王金昌，靳 亮，劉卓榮，占智高，況文東，關(guān)麗梅

(江西省科學(xué)院微生物研究所，330096，南昌)

0 引言

扁刺蛾(Thosea sinensis Walker)屬于鱗翅目中的刺蛾科，又名黑點(diǎn)刺蛾、洋辣子。扁刺蛾分布廣(東南亞一些國(guó)家和我國(guó)23個(gè)省份均有分布)、食性雜(寄主達(dá)37科71種)[1－2]，主要寄主有油茶、茶樹(shù)、核桃、柿、棗、蘋(píng)果、梨、烏桕、楓香、楓楊、楊、大葉黃楊、柳、桂花、苦楝、香樟、泡桐、油桐、梧桐、喜樹(shù)、銀杏、桑、櫟、板栗等林木和果樹(shù)。

扁刺蛾在南昌1年發(fā)生2～3代[3]，幼蟲(chóng)齡期為:1齡2 d，2齡3－4 d，3齡5－6 d，4齡7－8 d，5齡6－9 d，6齡5－10 d，幼蟲(chóng)歷期約28－40 d左右[4]，為害時(shí)間從5－10月長(zhǎng)達(dá)半年。扁刺蛾在南昌的寄主達(dá)30科43種植物[4]，是江西省的主要食葉害蟲(chóng)之一，低齡幼蟲(chóng)可將葉片吃成網(wǎng)狀，殘留葉脈，4齡后則食成缺刻和孔洞，僅留葉柄和主脈。6齡后食量大增，將全葉食盡，造成果實(shí)減產(chǎn)[5]。一般情況下葉片損失10%～15%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)30%以上[6];扁刺蛾聚集產(chǎn)卵及幼蟲(chóng)間的相互吸引導(dǎo)致扁刺蛾幼蟲(chóng)在某一棵寄主上高密度聚集，食光整棵樹(shù)的葉片，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致樹(shù)木死亡[7]。

扁刺蛾幼蟲(chóng)除危害樹(shù)木外，幼蟲(chóng)觸及人的皮膚可引起皮炎，受刺部位有劇烈灼痛感，重者劇痛難忍，少數(shù)可伴有頭痛、頭昏、惡心、嘔吐、心悸、周身不適及局部淋巴結(jié)腫痛等癥狀[6，8－9]，刺蛾變應(yīng)原似可引起變應(yīng)性哮喘[10]。因此防治扁刺蛾，既有生產(chǎn)上的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，又具有保障人類(lèi)身心健康的重要意義[11]。

蔡秀玉等于1964年7月在北京首次發(fā)現(xiàn)扁刺蛾核型多角體病毒(Thosea sinensis Nuclear Polyhedrosis Virus，TsNPV)，其后相繼在江西、河北、安徽、湖南、山東也發(fā)現(xiàn)TsNPV。該病毒能夠通過(guò)水平擴(kuò)散和垂直傳遞在扁刺蛾種群內(nèi)傳播，自然感染率一般為43%，高時(shí)可達(dá)70%～87.2%以上，甚至達(dá)100%，是控制扁刺蛾種群數(shù)量的重要生物因子[12－14]。

近年來(lái)，扁刺蛾在南昌各小區(qū)、道路、果園和茶園泛濫成災(zāi)，防治扁刺蛾可采用人工抓捕扁刺蛾幼蟲(chóng)，清除蟲(chóng)繭，用燈誘殺成蟲(chóng)等輔助手段，目前主要是用化學(xué)農(nóng)藥防治[15]。但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，不僅造成林區(qū)的農(nóng)藥殘留超標(biāo)，而且在殺滅害蟲(chóng)的同時(shí)也傷害了害蟲(chóng)的天敵(螳螂、獵蝽、剌蛾廣肩小蜂、刺蛾紫姬蜂、寄蠅、絨繭蜂、赤眼蜂等[6])，破壞了生態(tài)平衡，同時(shí)還容易引起害蟲(chóng)的抗藥性，不利于有害生物的可持續(xù)控制。最好的辦法是采用生物防治，其中噴施TsNPV病毒制劑是最有效的手段。

在江西省南昌市艾溪湖濕地公園里發(fā)現(xiàn)扁刺蛾幼蟲(chóng)自然死亡的蟲(chóng)尸，通過(guò)研磨蟲(chóng)尸、離心純化，再次感染扁刺蛾，得到了更多病毒樣死亡癥狀的蟲(chóng)尸。經(jīng)過(guò)再次樣品純化，電鏡切片觀(guān)察，初步判定該病原物是一種多角體病毒，同時(shí)進(jìn)行了生測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料 供試扁刺蛾幼蟲(chóng):江西省南昌市艾溪湖濕地公園里大葉黃楊生長(zhǎng)的扁刺蛾幼蟲(chóng)。養(yǎng)蟲(chóng)器皿:禧天龍迷你收納盒。人工飼料:大葉黃楊帶葉片的枝條(飼喂前用無(wú)菌水洗滌3次，晾干，用紫外線(xiàn)照15 min)。病毒來(lái)源:江西省南昌市艾溪湖濕地公園里大葉黃楊扁刺蛾幼蟲(chóng)自然死亡的蟲(chóng)尸。

1.1.2 試驗(yàn)藥劑及器材 病毒制劑:自已分離的TsNPV。

1.2 TsNPV病毒實(shí)驗(yàn)

1.2.1 TsNPV病毒室內(nèi)增殖實(shí)驗(yàn) 把TsNPV病毒原液用無(wú)菌水稀釋至1×106PIB/mL，用塑料噴壺噴灑到大葉黃楊帶葉片的枝條上，陰干后放入禧天龍迷你收納盒內(nèi)，接入采集的4－6齡扁刺蛾幼蟲(chóng)。28℃，光照周9:15飼養(yǎng)至扁刺蛾幼蟲(chóng)全部死亡。其間每天注意觀(guān)察，飼毒48 h后換上新鮮的大葉黃楊帶葉片的枝條，及時(shí)取出病死扁刺蛾幼蟲(chóng)置4℃冰箱保存。

1.2.2 TsNPV病毒的提取 取扁刺蛾幼蟲(chóng)死亡的蟲(chóng)尸，用已滅菌的0.02 mol/L pH7.2 PBS浸泡10 min，激烈振蕩或渦旋1 min，用3層沙布過(guò)濾，濾液進(jìn)行差速離心數(shù)次(先800 r/min離心5 min，取上清;再以4 000 r/min離心5 min棄去上清，無(wú)菌水懸浮)，直至獲得較純凈的多角體為止。在光學(xué)顯微鏡下，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并拍照，病毒液置4℃冰箱保存。

1.2.3 TsNPV病毒超薄切片樣品制備與電鏡鑒定 將純化的病毒多角體迅速用電鏡專(zhuān)用戊二醛前固定，用0.1 mol/L PBS漂洗后，用1%四氧化鋨后固定，用0.1 mol/L PBS漂洗;用30%～100%丙酮梯度脫水;用環(huán)氧樹(shù)脂包埋、聚合;半薄切片定位，超薄切片機(jī)切片。醋酸鈾和梓檬鉛溶液雙染色染色后將制好的切片銅網(wǎng)置于200 KV冷凍透射電子顯微鏡FEI Tecnai G20下，加速電壓為200 V，拍攝電鏡照片。

1.2.4 TsNPV病毒的室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn) 將TsNPV病毒用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋成1×107PIB/mL，1×106PIB/mL，1×105PIB/mL，1×104PIB/mL，1×103PIB/mL，1×102PIB/mL，1×101PIB/mL的6個(gè)濃度。用每個(gè)濃度TsNPV病毒液分別浸泡大葉黃楊帶葉片的枝條，晾干，進(jìn)行喂飼實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度做為一組，每組放入一定數(shù)量的扁刺蛾幼蟲(chóng)，分別放在已消毒的容器內(nèi)用濕紗布扎緊封口，涂無(wú)菌水作對(duì)照，重復(fù)2次。感染24 h后加入新鮮清潔葉片繼續(xù)飼養(yǎng)。按試驗(yàn)要求進(jìn)行觀(guān)察記載。計(jì)算死亡率，計(jì)算個(gè)不同病毒濃度的致死中時(shí)間，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 扁刺蛾核型多角體病毒TsNPV擴(kuò)增結(jié)果

扁刺蛾幼蟲(chóng)感染病毒后食欲減退，行動(dòng)遲緩，顯病幼蟲(chóng)先期體色變黃，最后呈黃褐、灰褐或黑褐色，幼蟲(chóng)死亡后，軀體變軟，體內(nèi)組織液化，表皮松弛易破，流出乳白色至褐色膿汁，無(wú)臭味，呈典型“液化型”病癥，見(jiàn)圖1。取液化的扁刺蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞和脂肪組織壓片，可以觀(guān)察到在細(xì)胞核內(nèi)增殖的核型多角體病毒，扁刺蛾核型多角體病毒TsNPV擴(kuò)增成功。

扁刺蛾幼蟲(chóng)感染TsNPV病毒8 d后全部死亡，收集蟲(chóng)尸用PBS浸泡，激烈振蕩后差速離心提取TsNPV，用光學(xué)顯微鏡鏡檢可見(jiàn)折光性很強(qiáng)的病毒多角體，TsNPV鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 幼蟲(chóng)感染病毒死亡后，呈典型“液化型”病癥圖

圖2 TsNPV多角體鏡檢圖(折光性很強(qiáng)的為病毒多角體)

2.2 扁刺蛾核型多角體病毒TsNPV電鏡鑒定

經(jīng)中科院武漢病毒研究所電鏡室進(jìn)行超薄切片電鏡鑒定，此多角體病毒為不規(guī)則多面體，呈五邊形至近圓形。病毒粒子桿伏，單粒包埋于蛋白質(zhì)中，見(jiàn)圖3。從感病幼蟲(chóng)的病癥，多角體和病毒粒子的形態(tài)與大小，按國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第4次報(bào)告，該病毒屬桿狀病毒科，經(jīng)鑒定為核型多角體病毒[16－18]。

圖3 TsNPV切片的200 kV冷凍透射電子顯微鏡圖

2.3 TsNPV病毒生測(cè)結(jié)果

TsNPV病毒生測(cè)結(jié)果如表1所示，從表1中可見(jiàn)1×107PIB/mL、1×106PIB/mL、1×105PIB/mL、1×104PIB/mL、1×103PIB/mL感染扁刺蛾幼蟲(chóng)后2 d內(nèi)扁刺蛾幼蟲(chóng)出現(xiàn)了死亡，扁刺蛾幼蟲(chóng)死亡率隨著感染劑量增加而相應(yīng)提高，1×107PIB/mL、1×106PIB/mL、1×105PIB/mL 3個(gè)濃度感染扁刺蛾幼蟲(chóng)后8－9 d內(nèi)，扁刺蛾幼蟲(chóng)死亡率都達(dá)到了100%。1×107PIB/mL、1×106PIB/mL、1×105PIB/mL 3個(gè)濃度的的半至死時(shí)間都為4 d左右，1×104PIB/mL、1×103PIB/mL、1×102PIB/mL、1×101PIB/mL的4個(gè)濃度的半至死時(shí)間分別為6 d、7 d、8 d和8 d;用Spss軟件進(jìn)行方差分析，主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，從病毒濃度、死亡時(shí)間和病毒濃度*死亡時(shí)間的sig值是0.0000小于0.01，說(shuō)明不同濃度TsNPV在不同時(shí)間對(duì)扁刺蛾幼蟲(chóng)的致死作用效果差異顯著。

表1 TsNPV對(duì)扁刺蛾幼蟲(chóng)感染致死的平均校正死亡率

表2 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)

3 結(jié)論

成功分離、鑒定和擴(kuò)增了扁刺蛾核型多角體病毒TsNPV，這不僅為以病毒治蟲(chóng)提供了病毒毒源，對(duì)我國(guó)昆蟲(chóng)病毒學(xué)的發(fā)展具有一定學(xué)術(shù)意義。扁刺蛾TsNPV能有效殺滅扁刺蛾，對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境，而且能夠在扁刺蛾種群內(nèi)進(jìn)行水平擴(kuò)散和垂直感染，具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。