龍 輝，歐陽(yáng)慧，許偉華，湯美芬，胡新年

廣東省清遠(yuǎn)市婦幼保健院優(yōu)生與遺傳實(shí)驗(yàn)診斷中心，廣東清遠(yuǎn) 511500

珠蛋白生成障礙性貧血(簡(jiǎn)稱地貧)主要見于地中海和東南亞地區(qū)，在我國(guó)則主要集中在長(zhǎng)江以南地區(qū)，以廣西、廣東、海南最多見。2011年廣東省啟動(dòng)地貧預(yù)防控制項(xiàng)目，2012年由項(xiàng)目牽頭單位廣東省婦幼保健院進(jìn)行了全省地貧基線調(diào)查，結(jié)果顯示廣東省地貧基因攜帶率為16.83%[1]。由于重癥地貧是一種致死或致殘性疾病，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神上的負(fù)擔(dān)。因此，在地貧高發(fā)區(qū)開展大規(guī)模地貧的遺傳篩查、遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷，以防止重癥地貧胎兒出生尤為重要。目前常規(guī)的地貧基因檢測(cè)能檢測(cè)出98%的地貧基因型，但仍有2%左右的罕見地貧類型被漏檢。本研究對(duì)96例地貧血液學(xué)表型陽(yáng)性但常見基因型檢測(cè)為陰性的疑似地貧標(biāo)本進(jìn)行罕見及未知地貧基因型檢測(cè)，以進(jìn)一步對(duì)這些標(biāo)本確診，防止漏診和誤診。同時(shí)可發(fā)現(xiàn)新的地貧基因型，豐富中國(guó)人群的地貧基因突變譜，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月至2018年8月在本院血液學(xué)表型篩查為地貧表型陽(yáng)性但常見6種α-地貧基因型(--SEA、-α3.7、-α4.2、αWS、αCS、αQS)或17種β-地貧基因型[CD41-42(-TCTT)、CD71-72(+A)、CD27-28(+C)、CD14/15(+G)、CD17(A T)、CD26(G A)、CD31(-C)、CD43(G T)、IVS-Ⅱ-654(C T)、IVS-Ⅰ-1(G T)、IVS-I-5(G C)、-28(A C)、-29(A G)、-32(C A)、-30(T A)、CAP、IntM]檢測(cè)為陰性的標(biāo)本96例，其中疑似α-地貧88例，疑似β-地貧8例；男60例，女36例；年齡5個(gè)月至36歲,均為清遠(yuǎn)地區(qū)人群。

1.2方法

1.2.1罕見缺失型α-地貧基因檢測(cè) 采用單管多重PCR檢測(cè)罕見泰國(guó)型(--THAI)和菲律賓型(--FIL)缺失α-地貧，引物序列見表1[2]。同時(shí)采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物α-F和α-R作為正常α-珠蛋白基因?qū)φ?，引物由寶生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增試劑為TaKaRa產(chǎn)品(寶生物工程有限公司)，總反應(yīng)體積為25 μL，各引物比例為：10 pmol/μL α-F和α-R各0.5 μL，10 pmol/μL THAI-F和THAI-R各1.2 μL，10 pmol/μL FIL-F和FIL-R各1.5 μL，TaKaRa LA Taq(5 U/μL)0.2 μL,2×GC BufferⅠ 12.5 μL,Template DNA 1 μL,另加ddH2O至總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸75 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增完成后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳30 min，在UVP凝膠成像儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.2罕見α-地貧和β-地貧基因檢測(cè) 罕見α-地貧基因：采用單管多重PCR、熒光定量PCR和DNA測(cè)序法(Sanger雙脫氧末端終止法)檢測(cè)19種(包括--BRIT、--CAL、--CANT、--CL、--GEO、--MA、--MC等)大片段缺失型和69種[包括Initiation codon(A>G)、Codon 22 C>T、CD23(GAG>TAG)、IVS I-1(G>T)等]非缺失型突變。罕見β-地貧基因：檢測(cè)16種罕見缺失型及202種罕見點(diǎn)突變型。上述檢測(cè)均由深圳華大臨床檢驗(yàn)中心完成。

1.2.3未知缺失型β-地貧基因檢測(cè) 采用芯片捕獲測(cè)序法和DNA測(cè)序法檢測(cè)未知缺失型β-地貧基因，該檢測(cè)由深圳華大臨床檢驗(yàn)中心完成。

表1 --THAI和--FIL缺失型α-地貧引物序列

2 結(jié) 果

2.1罕見缺失型α-地貧基因檢測(cè)結(jié)果 采用單管多重PCR從上述疑似α-地貧標(biāo)本中共檢出罕見α-地貧基因型17例，其中泰國(guó)型缺失型(--THAI/αα)5例和菲律賓型缺失型(--FIL/αα)2例，αΔCD303例,α珠蛋白基因拷貝數(shù)增加(αααanti3.7或αααanti4.2)5例,并且發(fā)現(xiàn)2例新的α-地貧突變，即αΔCD272-279delAGCTTCGG和CD167-169insT。--THAI/αα和--FIL/αα凝膠電泳圖見圖1。

注：1和2為αα/αα；3為--FIL/αα；4為--THAI/αα；M為Marker。

圖1單管多重PCR檢測(cè)-THAI/αα和--FIL/αα凝膠電泳圖

2.2罕見α-地貧基因檢測(cè)結(jié)果 發(fā)現(xiàn)1種中國(guó)人群中罕見的突變類型為αΔCD30地貧，以及兩種新的移碼突變，分別為αΔCD272-279delAGCTTCGG和CD167-169insT，見圖2。另外檢測(cè)出5例α珠蛋白基因拷貝數(shù)增加，為αααanti3.7或 αααanti4.2。

2.3罕見和缺失型β-地貧基因檢測(cè)結(jié)果 本研究發(fā)現(xiàn)罕見β-地貧基因型有Poly A(A>G)、-90(C>T)、CD37(TGG>TAG)及IVS-I-2(T>A)4種共8例β-地貧；同時(shí)檢測(cè)出1種新的缺失型β-地貧基因，缺失位置為ch11：5，246，000-5，250，500，大約缺失長(zhǎng)度為4 kb(暫命名為-4.0)。該缺失由2段組成，中間隔500 bp左右，第1段ch11：5，246，800-5，248，900，第2段ch11：5，249，500-5，250，800(圖3A)。后經(jīng)DNA測(cè)序其精確缺失位置為chr11:5，246，816-5，248，920和chr11:5，249，075-5，250，73(圖3B)。

注：A為突變類型αΔCD272-279delAGCTTCGG；C為突變類型CD167-169insT；B和D為正常對(duì)照。

圖2α-珠蛋白基因新的移碼突變DNA測(cè)序圖

注：A為缺失型β-地貧芯片捕獲測(cè)序圖；B為缺失型β-地貧的DNA測(cè)序圖(Sanger測(cè)序)。

圖3新的缺失型β-地貧基因測(cè)序圖

3 討 論

地貧是一組由于一種或幾種珠蛋白基因突變(包括缺失和點(diǎn)突變)所引起的單基因常染色體隱性遺傳性溶血性疾病。地貧臨床表型分為靜止型、輕型、中間型和重型。中間型地貧偶爾需要輸血治療或不需要輸血治療。重型地貧有的未成年即夭折,有的則需要長(zhǎng)期輸血治療，有的甚至在胎兒時(shí)期就胎死腹中,給家庭帶來(lái)巨大的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,控制和降低重型地貧患兒的出生率是目前地貧防治工作的重點(diǎn)。地貧篩查、基因診斷、產(chǎn)前診斷等是預(yù)防生育重癥地貧患兒的有效途徑。由于地貧基因突變的多樣性和復(fù)雜性，目前常規(guī)地貧基因檢測(cè)仍存在漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。因此,必須嚴(yán)格遵循血液學(xué)表型檢查與基因型分析相結(jié)合的分析原則方可得出可靠結(jié)果[2]。對(duì)于地貧血液學(xué)表型陽(yáng)性而未檢出常見基因突變的“疑似地貧”個(gè)體，為盡量避免罕見或未知突變基因型漏檢，需進(jìn)一步做罕見類型地貧基因型檢測(cè)，必要時(shí)還需要進(jìn)行家系分析以確認(rèn)新的突變。近年來(lái)，許多學(xué)者越來(lái)越認(rèn)識(shí)到罕見地貧基因檢測(cè)的重要性，也做了相關(guān)的研究報(bào)道[3-5]，對(duì)防止地貧的漏診、誤診具有指導(dǎo)意義。

本研究通過(guò)對(duì)96例血液學(xué)表型篩查陽(yáng)性但常見地貧基因檢測(cè)陰性患者進(jìn)行罕見類型地貧基因系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)25例罕見地貧突變患者，檢出率為26.0%，其中α-地貧17例，β-地貧8例。但仍有71例未檢出，其中62例為5歲以下兒童，可能存在慢性感染而引起小細(xì)胞低色素貧血。未采用芯片捕獲測(cè)序法對(duì)整個(gè)α和β-珠蛋白基因進(jìn)行測(cè)序，可能存在漏檢。在作者的臨床工作中，以下情況應(yīng)高度懷疑是罕見地貧：(1)罕見α-地貧，HbA2正?；蚪档停刎毢Y查表型為小細(xì)胞低色素貧血，且排除缺鐵性貧血、基因型正常的患者；HbH病表型,但基因型僅為標(biāo)準(zhǔn)型的患者；生育過(guò)HbH病患兒,但基因型正常的父母。(2)罕見β-地貧。HbA2>3.5%,小細(xì)胞低色素貧血,基因型正常的患者；中間型或重型地貧表型,但基因型僅為攜帶者；當(dāng)3.5%

本研究共發(fā)現(xiàn)缺失型、非缺失型、α-珠蛋白基因拷貝數(shù)增加3種罕見α-地貧基因突變類型，并發(fā)現(xiàn)新的移碼突變。罕見缺失型α-地貧為--THAI和--FIL，攜帶這兩種缺失型的個(gè)體，其血液學(xué)表型均符合典型的輕型α-地貧，但常見6種α-地貧基因型檢測(cè)為陰性，如果不對(duì)其血液學(xué)表型特征進(jìn)行綜合分析，很容易對(duì)這兩種缺失型α-地貧漏診[6-7]。--THAI和--FIL缺失型地貧均為α-珠蛋白基因大片段缺失，為α0-地貧，由于這兩種缺失型與其他α-地貧復(fù)合存在時(shí)，在臨床上可形成中、重型α-地貧，因而在中國(guó)人群中檢測(cè)這兩種罕見的缺失型具有重要臨床意義。罕見非缺失型α-地貧為中國(guó)人群中已報(bào)道的αΔCD30雜合突變，該突變位于α2基因外顯子1區(qū)域，影響翻譯后調(diào)節(jié)，使產(chǎn)生的Hb高度不穩(wěn)定，易于降解，從而在翻譯后水平導(dǎo)致Hb水平降低，引起α+-α0-地貧[8]。而α珠蛋白基因拷貝數(shù)增加是由于α珠蛋白基因簇同源序列不等交換形成α三聯(lián)體的結(jié)果，形成常見的兩種基因型為αααanti3.7和αααanti4.2，為α+-地貧[9]。與--SEA合并時(shí)，血液學(xué)主要表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素貧血，與--SEA/αα表型類似，容易引起漏診[10]。本研究在α基因中發(fā)現(xiàn)兩種新的移碼突變，均發(fā)生在α2基因上，一種為HbA2：αΔCD272-279delAGCTTCGG，即在編碼序列第272-279位點(diǎn)缺失了8個(gè)堿基；另一種為HbA2:CD167-169insT，即在編碼序列第167-169位點(diǎn)插入了堿基T，這兩種突變均造成編碼框架發(fā)生改變，可導(dǎo)致氨基酸改變，引起合成的珠蛋白肽鏈不穩(wěn)定。近年來(lái)，中國(guó)人群中新的α-地貧屢有報(bào)道，使中國(guó)人群的地貧基因型更加豐富和復(fù)雜化[11-13]。8例疑為β-地貧但常規(guī)基因檢測(cè)陰性，經(jīng)罕見β-地貧基因型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4種中國(guó)人群中罕見的點(diǎn)突變型，包括Poly A(A>G)：AATAAA>AATGAA、-90(C>T)、CD37(TGG>TAG)及IVS-I-2(T>A)，其中Poly A(A>G)發(fā)現(xiàn)于地貧篩查表型為中間型β-地貧，但常見基因型為CD17(A>T)的患兒。后檢測(cè)罕見β-地貧基因?yàn)镻oly A(A>G)/CD17(A>T)雙重雜合子，即β+/β0，其父為Poly A(A>G)雜合子，其母為CD17(A>T)雜合子。因此，地貧表型篩查結(jié)果與基因型結(jié)果不相符時(shí)，應(yīng)考慮存在罕見地貧基因。β-地貧主要為點(diǎn)突變型，而缺失型罕見。本研究對(duì)1例高度懷疑為β-地貧患者(典型的小細(xì)胞低色素癥，HbA 27.8%，HbF 10.2%)進(jìn)行系統(tǒng)分析，但均未檢出常見和罕見的β-地貧基因。根據(jù)其表型篩查結(jié)果，疑似缺失型β-地貧。經(jīng)芯片捕獲測(cè)序法確定β基因缺失約4 kb，缺失位置為ch11：5，246，000-5，250，500，為5′啟動(dòng)子區(qū)缺失。最后經(jīng)DNA測(cè)序定位于chr11:5，246，816-5，248，920和chr11:5，249，075-5，250，735，即缺失了2段，中間保留了155 bp，該缺失型β-地貧基因少見文獻(xiàn)報(bào)道。由于重癥β-地貧是一種致死或致殘性疾病，常給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。因此，近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)罕見及未知β-基因突變類型不斷被發(fā)現(xiàn)，將有助于地貧的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，從而進(jìn)一步降低重癥地貧患兒出生[14-16]。

總之，對(duì)地貧表型篩查陽(yáng)性但常規(guī)基因檢測(cè)為陰性的“疑似地貧”患者，進(jìn)一步進(jìn)行罕見地貧基因檢測(cè)，有可能發(fā)現(xiàn)罕見和新的地貧突變基因。在臨床實(shí)踐中，對(duì)于地貧的診斷必須遵循表型篩查與基因診斷相結(jié)合的原則，以防誤診和漏診?！耙伤频刎殹钡脑\斷和鑒別診斷，將大大提高遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷及實(shí)驗(yàn)室技術(shù)水平，還可發(fā)現(xiàn)新的地貧基因突變類型，從而進(jìn)一步豐富中國(guó)人群地貧基因突變譜。