雙亞洲, 王 惠, 張?zhí)熨n, 李來生

(南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 江西 南昌 330031)

隨著手性化合物在藥品和生命科學(xué)中的廣泛應(yīng)用,由立體異構(gòu)導(dǎo)致的對映體在活性、毒性、代謝和殘留方面的手性問題日益突出[1-3],手性拆分早已引起人們的普遍關(guān)注。開發(fā)新型的高選擇性手性分離材料[4-6],并建立快速高效的對映體分離分析方法,對保障藥品、食品和環(huán)境安全具有重要的研究意義。

環(huán)糊精(cyclodextrins, CD)作為第二代超分子化合物,具有內(nèi)疏水外親水的獨(dú)特性質(zhì),能與許多化合物形成包合物,具有很強(qiáng)的手性識(shí)別能力,已被廣泛地用作高效液相色譜固定相和毛細(xì)管電泳添加劑[7-9]。通過環(huán)糊精端口的衍生化,可引入多種作用位點(diǎn),從而進(jìn)一步提升了該類固定相的手性分離能力[10-12]。但常用的全衍生化易造成端口擁堵,加之β-環(huán)糊精腔體較小(約0.65 nm),也使得其手性識(shí)別范圍受到一定的限制[13]。制備橋聯(lián)環(huán)糊精是提高手性選擇性的新途徑,有望彌補(bǔ)上述不足。

橋聯(lián)環(huán)糊精(bridged cyclodextrins, BCD)是兩個(gè)或以上環(huán)糊精單元經(jīng)功能橋基連接形成的一個(gè)有機(jī)整體。已在人工模擬酶、藥物載體、分子識(shí)別、不對稱催化、傳感材料、生物智能器件和環(huán)境污染物處理等眾多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[14,15]。研究證實(shí),橋聯(lián)環(huán)糊精可顯著增強(qiáng)天然環(huán)糊精的分子結(jié)合能力和選擇性,表現(xiàn)出比單個(gè)天然環(huán)糊精更好的分子選擇性結(jié)合能力,通常單個(gè)環(huán)糊精與底物的包結(jié)常數(shù)(Ks)一般小于105L/mol,而橋聯(lián)環(huán)糊精與底物的包結(jié)常數(shù)可與生物酶相當(dāng),達(dá)Ks>1011L/mol[16]。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)橋聯(lián)基團(tuán)還可以充當(dāng)“假空腔”提供額外的相互作用,與多個(gè)環(huán)糊精腔體協(xié)同包合客體分子,從而進(jìn)一步增強(qiáng)其空間識(shí)別能力,這在很大程度上彌補(bǔ)了單個(gè)環(huán)糊精腔體小的局限性。盡管橋聯(lián)環(huán)糊精已經(jīng)在許多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,但其“協(xié)同作用”在手性分離中并未被有效利用。Chang等[18]和袁黎明等[19]分別報(bào)道了兩種橋聯(lián)環(huán)糊精鍵合相,發(fā)現(xiàn)其對一些芳香族化合物的位置異構(gòu)體和氨基酸衍生物表現(xiàn)出比單環(huán)糊精固定相更好的選擇性。本實(shí)驗(yàn)室的周仁丹等[20]也制備了一種乙二胺橋聯(lián)環(huán)糊精固定相,并成功地快速拆分了14種β-受體阻滯劑。綜上所述,新穎的橋聯(lián)環(huán)糊精的合成、純化及其手性固定相的開發(fā)有待更深入系統(tǒng)地研究。

本研究利用活潑的雙功能試劑六亞甲基二異氰酸酯與含胺基環(huán)糊精間的加成反應(yīng),在室溫下設(shè)計(jì)合成了一種二脲基橋聯(lián)環(huán)糊精,將合成的橋聯(lián)β-環(huán)糊精鍵合到硅膠基質(zhì)上制備出一種新型的二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精固定相(UBCDP)。通過質(zhì)譜、紅外光譜、元素分析和熱重等手段對合成的橋聯(lián)環(huán)糊精和新固定相進(jìn)行表征。以三唑類農(nóng)藥、黃烷酮類、丹磺酰氨基酸類藥物為手性探針,進(jìn)行了色譜性能的評(píng)價(jià),并探究了流動(dòng)相組成、pH以及溫度對手性分離的影響,通過與單β-環(huán)糊精固定相(CDCSP)比對,探討了UBCDP的分離機(jī)理。實(shí)驗(yàn)表明,CDCSP的對映體選擇性明顯優(yōu)于UBCDP。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ZQ4000/2695液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司); 5700型傅里葉紅外光譜儀(美國Nicolet公司); Vorio EL Ⅲ型元素分析儀(德國Elementar公司); Diamond TG/DTA型同步熱分析儀(美國Perkin Elmer公司); AW-60色譜裝柱機(jī)(美國Haskel公司); Milli-Q超純水(美國Millipore公司); BSA-224S型電子天平(精度0.000 1 g,德國Sartorious公司); TGL-16C高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠); KQ-100E型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司); DF-2集熱式磁力攪拌器(金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠); ZKF-030型電熱真空干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠)。

三嵌段聚合物P123(PEO20、PPO70、PEO20,相對分子質(zhì)量約5 800)、六亞甲基二異氰酸酯(HDMI,純度≥98.0%)、異氰酸丙基三乙氧基硅烷(IPTS,純度≥98.0%)和外消旋標(biāo)準(zhǔn)品(黃烷酮類、氨基酸類,純度均≥98.5%)購于美國Sigma公司;三唑類外消旋標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%)購于上海農(nóng)藥研究院;1,3,5-三甲苯(TMB,分析純)購于阿拉丁試劑公司;甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)為HPLC級(jí),購于美國Tedia公司;正硅酸乙酯(TEOS)、β-環(huán)糊精、對甲苯磺酰氯、冰醋酸(HAc)、三乙胺(TEA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等其他均為分析純,購于國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司,其中DMF經(jīng)CaH2除水后密封備用。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率>18.2 MΩ·cm)。

1.2 UBCDP的制備

UBCDP的制備路線見圖1。先采用二異氰酸酯合成橋聯(lián)β-環(huán)糊精(見圖1中的D),然后以異氰酸丙基硅氧烷為偶聯(lián)劑,將橋聯(lián)β-環(huán)糊精固載到有序硅膠SBA-15表面,制得UBCDP。

圖1 UBCDP的合成路線

1.2.1SBA-15的制備

參考Zhao等[21]的合成方法,合成了有序介孔硅膠SBA-15,用作色譜鍵合基質(zhì)。制備過程為:取5.6 g P123(模板)和12 g TEOS(硅源),溶于250 mL 2.0 mol/L HCl中,加入6.0 g TMB(擴(kuò)孔劑),用適量的KCl調(diào)控其形貌,于38 ℃攪拌24 h,轉(zhuǎn)入水熱自壓反應(yīng)釜中,在110 ℃條件下水熱反應(yīng)靜置晶化48 h,收集白色沉淀,烘干后在550 ℃高溫下煅燒10 h除去模板,制得有序介孔硅膠SBA-15。其粒徑大小約為3.2 μm,孔徑大小約為24 nm,比表面積約為400 m2/g。后經(jīng)稀鹽酸浸泡過夜,以增加硅醇羥基數(shù),并在160 ℃下除水來活化SBA-15表面的羥基,保存于干燥器中備用。

1.2.2二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[20]合成單-6-去氧-(對-甲苯磺酰基)-β-環(huán)糊精(TsO-CD,見圖1中的B)和單-6-去氧-6-羥基乙醇胺-β-環(huán)糊精(見圖1中的C)。將60 g (52.9 mmol)β-環(huán)糊精(見圖1中的A)加入300 mL蒸餾水中。邊攪拌邊滴加20 mL (8.25 mol/L) NaOH溶液至環(huán)糊精溶解。在0～5 ℃緩慢加入20.16 g (0.105 mol)對甲苯磺酰氯的乙腈(60 mL)溶液,在室溫下攪拌反應(yīng)5 h。濾除未反應(yīng)的對甲苯磺酰氯,用鹽酸調(diào)pH值至中性。于0 ℃冷藏過夜,過濾得粗品。用少量熱水重結(jié)晶3次,干燥后得9.2 g TsO-CD,產(chǎn)率為13.5%。

將6.0 g (4.7 mmol)制備的TsO-CD(見圖1中的B)加入50 mL乙醇胺中,于70 ℃反應(yīng)3～4 h,冷卻后倒入300 mL丙酮中,析出白色沉淀,將其溶于少量熱水重結(jié)晶3次,于80 ℃真空干燥24 h,得4.32 g單-6-去氧-6-羥乙基胺-β-環(huán)糊精白色晶體,產(chǎn)率為78.6%。單-6-去氧-6-羥乙基胺-β-環(huán)糊精的質(zhì)譜參數(shù)為:[M+H]+m/z=1 179.01(理論值為1 179.06)。

將上述合成的乙醇胺-β-環(huán)糊精(見圖1中的C)溶于25 mL無水DMF中,然后加入0.31 g (1.84 mmol)六亞甲基二異氰酸酯,室溫下反應(yīng)24 h,反應(yīng)結(jié)束后加入200 mL丙酮,析出白色沉淀,將過濾所得固體溶于少量熱水,經(jīng)C-25柱層析純化。在65 ℃下真空干燥,得到1.52 g二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精(見圖1中的D),產(chǎn)率為32.9%。二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精的質(zhì)譜參數(shù)為:[M+H]+m/z=2 522.91(理論值為2 522.93)。

1.2.3UBCDP的制備

將上述合成的橋聯(lián)β-環(huán)糊精在攪拌下溶于20 mL無水DMF中,慢慢滴加0.4 mL異氰酸丙基三乙氧基硅烷,滴加完后升溫至80 ℃,反應(yīng)2 h。然后加入4.5 g SBA-15,并補(bǔ)加適量無水DMF,于110 ℃反應(yīng)24 h。過濾得粗品,用DMF、丙酮、甲醇、水反復(fù)洗滌,隨后用丙酮索氏提取16 h清洗孔道,真空干燥后得到UBCDP。

稱取1.0 g干燥的β-環(huán)糊精,溶于40 mL無水DMF中,加0.3 mL異氰酸丙基三乙氧基硅烷和3.0 g活化的SBA-15,其余的制備方法與UBCDP類似,得到單環(huán)糊精固定相CDCSP,用于對比研究。

1.3 色譜方法

1.3.1溶液配制

外消旋手性標(biāo)準(zhǔn)品的配制:將外消旋手性標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為100～200 mg/L的儲(chǔ)備溶液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后放在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?使用前用甲醇或流動(dòng)相稀釋至適當(dāng)濃度,并超聲脫氣處理。

流動(dòng)相由水相和有機(jī)相組成。水相為水、1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸或1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸三乙胺(TEAA),其中1%(體積分?jǐn)?shù))TEAA是通過1%(體積分?jǐn)?shù))TEA水溶液用乙酸調(diào)節(jié)所需pH值制得。有機(jī)相為甲醇和乙腈。水相與有機(jī)相按一定比例混合,使用前用G4砂芯漏斗過濾,并超聲脫氣處理10 min。

1.3.2色譜柱的填裝及柱效測定

采用勻漿填充法填裝色譜柱。將上述自制的固定相超聲分散在適量的丙酮中,轉(zhuǎn)入勻漿罐。然后以甲醇作頂替劑,恒壓(34.5 MPa)下將固定相勻填至一根不銹鋼色譜柱(250 mm×4.6 mm)中,最后緩慢卸壓。以萘為溶質(zhì),以甲醇-水(40∶60, v/v)為流動(dòng)相,流速為0.8 mL/min,檢測波長為254 nm,測得柱效為31 406plates/m。根據(jù)進(jìn)樣后的溶劑峰確定死時(shí)間(t0)為4.25 min。

1.3.3流動(dòng)相組成與檢測

流動(dòng)相組成:水溶液、乙腈和甲醇,根據(jù)具體手性溶質(zhì)的拆分需要按體積分?jǐn)?shù)調(diào)整。根據(jù)被分析物和流動(dòng)相的光譜性質(zhì),設(shè)定相應(yīng)檢測波長:黃烷酮類一般選擇280 nm;丹磺酰氨基酸一般選擇254 nm;三唑類農(nóng)藥一般選擇220 nm(滅菌唑260 nm)。柱溫為25 ℃,流速為0.8 mL/min,進(jìn)樣量根據(jù)溶質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)調(diào)整為3～10 μL。

1.3.4色譜性能評(píng)價(jià)參數(shù)

采用下列3個(gè)參數(shù)評(píng)價(jià)色譜性能:

保留因子:k=(tR-t0)/t0,t0為死時(shí)間(單位min),tR為溶質(zhì)的保留時(shí)間(單位min)。

選擇性因子:α=k2/k1,k1和k2分別為前后被洗出對映體的保留因子。

分離度:Rs=1.18(tR2-tR1)/(Wh1+Wh2),tR1和tR2分別為前后兩對映體的保留時(shí)間(單位min),Wh1和Wh2分別為前后兩對對映體的半峰寬。

2 結(jié)果與討論

2.1 橋聯(lián)β-環(huán)糊精的合成

通常采用雙功能試劑與環(huán)糊精端口的羥基反應(yīng)合成橋聯(lián)β-環(huán)糊精,由于環(huán)糊精端口羥基較多,反應(yīng)過程中易發(fā)生交聯(lián)和聚合。因此一般要先對環(huán)糊精端口的羥基進(jìn)行選擇性的活化(如制備氨基衍生化環(huán)糊精),然后與活潑性雙功能試劑(主要包括二異氰酸酯、二酰氯、二羧酸和二酸酐等)反應(yīng),這樣能保證每個(gè)端基與單個(gè)環(huán)糊精反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)利用六亞甲基二異氰酸酯與含胺基環(huán)糊精間的加成反應(yīng),在室溫下設(shè)計(jì)合成了一種二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精。首先向環(huán)糊精端口引入羥乙基胺基活性位點(diǎn),然后利用衍生基團(tuán)與活潑的六亞甲基二異氰酸酯加成形成穩(wěn)定的脲鍵,脲鍵既是氫鍵給體,又是氫鍵受體,提供手性拆分所需的作用位點(diǎn),加之己基鏈柔性較強(qiáng),有利于配合兩個(gè)環(huán)糊精腔體間的協(xié)同包結(jié)作用。這條合成路線具有步驟簡單、條件溫和、產(chǎn)率較高等特點(diǎn)。

另外,本文選取比表面較大、孔道有序的SBA-15作為橋聯(lián)環(huán)糊精的載體,有利于提高鍵合量,有序的孔結(jié)構(gòu)也可加快溶質(zhì)傳質(zhì)。由于其整體結(jié)構(gòu)規(guī)整,可有效地減少多路徑,從而能降低渦流擴(kuò)散,實(shí)現(xiàn)快速手性分析。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

2.2.1橋聯(lián)β-環(huán)糊精的表征

將合成的橋聯(lián)β-環(huán)糊精通過質(zhì)譜和紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,結(jié)果分別見圖2和圖3。圖2中m/z2 522.93為橋聯(lián)β-環(huán)糊精的[M+H]+峰,與理論值(m/z2 522.91)相符,m/z1 262.70為雙電荷離子峰,即[M+2H]2+/2峰,與理論值(m/z1 261.97)相近。結(jié)合質(zhì)譜分析,證明本試驗(yàn)成功地合成了二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精。

圖2 二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精的質(zhì)譜圖

圖3 二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精及UBCDP紅外光譜圖

2.2.2橋聯(lián)β-環(huán)糊精固定相的表征

圖3中上下分別為二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精和UBCDP的紅外光譜圖。圖中3 391.15 cm-1處是O-H伸縮振動(dòng),2 941.66 cm-1處是橋基和環(huán)糊精上C-H伸縮振動(dòng),1 658.57cm-1處是脲基的C=O鍵伸縮振動(dòng),1 552.33 cm-1處是N-H鍵彎曲振動(dòng),1 098.75 cm-1附近的寬峰是環(huán)糊精上的C-O鍵和SBA-15的Si-O-Si鍵的重疊吸收峰。紅外光譜分析表明合成的二脲基橋聯(lián)β-環(huán)糊精被成功地鍵合到SBA-15硅膠上。

UBCDP的元素分析結(jié)果為:C為2.73%, H為0.27%, N為0.51%,以碳含量計(jì)算其鍵合量約為0.06 μmol/m2。

表1 二取代苯位置異構(gòu)體分離結(jié)果

k1: the retention factor of the first peak;k2: the retention factor of the second peak;k3: the retention factor of the third peak;Rs1: the resolution of the first pair;Rs2: the resolution of the second pair; CSP: chiral stationary phase;m: meta;o: ortho;p: para; CDCSP:β-cyclodextrin-bonded chiral stationary phase; /: no separation.

CDCSP的元素分析結(jié)果為:C為3.82%, H為0.48%, N為0.13%,以碳含量計(jì)算其鍵合量約為0.18 μmol/m2。

熱重分析:升溫速度為10 ℃/min;記錄溫度為25～900 ℃。根據(jù)失重率(10%)計(jì)算得UBCDP的鍵合量約為0.10 μmol/m2,與按元素分析結(jié)果計(jì)算相近。

除光譜和元素分析結(jié)果外,該固定相具有良好的手性分離功能,也能進(jìn)一步確證橋聯(lián)β-環(huán)糊精被成功地鍵合到了硅膠上。

圖4 UBCDP拆分二取代苯位置異構(gòu)體色譜圖

2.3 色譜性能評(píng)價(jià)

2.3.1二取代苯位置異構(gòu)體的分離

采用甲醇-水(10/90, v/v)作流動(dòng)相,利用自制的UBCDP對3種二取代苯位置異構(gòu)體進(jìn)行分離,并與CDCSP進(jìn)行了對照研究,結(jié)果見表1和圖4。可以看出,對硝基苯胺在最后出峰(m,o,p),這是由于線形的硝基苯胺更易進(jìn)入環(huán)糊精腔體,包埋更深。而苯二胺和苯二酸的極性很強(qiáng),鄰位異構(gòu)體易形成分子內(nèi)氫鍵,大大降低其極性,與環(huán)糊精疏水性的腔體更加匹配,所以最后被洗脫。表明環(huán)糊精分離位置異構(gòu)體的過程中,包結(jié)作用有重要貢獻(xiàn)。

3種鄰、間、對異構(gòu)體的混合物在UBCDP上的保留時(shí)間明顯更長,選擇性和分離度都比CDCSP好。例如:UBCDP對中性、堿性(苯二胺)和酸性(苯二甲酸)異構(gòu)體均有較強(qiáng)的分離能力,其中苯二甲酸的Rs高達(dá)23.68,苯二胺的Rs為3.68,而CDCSP卻不能分離苯二胺位置異構(gòu)體?？赡苁且?yàn)閮蓚€(gè)固定相對苯二胺的包結(jié)方式有所不同,橋聯(lián)環(huán)糊精是通過兩個(gè)腔體協(xié)同包結(jié)溶質(zhì),而單環(huán)糊精只靠一個(gè)腔體包結(jié),這樣橋聯(lián)環(huán)糊精對m,p,o-苯二胺的識(shí)別作用更有效,故分離選擇性好。

2.3.2黃烷酮在UBCDP上的分離

為評(píng)價(jià)橋聯(lián)β-環(huán)糊精的手性色譜性能,本文采用不同結(jié)構(gòu)類型的手性藥物或農(nóng)藥作探針,包括酸性、堿性和兩性的手性化合物,既可用于固定相色譜性能的評(píng)價(jià),同時(shí)又為今后建立藥物對映體的測定方法提供了理論依據(jù)。另外,通過相同探針在UBCDP和CDCSP上色譜行為的異同,探討了UBCDP的色譜性能、特點(diǎn)及其分離機(jī)理。

圖5 8種手性黃烷酮類化合物結(jié)構(gòu)

黃烷酮(flavanones)及其衍生物大量存在于天然產(chǎn)物中,具有殺菌、抗炎、抗腫瘤等諸多藥用價(jià)值,同時(shí)由于黃烷酮有眾多可被取代位點(diǎn),具備較大的結(jié)構(gòu)修飾潛力,即作為手性藥物合成的中間體。中草藥的有效成分大多是含有天然的手性結(jié)構(gòu),因此進(jìn)行手性分析有利于更深入地評(píng)價(jià)和制定藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本文選取黃酮、2′-羥基黃烷酮、4′-羥基黃烷酮、6-羥基黃烷酮、6-甲氧基黃烷酮、柚皮甙、橙皮甙和兒茶素這8種黃烷酮類手性化合物(結(jié)構(gòu)見圖5),在反相色譜模式下進(jìn)行手性拆分研究。通過與CDCSP的分離結(jié)果比對,探討相關(guān)的拆分機(jī)理,試驗(yàn)結(jié)果和譜圖分別見表2和圖6。

鑒于該類化合物有酸性酚羥基,在反相色譜中拆分時(shí)使用含1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的流動(dòng)相抑制其電離。從表2可看出,UBCDP對8種黃烷酮均有拆分能力,對映體Rs為1.06～4.35。其中2′-羥基黃烷酮和4′-羥基黃烷酮在30 min內(nèi)Rs可達(dá)4.35和3.47。可是,CDCSP只能拆分其中的3種,且Rs(1.12～1.67)較低。盡管CDCSP的鍵合量(0.18 μmol/m2)比UBCDP(0.06 μmol/m2)高,但手性分離能力卻較差。兩種環(huán)糊精的端口均沒有被衍生化,所以分離性能的差別應(yīng)該與不同的包結(jié)方式有關(guān)。UBCDP通過兩個(gè)腔體和柔性的橋基構(gòu)成夾子形狀[17],客體與橋聯(lián)環(huán)糊精作用時(shí)并非進(jìn)入某個(gè)腔體,而是整個(gè)客體被兩個(gè)腔體和橋基協(xié)同包結(jié),有利于對客體分子整體更精細(xì)的識(shí)別,包括R-和S-對映體空間結(jié)構(gòu)上的差異[13]。單個(gè)β-環(huán)糊精腔體很小(約0.65 nm),至多能包萘環(huán),而橋聯(lián)環(huán)糊精不局限于腔體的大小,可與更大體積的客體形成協(xié)同包結(jié)配合物[14,15]。

由表2和圖6可知,UBCDP可以拆分黃烷酮母體(Rs=1.47), 2′-羥基黃烷酮(Rs=4.35)和4′-羥基黃烷酮(Rs=3.47)。明顯地,苯環(huán)上接有羥基有利于拆分,可能是黃烷酮與UBCDP形成包結(jié)物時(shí),苯環(huán)上的羥基能與環(huán)糊精端口羥基、脲基存在氫鍵作用,從而產(chǎn)生良好的分離。從表2數(shù)據(jù)還可知,當(dāng)黃烷酮上羥基或甲氧基的位置轉(zhuǎn)移到苯并吡喃環(huán)上時(shí),UBCDP對它們的分離度有所下降。例如6-羥基黃烷酮(Rs=1.14)、6-甲氧基黃烷酮(Rs=1.06)的Rs小于黃烷酮母體(Rs=1.47)和2′-羥基黃烷酮(Rs=4.35)。此時(shí),CDCSP對它們沒有分離能力。說明苯并吡喃環(huán)接有取代基(6-羥基或6-甲氧基)后體積變大,進(jìn)入腔體較淺,單環(huán)糊精僅依賴單一腔體的包結(jié)難以有效識(shí)別它們的對映體。而橋聯(lián)環(huán)糊精卻有明顯的優(yōu)勢,仍有一定的手性分離能力。

表2 8種黃烷酮類手性藥物在UBCDP和CDCSP上的分離結(jié)果

α: selectivity factor; ACN: acetonitrile; MeOH: methanol.

圖6 UBCDP拆分手性黃烷酮類色譜圖

2′-羥基黃烷酮最容易被拆分,可能是2′-羥基與鄰近的苯并吡喃環(huán)上的氧原子形成分子內(nèi)氫鍵,使手性分子結(jié)構(gòu)較剛性,有利于環(huán)糊精識(shí)別出R-和S-對映體的差別,從而實(shí)現(xiàn)良好的分離(Rs=4.35)。4′-羥基黃烷酮(Rs=3.47)是在含乙腈的流動(dòng)相中拆分的,這可能是由于甲醇是氫鍵給體,而乙腈不是氫鍵給體,不會(huì)妨礙氫鍵作用的緣故。顯然除包結(jié)作用外,氫鍵作用對手性分離也有重要貢獻(xiàn)。例如含多個(gè)羥基的兒茶素、2′-羥基黃烷酮、柚皮甙和橙皮甙等Rs為1.34～4.35。特別是較大體積的橙皮甙,在單環(huán)糊精固定相上無法拆分,而UBCDP拆分橙皮甙的Rs分別能達(dá)到1.34。說明橋聯(lián)β-環(huán)糊精兩個(gè)空腔協(xié)同作用,在提高手性識(shí)別效率和拆分更大體積溶質(zhì)方面存在優(yōu)勢[16]。

2.3.3丹磺酰氨基酸在UBCDP上的分離

氨基酸分子中同時(shí)有氨基和羧基兩種官能團(tuán),是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位,許多生物大分子的構(gòu)象和功能直接受氨基酸立體結(jié)構(gòu)的影響,對生命科學(xué)具有重要意義。另外,氨基酸也是合成手性藥物的重要中間體或原料。為了更好地拆分和檢測這類高極性的兩性化合物,通常需要衍生化,丹磺酰化的氨基酸是環(huán)糊精固定相的手性色譜性能評(píng)價(jià)的代表性探針。本文在反相色譜條件下,考察了UBCDP對8種常見丹磺酰氨基酸(結(jié)構(gòu)見圖7)的手性色譜性能和分離機(jī)理,分離結(jié)果見表3,色譜圖見圖8。

圖7 8種丹磺酰化氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

反相模式下,在TEAA緩沖體系中,調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)膒H值維持氨基酸分子上氨基和羧基的電離平衡,以便與固定相進(jìn)行手性識(shí)別作用。如表3和圖8所示,UBCDP對選定的丹磺酰氨基酸對映體均有拆分能力,其中對疏水性的丹磺?；牧涟彼?Dns-Leu)和苯丙氨酸(Dns-Phe)能達(dá)到基線分離,而在CDCSP柱上優(yōu)化后也達(dá)不到基線分離(Rs<0.8)。說明疏水性氨基酸更易進(jìn)入環(huán)糊精空腔而被包結(jié),其中協(xié)同包結(jié)更緊密,對R-和S-對映體周圍的環(huán)境識(shí)別更精細(xì),所以分離效果更好,這與袁黎明等[19]的研究結(jié)果一致。從表3對其余6種丹磺酰氨基酸的分離也是橋聯(lián)環(huán)糊精固定相占優(yōu)勢。

列舉另一個(gè)例子,Dns-Asp屬于典型的極性酸性氨基酸,含有兩個(gè)可離子化的羧基,在反相色譜條件下與UBCDP作用力反而較強(qiáng),需要25%(體積分?jǐn)?shù))甲醇和5%(體積分?jǐn)?shù))乙腈才能被洗脫,且能取得較高的分離度(Rs=1.32)。UBCDP和CDCSP兩者的環(huán)糊精端口均沒有進(jìn)衍生化,后者鍵合量更高,推測應(yīng)更有優(yōu)勢?？墒菍?shí)驗(yàn)結(jié)果相反,這說明協(xié)同包結(jié)、氫鍵等作用力可以提高橋聯(lián)環(huán)糊精的手性分離能力[17]。

2.3.4三唑類農(nóng)藥在UBCDP上的分離

三唑類手性農(nóng)藥自1976年上市以來,品種一直在逐年增加,目前已經(jīng)是全球種類最多、應(yīng)用最廣的一大類具有手性結(jié)構(gòu)的殺菌劑和植物生長調(diào)節(jié)劑[22]。由于光學(xué)純異構(gòu)體合成很困難,大多數(shù)仍以外消旋體的形式銷售使用。手性農(nóng)藥的不同對映體對靶標(biāo)生物的生物活性、非靶標(biāo)生物的生態(tài)毒性以及在動(dòng)物和植物體內(nèi)的富集行為往往存在顯著的差異,美國已將三唑類農(nóng)藥列為潛在的手性致癌物[2]。本文在反相色譜模式下,選用常用的己唑醇、粉唑醇、滅菌唑、烯唑醇、三唑醇等9種三唑類殺菌劑作探針,進(jìn)一步評(píng)價(jià)新的固定相拆分含三氮唑基的堿性農(nóng)藥的手性色譜性能。相關(guān)分離結(jié)果、條件及其代表性色譜圖分別見表4和圖9。

表3 8種丹磺酰氨基酸在UBCDP和CDCSP上的分離結(jié)果

TEAA: triethyl ammonium acetate.

圖8 UBCDP拆分手性丹磺酰氨基酸色譜圖

表4 三唑類手性農(nóng)藥在UBCDP和CDCSP上的分離結(jié)果

a and b represent the enantio-resolution of two groups.

從上述圖表中可以看出,采用簡單的甲醇或乙腈和水組成的流動(dòng)相,UBCDP對選定的三唑類農(nóng)藥均能進(jìn)行較好的手性拆分,其中7種在25 min內(nèi)達(dá)到或接近基線分離。UBCDP包結(jié)客體的芳基后,手性碳上的羥基與環(huán)糊精端口更接近,有利于提高手性識(shí)別效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MeOH或ACN含量對分離度的影響呈拋物線趨勢,低濃度MeOH或ACN的流動(dòng)相有利于溶質(zhì)分子在固定相上保留,對拆分有利,但會(huì)造成溶質(zhì)擴(kuò)散,色譜峰展寬和拖尾,對映體選擇性降低;當(dāng)MeOH或ACN的含量在流動(dòng)相中的比例較高時(shí),溶質(zhì)保留太短,還未與固定相作用完全就被洗脫,分離度也會(huì)下降。但甲醇和乙腈的比例會(huì)影響分離選擇性,甲醇是質(zhì)子溶劑,而乙腈不是,應(yīng)該與氫鍵作用有關(guān)。因此,只有調(diào)整流動(dòng)相中MeOH或ACN到合適的含量,才能取得較好的拆分結(jié)果。對于大多數(shù)三唑類手性農(nóng)藥溶質(zhì)分子,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用MeOH/ACN/H2O的混合有機(jī)溶劑做流動(dòng)相更有利于分離,但拆分抑霉唑(imazail)需要用TEAA,否則峰會(huì)展寬。

結(jié)合該類手性探針結(jié)構(gòu)(見圖10)和分離數(shù)據(jù)(見表4)可知:兩固定相對手性碳上有羥基的己唑醇、粉唑醇、戊唑醇和烯唑醇對映體的分離較好,在23 min內(nèi)Rs可達(dá)到1.52～1.58,實(shí)現(xiàn)了完全分離的目標(biāo)。而對手性碳上不含羥基的三唑酮拆分十分困難,只有一點(diǎn)分離。三唑醇有兩個(gè)手性碳,其中一個(gè)與羥基相連,可以被拆分,而另一個(gè)手性碳上沒有羥基,與三唑酮類似,沒有被拆分,故譜圖上只能分出3個(gè)峰(見圖9)。表明羥基作為氫鍵給體,可與固定相上的羥基或脲基形成氫鍵,這一作用對手性識(shí)別至關(guān)重要[18]。CDCSP對上述三唑類農(nóng)藥也展示一定的拆分能力,但達(dá)不到分離,最高的Rs為1.18。

圖9 UBCDP和CDCSP拆分三唑類農(nóng)藥對映體的色譜圖

圖10 9種三唑類手性農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),橋聯(lián)環(huán)糊精固定相對滅菌唑的分離能力比CDCSP強(qiáng)。從圖10可以看出,滅菌唑含有烯鍵,存在順反異構(gòu)體,其中順式含量比反式低。順式有2個(gè)對映體,反式有2個(gè)對映體,一共有4個(gè)對映體。從圖9可看出,UBCDP能較好地拆分得到4個(gè)峰,Rs能達(dá)到1.42?？墒莾?yōu)化后CDCSP只能分離其中順式滅菌唑的2個(gè)對映體,而反式的2個(gè)對映體無法得到拆分?？赡茉蚴菢蚵?lián)環(huán)糊精能通過協(xié)同包結(jié)和多重識(shí)別溶質(zhì),而普通環(huán)糊精只有單個(gè)腔體的包結(jié)作用,很難對滅菌唑進(jìn)行較完整的分子識(shí)別。從表4可知,CDCSP也能拆分部分三唑類農(nóng)藥,但對烯效唑、滅菌唑、三唑醇和抑霉唑拆分效果差,甚至不能拆分。有關(guān)分離機(jī)理很復(fù)雜,有待多維NMR和高分辨質(zhì)譜等技術(shù)做進(jìn)一步的研究。

基于上述不同結(jié)構(gòu)的手性探針的色譜性能表征,研究發(fā)現(xiàn)在端口沒有被衍生的情況下,橋聯(lián)環(huán)糊精固定相仍然展示了較出色的手性色譜性能,表明鄰近腔體間,加上橋基互動(dòng)可以協(xié)同包結(jié)溶質(zhì)分子,協(xié)同包結(jié)作用和更多的氫鍵作用位點(diǎn)提高了橋聯(lián)環(huán)糊精固定相的手性色譜性能。

3 結(jié)論

本文報(bào)道了一種新型UBCDP的制備方法。采用黃烷酮類、氨基酸類和三唑類等不同酸堿性的手性藥物或農(nóng)藥探針,評(píng)價(jià)了新固定相在用途更廣的反相色譜條件下的手性色譜性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無需端口衍生化,僅以簡單甲醇或乙腈-水作流動(dòng)相,成功地拆分了上述25種手性化合物,對4′-羥基黃烷酮的Rs高達(dá)3.45。與CDCSP比較,橋聯(lián)環(huán)糊精具有較高的手性分離能力和較廣泛的分離對象,主要得益于橋聯(lián)雙環(huán)糊精鄰近腔體的協(xié)同包結(jié)作用和多羥基產(chǎn)生的豐富的氫鍵作用位點(diǎn)。橋聯(lián)環(huán)糊精固定相在手性藥物等質(zhì)量監(jiān)測和手性農(nóng)藥對映體殘留量分析中存在廣闊的應(yīng)用前景。