仇漢林 屈東海 陳東紅 朱玉球 斯金平

(1浙江農(nóng)林大學(xué)/省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家林業(yè)局鐵皮石斛工程技術(shù)研究中心,浙江臨安 311300;2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

鐵皮石斛(Dendrobium catenatum)為多年生附生蘭科植物,是一味歷代皇室貴族、醫(yī)家及醫(yī)學(xué)典籍所推崇的傳統(tǒng)名貴中藥,位列“中華九大仙草之首”。現(xiàn)代藥理研究進(jìn)一步證明鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等獨(dú)特功效[1]。近二十年來,在組培快繁和栽培模式等關(guān)鍵技術(shù)突破和大力推廣下,鐵皮石斛已走向平民化,成為大宗藥材,相關(guān)行業(yè)產(chǎn)值達(dá)百億[2],但同時(shí)也遭遇了新的發(fā)展瓶頸。培育鐵皮石斛優(yōu)良品種是在根本上克服該瓶頸的關(guān)鍵,目前育種的方向主要集中在高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等方面,以及多個(gè)優(yōu)良性狀的聚合。

多梳類(polycomb group,PcG)蛋白最先發(fā)現(xiàn)于果蠅中,可以通過表觀沉默同源異型基因來調(diào)控體節(jié)發(fā)育[3]。PcG 蛋白在動(dòng)植物進(jìn)化中保守存在,主要構(gòu)成PRC1(polycomb repressive complex 1)和PRC2 兩類復(fù)合體[4-7]。果蠅PRC2 核心成員主要由Enhancer of zeste[E(z)]、Extra sex combs(ESC)、Suppressor of zeste[Su(z)12]和p55 四個(gè)亞基構(gòu)成;對(duì)應(yīng)的,擬南芥中有三個(gè)E(z)同源基因CURLY LEAF(CLF)、SWINGER(SWN)、MEDEA(MEA),三個(gè)Su(z) 12 成 員FERTILISATION INDEPENDENT SEED2 (FIS2)、EMBRYONIC FLOWER2(EMF2)、VERNALIZATION2(VRN2),一個(gè)ESC成 員FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM(FIE)和一個(gè)p55 成員MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1(MSI1)。它們可以搭配形成不同的PRC2復(fù)合體在植物發(fā)育的不同時(shí)相行使特定的功能,如EMF復(fù)合體(CLF/SWN-EMF2-FIE-MSI1)可以抑制營養(yǎng)到生殖發(fā)育的提前轉(zhuǎn)變,并參與維持細(xì)胞處于分化狀態(tài);VRN復(fù)合體(CLF/SWNVRN2-FIE-MSI1)參與春化后FLC的表觀沉默并促使開花;FIS復(fù)合體(MEA-SWN-FIS2-FIE-MSI1)對(duì)種子正常發(fā)育是必需的,可以阻止種子在未受精狀態(tài)下發(fā)育[8-11]。其中,PRC2的催化亞基CLF、SWN、MEA 屬于SET 結(jié)構(gòu)域蛋白(SET domain group)[12],負(fù)責(zé)催化組蛋白抑制標(biāo)記H3K27me3 在靶基因座位的沉積并介導(dǎo)基因沉默[13]。且H3K27me3 抑制標(biāo)記與脫水應(yīng)激記憶、冷脅迫應(yīng)答以及病原菌抗性等現(xiàn)象密切相關(guān)[14-15]。為了調(diào)查PRC2復(fù)合體在鐵皮石斛發(fā)育和脅迫應(yīng)答中的功能,本研究鑒定了鐵皮石斛PRC2的核心成員,系統(tǒng)分析了它們之間的互作保守性、組織器官表達(dá)譜以及對(duì)外界環(huán)境脅迫和病害脅迫的響應(yīng)情況,有助于進(jìn)一步研究鐵皮石斛的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)機(jī)制,并為應(yīng)用于分子輔助育種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試鐵皮石斛(Dendrobium catenatum)材料保存于浙江農(nóng)林大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥用植物遺傳育種團(tuán)隊(duì)組培室,培養(yǎng)溫度為25℃,光照時(shí)間為16 h·d-1。對(duì)于組織表達(dá)分析,根、莖、葉部位取自8月齡幼苗,花蕾和成花取自處于花期的2年生成株。對(duì)于脅迫處理,選取發(fā)育良好且生長(zhǎng)一致的8月齡幼苗進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 鐵皮石斛PRC2 核心成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用果蠅和擬南芥PRC2 核心成員通過BLAST 工具搜索鐵皮石斛基因組,獲得鐵皮石斛PRC2 同源基因。將鐵皮石斛PRC2 核心成員的氨基酸序列和擬南芥、水稻、果蠅的PRC2 成員一起采用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[16]。參數(shù)設(shè)置:使用Neighbor-Joining的No.of differences 模型構(gòu)建,選擇部分刪除(partial deletion)空位(gap)的選項(xiàng),Bootstrap method 取值1 000。

1.3 鐵皮石斛總RNA的提取及cDNA 第一鏈的合成

利用改良CTAB提取鐵皮石斛總RNA[17],用840 - 210800 紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國)檢驗(yàn)提取的總RNA 純度和濃度,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,北京)對(duì)鐵皮石斛總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 鐵皮石斛PRC2 成員的基因克隆

采用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)鐵皮石斛DcCLF、DcSWN、DcFIE、DcMSI1、DcEMF2的熒光定量PCR 引物和全長(zhǎng)序列引物以及多梳蛋白DcLHP1的全長(zhǎng)引物(表1)。以上述cDNA 第一鏈為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)體系(25 μL)包括10×Buffer 2.5 μL、2 mmol·L-1dNTPs 2.5 μL、25 mmol·L-1MgSO41 μL、KOD+0.5 μL、ddH2O 16 μL、10 μmol·L-1Primer-F 0.75 μL、10 μmol·L-1Primer-R 0.75 μL及cDNA 1 μL (日 本TOYOBO)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,利用DNA 凝膠回收試劑盒(TaKaRa,北京)回收目的片段,連接到pEASY-Blunt 克隆載體(TransGen Biotech)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定后的單克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 酵母雙雜載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

構(gòu)建基因克隆載體(pEASY-DcCLF、-DcSWN、-DcFIE、-DcMSI1、-DcEMF2及-DcLHP1),根據(jù)預(yù)先設(shè)定在基因兩端的酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切,定向克隆到同樣雙酶切的酵母雙雜空載體pGADT7x和pGBKT7x。經(jīng)常規(guī)的酶切-連接法,構(gòu)建含有鐵皮石斛PRC2 成員的酵母雙雜載體。將分別裝入pGADT7x和pGBKT7x的PRC2基因酵母雙雜載體進(jìn)行兩兩組合,根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法共轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中,最后涂布于SD-LT 二缺平板上,30℃倒置培養(yǎng)2～3 d。將在二缺平板上生長(zhǎng)出來的酵母單克隆轉(zhuǎn)移到SD-LTHA 四缺平板上,同時(shí)轉(zhuǎn)移一份到二缺平板上作為對(duì)照,30℃培養(yǎng)3～4 d 觀察酵母互作情況。

1.6 脅迫處理

選取生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的鐵皮石斛幼苗進(jìn)行以下處理,取處理的幼苗葉片提取RNA。非生物脅迫處理[19]:1)低溫處理:將幼苗置于低溫培養(yǎng)箱中4℃處理0、2、6、12 h;2)高溫處理:將鐵皮幼苗置于恒溫培養(yǎng)箱40℃(其他條件與組培室條件保持一致),分別培養(yǎng)0、2、6、12 h;3)脫水處理:將幼苗置于恒溫培養(yǎng)箱25℃(其他條件與組培室條件一致),分別培養(yǎng)0、2、6、12 h。生物脅迫處理:分別從齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)和灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)平板上打取10個(gè)5 mm 菌餅,接種于200 mL PDA 培養(yǎng)液中,150 r·min-1、28℃培養(yǎng)100 h,分別用齊整小核菌(試驗(yàn)組1)和灰葡萄孢霉菌(試驗(yàn)組2)發(fā)酵液噴施鐵皮石斛幼苗,然后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、2、6、12 h。以噴施無菌水的幼苗為對(duì)照。

表1 本研究所用引物對(duì)序列Table1 Primer pairs used in this study

1.7 半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

提取上述不同處理的鐵皮石斛總RNA,利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,北京)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。根據(jù)熒光定量PCR 引物的設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)熒光定量PCR 特異性定量引物,并以EF1a基因?yàn)閮?nèi)參(表1)。半定量PCR的總反應(yīng)體系(20 μL):2×Taq MasterMix(Dye)10 μL、Primer-F 0.8 μL、Prime-R 0.8 μL、cDNA 1.3 μL,ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。

熒光定量PCR 試驗(yàn)參照SYBR ? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa,北京)試劑盒的說明書,反應(yīng)在CFX96TMReal-Time System 實(shí)時(shí)定量PCR 儀(Bio-Rad,美國) 上完成。總反應(yīng)體系(10 μL):SYBR Premix Ex Taq Ⅱ5 μL、Primer-F 0.4 μL、Primer-R 0.4 μL、cDNA 0.5 μL,ddH2O 補(bǔ)足至10 μL,每個(gè)樣品重復(fù)3 次。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火20 s,72℃延伸20 s,共40個(gè)循環(huán),每次循環(huán)中的第3 步進(jìn)行熒光的采集,最后95℃變性1 min,退火至65℃,保溫5 s后以0.5℃·s-1的速度上升至95℃,在此期間連續(xù)檢測(cè)熒光值并且繪制溶解曲線。利用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖與分析[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛PRC2復(fù)合體核心成員的篩選與鑒定

利用果蠅和擬南芥PRC2 核心成員在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行同源搜索,篩選出鐵皮石斛PRC2 成員(表2)。隨后分別以果蠅PRC2 成員為外類群,用雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻PRC2 成員為參照,通過系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖1),最終確定鐵皮石斛PRC2 核心成員。在E(z)組,鐵皮石斛有DcCLF和DcSWN 2個(gè)成員,分別聚類到CLF和SWN 進(jìn)化支,與水稻中的一致;缺少擬南芥的MEA 支。在Su(z)12組,鐵皮石斛僅有1個(gè)成員DcEMF2,而水稻中有2個(gè)成員,擬南芥中有3個(gè)。在ESC 組,鐵皮石斛和擬南芥一樣,僅有1個(gè)成員,而水稻中有2個(gè)。在p55 組,鐵皮石斛有4個(gè)同源基因,水稻有3個(gè),擬南芥有5個(gè),但關(guān)于擬南芥的研究表明,僅MSI1 確定為PRC2的成員,而鐵皮石斛和水稻僅有1個(gè)成員與MSI1 聚在一起,由此推測(cè)鐵皮石斛和水稻中也僅有一個(gè)p55 成員。因此,鐵皮石斛PRC2復(fù)合體在核心成員構(gòu)成上是基本保守的,但在進(jìn)化過程中可能由于基因的復(fù)制或丟失導(dǎo)致不同亞基成員的數(shù)量存在變動(dòng)。

表2 鐵皮石斛PRC2 核心成員的篩選和分類Table2 Screening and classification of D.catenatum PRC2 core subunits

2.2 鐵皮石斛PRC2 核心成員間的互作分析

基于NCBI 網(wǎng)站存儲(chǔ)的鐵皮石斛基因組序列,設(shè)計(jì)鐵皮石斛PRC2 核心成員及相關(guān)因子DcLHP1的全長(zhǎng)引物(表1),以鐵皮石斛幼苗cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,成功克隆到DcCLF、DcSWN、DcEMF2、DcFIE、DcMSI1及DcLHP1基因,并利用pGADT7x和pGBKT7x 質(zhì)粒構(gòu)建了一批酵母雙雜載體。

為了檢測(cè)PRC2復(fù)合體在鐵皮石斛中的互作保守性,通過酵母雙雜試驗(yàn)來分析鐵皮石斛PRC2 成員之間的互作關(guān)系。將pGBKT7x 空載、pGBKT7x-DcCLF、-DcMSI1 分別與pGADT7x 空載、pGADT7x-DcSWN、-DcMSI1、-DcFIE、-DcEMF2、-DcLHP1 進(jìn)行兩兩組合,共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109。由圖2可知,經(jīng)雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的AH109 酵母細(xì)胞在SD-LT 二缺平板上能生長(zhǎng),說明共轉(zhuǎn)化成功。將這些酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到SD-LTHA四缺選擇培養(yǎng)基上,觀察到pGBKT7x-DcCLF與pGADT7x-DcMSI1,pGBKT7x-DcMSI1與pGADT7x-DcLHP1、-DcFIE、-DcMSI1的組合可以生長(zhǎng),說明它們之間存在互作關(guān)系,這大體上與模式植物擬南芥PRC2的報(bào)道一致,進(jìn)一步支持了PRC2復(fù)合體在進(jìn)化中的保守性。

2.3 鐵皮石斛PRC2 核心成員的組織器官表達(dá)譜

以持家基因DcEF1a為內(nèi)參,利用半定量PCR對(duì)鐵皮石斛PRC2 核心成員在根、莖、葉、花蕾及成花組織中的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析(圖3)。結(jié)果顯示,PRC2 所有亞基的表達(dá)均比較廣泛,但不同的基因或它們?cè)诓煌M織器官中表達(dá)豐度存在差異。其中,DcSWN和DcMSI1 在所有被檢組織中的表達(dá)量均較高且一致;DcCLF相對(duì)而言在莖中表達(dá)最高,其次為根,在葉、花蕾、成花中則低表達(dá);DcEMF2和DcFIE分別在花蕾和成花中高表達(dá),其次為莖,根和葉中表達(dá)最低。因此,鐵皮石斛PRC2 成員的表達(dá)模式基本與在擬南芥和水稻中的一致,在植物不同生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的功能。

圖1 鐵皮石斛PRC2復(fù)合體核心成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of PRC2 core components in D.catenatum

圖2 酵母雙雜測(cè)試鐵皮石斛PRC2 成員之間的互作關(guān)系Fig.2 The interaction relationship between D.catenatum PRC2 members detected by yeast-2-hybrid system

2.4 鐵皮石斛PRC2 核心成員對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

由圖4可知,在4℃低溫處理下,DcMSI1和DcFIE的表達(dá)基本不變;DcEMF2 在處理6 h時(shí)表達(dá)上調(diào),但在處理12 h時(shí)又下調(diào);DcSWN和DcCLF在處理2 h后即受到強(qiáng)烈誘導(dǎo),隨后又下降到正常水平。在高溫脅迫下,DcFIE的表達(dá)幾乎不變;DcMSI1、DcSWN和DcCLF的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),且均在處理6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值,在處理12 h時(shí)表達(dá)量回落至正常水平;DcEMF2的表達(dá)則呈現(xiàn)穩(wěn)步的上調(diào)。在脫水脅迫下,DcMSI1和DcEMF2的表達(dá)基本不受影響;DcFIE和DcSWN基因在處理前期表達(dá)逐步下調(diào),處理12 h時(shí)開始上調(diào);DcCLF基因的表達(dá)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng),處理12 h時(shí)達(dá)到最高。綜上,鐵皮石斛PRC2 不同成員對(duì)特定的環(huán)境脅迫因子具有不同的響應(yīng)方式。

圖3 鐵皮石斛PRC2 核心成員的組織表達(dá)譜Fig.3 Expression profiling of D.catenatum PRC2 core components in different tissues

2.5 鐵皮石斛PRC2 核心成員對(duì)真菌病害的響應(yīng)

為了研究生物脅迫下鐵皮石斛PRC2 成員的響應(yīng)情況,選取引起鐵皮石斛重要病害的齊整小核菌和灰葡萄孢霉菌作為接種測(cè)試材料。由圖5可知,齊整小核菌發(fā)酵液侵染下,DcFIE和DcSWN的表達(dá)受影響不大;DcMSI1 在脅迫12 h時(shí)受到強(qiáng)烈誘導(dǎo),DcEMF2 在脅迫2 h時(shí)即上調(diào),隨后繼續(xù)保持高的表達(dá)水平;DcCLF的表達(dá)在脅迫6 h時(shí)有輕微上調(diào),脅迫12 h時(shí)又出現(xiàn)下調(diào)。灰葡萄孢霉菌發(fā)酵液侵染下,DcEMF2的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,DcMSI1和DcFIE的表達(dá)隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步受到抑制,DcCLF表現(xiàn)輕微的上調(diào),而DcSWN在接種脅迫2 h時(shí)即被強(qiáng)烈誘導(dǎo)且在脅迫6～12 h時(shí)一直維持高表達(dá)。綜上,不同的鐵皮石斛PRC2 成員對(duì)不同病原菌的響應(yīng)方式差異明顯。

圖4 鐵皮石斛PRC2基因?qū)Νh(huán)境脅迫的響應(yīng)Fig.4 Responses of D.catenatum PRC2 genes against environmental stresses

圖5 鐵皮石斛PRC2基因?qū)Σ『γ{迫的響應(yīng)Fig.5 Responses of D.catenatum PRC2 genes against pathogen stresses

3 討論

名貴蘭科中藥材鐵皮石斛作為典型的附生植物,生存條件嚴(yán)苛,且在發(fā)育程序上存在諸多獨(dú)特之處,如粗狀肥厚的氣生根、多汁的肉質(zhì)葉、富含多糖等儲(chǔ)藏物質(zhì)的假鱗莖、高度特化的花器官、種子微小,無胚乳,且胚發(fā)育不全等[2,21]。而在普通模式植物擬南芥中的研究表明,PRC2 多梳復(fù)合體成員除了參與對(duì)多種逆境脅迫的響應(yīng)外,還調(diào)控植物組織器官(根、葉、花、胚和胚乳等)的形態(tài)建成[8-15],因此對(duì)鐵皮石斛PRC2復(fù)合體的研究有助于揭示其在物種形成中展現(xiàn)的特殊性。在本研究中,系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,鐵皮石斛PRC2復(fù)合體成員與同屬單子葉的水稻成員在進(jìn)化關(guān)系上比較近:在E(z)組均缺少M(fèi)EA 進(jìn)化支,在Su(z)12 組均缺乏FIS2和VRN2 進(jìn)化支;但不同的是,鐵皮石斛在Su(z)12 組的EMF2 分支和ESC 組僅有1個(gè)成員,而水稻中均為2個(gè)。酵母雙雜交試驗(yàn)表明,DcMSI1與其自身及DcLHP1、DcFIE、DcCLF 相互作用,這基本與擬南芥中的結(jié)果一致[22-23]。但擬南芥MSI1 也可與EMF2[22],CLF與EMF2[24]和FIE[25]存在互作;這可能是因?yàn)殍F皮石斛獨(dú)特的器官發(fā)育程序需要特定的PRC2 成員組合。半定量PCR 結(jié)果表明,鐵皮石斛PRC2 核心成員在其根、莖、葉、花蕾和成花中均有不同程度的表達(dá),總體上與擬南芥和水稻中的同源基因表達(dá)情況一致。然而,擬南芥MEA和水稻OsFIE1是胚乳印記基因,特異在種子中表達(dá);MEA功能缺失導(dǎo)致中央細(xì)胞在未受精狀態(tài)下發(fā)育成胚乳,并形成無胚種子[26];OsFIE1 功能缺陷導(dǎo)致種子小且結(jié)實(shí)率低,胚發(fā)育推遲,糊粉層細(xì)胞變小[27]。而鐵皮石斛種子退化,失去胚乳發(fā)育,需與真菌共生萌發(fā),推測(cè)這與鐵皮石斛在進(jìn)化中丟失了種子特異PRC2 成員有關(guān)。

鐵皮石斛作為附生植物,在野外和仿野生栽培條件下全株近乎完全暴露在空氣中,因此鐵皮石斛更易遭到不同程度的環(huán)境因子脅迫[2]。本研究結(jié)果表明,低溫和高溫威脅下,DcCLF、DcSWN、DcEMF2、DcMSI1的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);脫水脅迫下,DcFIE、DcSWN的表達(dá)則呈先降低后升高的趨勢(shì),DcCLF持續(xù)上調(diào)?？傮w上,鐵皮石斛PRC2 成員普遍參與對(duì)環(huán)境脅迫的短時(shí)響應(yīng),有利于協(xié)調(diào)發(fā)育程序和脅迫應(yīng)答之間的平衡。Liu 等[28]研究發(fā)現(xiàn),擬南芥PRC2 核心成員CLF和SWN 介導(dǎo)的組蛋白H3K27me3與脫落酸(abscisic acid,ABA)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子可以共同調(diào)控ABA 誘導(dǎo)衰老基因的表達(dá),從而使植物響應(yīng)干旱等環(huán)境脅迫,提高植物生長(zhǎng)過程中的抗逆性。Alexandre 等[29]研究發(fā)現(xiàn),擬南芥中PRC2 成員MSI1也參與響應(yīng)干旱脅迫反應(yīng)。此外,當(dāng)擬南芥暴露于低溫環(huán)境時(shí),冷應(yīng)激基因COR15A和ATGOLS3 座位的H3K27me3的水平顯著降低[30]。設(shè)施栽培的鐵皮石斛生長(zhǎng)條件良好,但高溫高濕高肥易滋生病原菌,導(dǎo)致病害的大面積爆發(fā)[31]。本研究利用兩種常見的鐵皮石斛病原齊整小核菌和灰葡萄孢霉菌[32-34]進(jìn)行接種測(cè)試,發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛PRC2基因在響應(yīng)兩種病害脅迫下的表達(dá)差異明顯,齊整小核菌侵染導(dǎo)致DcSWN表達(dá)先升高后降低,DcEMF2和DcMSI1表達(dá)上調(diào);灰葡萄孢霉菌侵染誘導(dǎo)DcCLF和DcSWN的表達(dá),但是抑制DcMSI1和DcFIE的表達(dá)。PRC2 成員對(duì)齊整小核菌和灰葡萄孢霉菌不同的響應(yīng)方式,表明PRC2基因在不同病害脅迫下發(fā)揮重要的功能。Berr 等[35]研究發(fā)現(xiàn)與CLF/SWN 同為SDG家族成員的SDG8 通過調(diào)節(jié)茉莉酸(jasmonic acid,JA)和/或乙烯信號(hào)通路中的一組基因,在植物防御真菌病原體中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？傊?鐵皮石斛PRC2 成員對(duì)不同的環(huán)境和病害脅迫具有差異的響應(yīng)方式,便于更加精準(zhǔn)調(diào)控相關(guān)基因在特定條件下的開閉。

本研究中鐵皮石斛PRC2基因在響應(yīng)非生物脅迫和生物脅迫發(fā)揮重要的生物學(xué)功能,但其具體的響應(yīng)機(jī)制還需進(jìn)一步挖掘。因此,需要建立有效的鐵皮石斛轉(zhuǎn)化體系或借助異源轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)鐵皮石斛PRC2基因功能進(jìn)行深入驗(yàn)證,確定PRC2 缺失或過表達(dá)對(duì)非生物和生物脅迫的響應(yīng)情況和耐受性,為后續(xù)鐵皮石斛抗逆的遺傳育種提供關(guān)鍵佐證。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,鐵皮石斛PRC2復(fù)合體核心亞基包括DcCLF、DcSWN、DcEMF2、DcMSI1和DcFIE,進(jìn)化上與水稻PRC2 同源性較高;核心組分DcCLF與DcMSI1、DcMSI1與DcFIE、DcMSI1與DcLHP1、DcMSI1與DcMSI1之間存在互作關(guān)系,表明了PRC2復(fù)合體在進(jìn)化上的保守性;PRC2 成員在鐵皮石斛不同組織中均有表達(dá),且廣泛參與對(duì)非生物脅迫(低溫、高溫和脫水)和生物脅迫(齊整小核菌、灰葡萄孢霉菌)的響應(yīng)過程,表明它們?cè)谥参锲鞴侔l(fā)育和環(huán)境適應(yīng)方面的功能具有普遍性。本研究結(jié)果為鐵皮石斛PRC2 核心復(fù)合體成員在生長(zhǎng)發(fā)育過程和脅迫應(yīng)答機(jī)制提供了理論依據(jù),并為分子育種提供了重要候選靶基因。