農(nóng)桿菌介導的幼胚侵染法對玉米Hi-Ⅱ品種進行遺傳轉化。在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，生長良好的幼胚會變大且質地堅硬(圖2:a)；經(jīng)過7 d的恢復培養(yǎng)，會誘導出Ⅱ型愈傷組織，此時可通過愈傷組織的生長狀態(tài)來判斷幼胚是否可以轉移至篩選培養(yǎng)基中(圖2:b)；經(jīng)過4～6周的篩選培養(yǎng)后，獲得蓬松狀態(tài)的抗性愈傷(圖2:c～d)；將抗性愈傷分成小塊，在再生Ⅰ培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，長出呈乳白色的胚狀體(圖2:e)；挑選生長健壯的胚狀體轉移至再生Ⅱ培養(yǎng)基中，2周后生長出再生苗(圖2:f)。最終獲得T0代Baster抗性苗21株。

圖2 農(nóng)桿菌介導玉米的遺傳轉化 a.共培養(yǎng)；b.恢復；c～d.篩選；e.胚狀體；f.再生植株Fig.2 Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize a.Co-cultivation; b.Resting; c-d.Selection; e.Embryoid; f.Regeneration plant

圖3 轉trkH基因植株的PCR檢測 a.trkH基因；b.Bar基因 M.DL2000 Marker；H.ddH2O；WT.野生型植株；1～21.轉基因植株Fig.3 PCR detection of the trkH transgenic plants a. trkH gene; b. Bar gene; M. DL2000 Marker; H. ddH2O; WT. Wild type; 1-21. Transgenic plants

圖4 轉trkH基因植株的Bar試紙條檢測 WT.野生型植株；1～21.轉基因植株Fig.4 Bar strip detection of trkH transgenic plants WT. Wild type; 1-21. Transgenic plants

2.2 T0代Baster抗性植株的鑒定

以提取的玉米基因組DNA為模板，對目的基因trkH和篩選標記基因Bar進行PCR檢測，擴增出符合預期大小的片段，表明目的基因和篩選標記基因成功轉入到玉米基因組中(圖3)。Bar試紙條檢測結果表明，21株抗性苗出現(xiàn)了檢測線，而野生型植株沒有出現(xiàn)檢測線，說明Bar基因在蛋白水平上成功表達(圖4)。

2.3 T1轉基因植株的半定量RT-PCR分析

將部分T0代轉基因植株與玉米骨干自交系PH6WC進行雜交，收獲8個T1代株系。半定量RT-PCR檢測結果表明，T1代株系在轉錄水平上均能表達，且表達量差異不大(圖5)。

圖5 T1代轉trkH基因植株的半定量RT-PCR WT.野生型植株；L1～L8.轉基因植株Fig.5 Semi-quantitative RT-PCR detection of T1trkH transgenic plants WT. Wild type; L1-L8. Transgenic plants

2.4 T1代轉基因植株的遺傳分析

選取籽粒飽滿的T1代轉基因株系玉米種子各30粒，三葉一心期時噴灑除草劑，非抗性植株葉片逐漸萎黃，直至死亡。然后統(tǒng)計分離比，選擇其中比例接近1∶1的L3、L5和L7轉基因株系進行PCR檢測。切取少量玉米胚乳組織，采用堿煮法提取玉米基因組DNA，將其作為模板，利用trkH基因的引物進行PCR擴增，統(tǒng)計PCR檢測結果并進行χ2測驗，結果表明L3、L5和L7轉化株系的后代均符合孟德爾分離定律(表3)。

表3 轉trkH基因玉米T1代遺傳分析

注：PCR+.陽性植株；PCR-.陰性植株χ2=3.841，P<0.05

Note:PCR+.Positive plants; PCR-.Negative plantsχ2=3.841，P<0.05

圖6 T1代轉trkH基因植株在1 mmol K+濃度下的耗竭實驗Fig.6 Depletion experiment of T1trkH transgenic plants at 1 mmol K+ concentration

2.5 T1代轉基因植株的K+耗竭實驗

為評估低K+脅迫下過表達trkH基因能否提高轉基因玉米的K+吸收能力，挑選四葉一心期的轉基因和野生型玉米進行K+耗竭實驗。結果表明，在1 mmol K+濃度條件下耗竭處理72 h，L3、L5和L7轉基因玉米的K+吸收能力高于野生型(圖6)。

3 討論

土壤缺鉀影響玉米的產(chǎn)量和品質，培育鉀營養(yǎng)高效的玉米品種是解決這個問題的途徑之一。本研究通過農(nóng)桿菌介導的幼胚侵染法將細菌鉀轉運蛋白基因trkH轉入玉米Hi-Ⅱ幼胚中。PCR檢測結果初步表明外源基因trkH成功轉入玉米基因組中。半定量RT-PCR檢測結果表明trkH基因在轉錄水平上表達。Bar試紙條檢測結果表明Bar基因在蛋白水平上表達。將T0代轉基因株系與PH6WC雜交，對其后代進行PCR檢測，結果符合1∶1的孟德爾分離比，推測L3、L5和L7轉基因株系為單拷貝且可以穩(wěn)定遺傳。玉米苗期鉀耗竭實驗結果表明轉基因玉米的鉀吸收能力高于野生型，與Ahmad等[12]在水稻中過表達OsAKT1基因、Han等[20]在擬南芥中過表達KUP7基因和Song等[21]在水稻中過表達ApKUP3基因的研究結果一致。

細菌Trk系統(tǒng)主要包括介導K+轉運的跨膜亞基TrkH或TrkG以及外圍調節(jié)亞基TrkA，多數(shù)情況下細菌中TrkH實現(xiàn)K+跨膜轉運需要TrkA的輔助調節(jié)；真菌中的Trk系統(tǒng)表現(xiàn)為單一亞基結構，只有介導離子轉運的跨膜亞基，并沒有輔助的調節(jié)亞基。推測可能是由于真核系統(tǒng)較為復雜，有其他提供能量或者調節(jié)激活的機制[5,22,26～27]。本實驗室前期從海洋微生物宏基因組DNA中克隆得到細菌鉀轉運蛋白基因trkH，在酵母和煙草中驗證了其功能，結果表明TrkH在高等生物中可以不依賴于TrkA發(fā)揮鉀吸收的功能。本研究表明單獨過表達trkH基因能夠提高轉基因玉米的鉀吸收能力，為培育鉀營養(yǎng)高效玉米新品種奠定基礎。