孟德龍，薛寶寶，申奔龍，牛東紅，李家樂，沈和定

(上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

縊蟶Sinonovaculaconstricta俗稱蟶子、蜻等，主要分布在中國、日本和朝鮮等國沿海地區(qū)?？O蟶作為中國四大海水養(yǎng)殖貝類之一，養(yǎng)殖歷史悠久，中國遼寧至廣東沿海均有大規(guī)模養(yǎng)殖?？O蟶營埋棲生活，具有生長快、產(chǎn)量高、味道鮮美且營養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，深得養(yǎng)殖戶喜愛，是中國灘涂養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)貝類[1-2]。2018年中國縊蟶養(yǎng)殖面積為50 750 hm2，產(chǎn)量達(dá)852 925 t[3]。

高溫是導(dǎo)致灘涂貝類夏季死亡的重要原因，近年來隨著全球氣候變暖，海區(qū)溫度不斷上升，在潮間帶生活的貝類經(jīng)常因高溫而遭受溫度脅迫甚至引起死亡，不僅給養(yǎng)殖戶帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，也制約了貝類產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展[4]。溫度是影響海洋生物生長和發(fā)育的主要環(huán)境因子。溫度越高櫛孔扇貝Chlamysfarreri的死亡越嚴(yán)重，且溫度是貝類疾病暴發(fā)的重要因素[5]。夏季高溫期水環(huán)境會急劇惡化，蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis因代謝強(qiáng)度增加而消耗大量能量，導(dǎo)致其死亡率極高[6]。溫度對魁蚶Scapharcabroughtonii的攝食和生長均具有顯著影響[7]。溫度對縊蟶幼體生長與存活[8-9]、耗氧率與排氨率[10]和攝食率[11]均有顯著影響。在合適的溫度范圍內(nèi)，多數(shù)貝類的生長會隨著溫度的升高而上升，當(dāng)超過其耐受溫度，貝類生長緩慢且部分生理功能紊亂，最終引發(fā)死亡[12-13]。

目前，經(jīng)濟(jì)貝類的育種已取得一定進(jìn)展，并獲得了不少貝類新品種，如“蓬萊紅”櫛孔扇貝、“海大金貝”蝦夷扇貝、“中科紅”海灣扇貝Argopectenirradians和“東優(yōu)1號”雜色鮑Haliotisdiversicolor等，對貝類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了積極作用。目前，縊蟶的人工選育研究主要集中在生長性狀方面[14-16]，而有關(guān)抗逆性能的研究報道較少[17-19]?？O蟶的抗逆性狀缺乏定向選育，因此，培育優(yōu)質(zhì)抗逆新品種是保證縊蟶增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要保證。本研究中，在快生長新品種“申浙1號”的基礎(chǔ)上，于2018 年建立并獲得了耐高溫家系，對不同縊蟶家系的生長性狀、半致死溫度進(jìn)行了分析和比較，旨在為快生長且耐高溫縊蟶新品種(系)的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室的縊蟶快長新品種“申浙1號”群體。

1.2 方法

1.2.1 親貝篩選與促熟 從“申浙1號”選育群體中挑選300枚大小相似、表面無損傷的縊蟶親本，在泡沫箱中進(jìn)行高溫脅迫，挑選耐熱親本。正常水溫為29 ℃，按照2 ℃/d的升溫速度升溫至36 ℃,達(dá)到溫度后保持溫度恒定。每2 h觀察一次，及時撈出死貝。通過一周的高溫篩選后，用篩選出的親本在浙江省三門縣六敖鎮(zhèn)東航水產(chǎn)育苗科技公司建立家系。試驗(yàn)用水為沙濾海水，鹽度為13～22，試驗(yàn)過程中保持微充氣，投喂球等鞭金藻Isochrysisgalbana、牟氏角毛藻Chaeroeerosmoelleri等單胞藻類及蝦塘水。保證水中餌料充足，每天全量換水一次。投喂餌料及換水時，保證水溫與升溫溫度相同。夜晚用恒溫加熱棒進(jìn)行控溫。

1.2.2 耐高溫家系建立 2018年9月上旬，前期挑選的親貝性腺成熟，經(jīng)過陰干降溫刺激12 h，晚上20:00～22:00開始產(chǎn)卵和排精，將正在排精(霧狀)、產(chǎn)卵(顆粒狀)的個體挑選出來，用沙濾海水洗凈后分別放在盛有新鮮海水的10個500 mL燒杯中，鹽度為12，養(yǎng)殖群體雌雄各一個，共選取20個。采取單配對的方法建立10個全同胞家系作為家系組，同時以縊蟶群體繁育材料作為對照組。將獲得的精卵放在事先準(zhǔn)備好的10個50 L白桶中迅速混合，均勻攪拌，進(jìn)行孵化。大約17 h左右受精卵發(fā)育為D形幼蟲。整個操作中，各試驗(yàn)組應(yīng)嚴(yán)格隔離，使各組不受其他外來精卵影響。

1.2.3 室內(nèi)幼蟲培育

(1) 浮游幼蟲培育。孵化16 h后，用300目網(wǎng)袋過濾出D形幼蟲，幼蟲在50 L小白桶中進(jìn)行培育，調(diào)整密度為6～8 ind./mL，前期投喂球等鞭金藻，每天投喂3次，每2 d后全量換水一次，后期主要投喂牟氏角毛藻和少量球等鞭金藻，投喂量視幼蟲攝食情況而定。為防止換水過程中各家系間幼蟲的混雜，換水網(wǎng)袋單獨(dú)使用。幼蟲培育期間，海水水溫為29～31 ℃，pH為7.8，鹽度為8。為消除養(yǎng)殖密度對生長速度的影響，在幼蟲期換水過程中對密度進(jìn)行調(diào)整，使每個組的密度保持一致。在浮游幼蟲期進(jìn)行篩選，從10個家系中獲得3個較耐高溫家系(A、B、C)。

(2) 匍匐幼蟲培育。幼蟲一般經(jīng)過6～8 d培育可附著變態(tài)，在附著前1～2 d投放適量的滅菌泥巴。家系A(chǔ)、B、C及群繁對照組匍匐幼蟲培育期，每5 d全量換水一次，主要投喂牟氏角毛藻和蝦塘水，換水時控制密度一致。

1.2.4 幼蟲生長性狀測定 測量2、4、6、10、20、30日齡幼蟲的殼長和殼高。殼長<300 μm的幼蟲在顯微鏡下用目微尺(×100)測量，300 μm<殼長<3.00 mm的稚貝在體視顯微鏡下用目微尺(×25)測量，殼長>3.0 mm的幼貝用游標(biāo)卡尺測量。每個家系及對照組隨機(jī)測量30只幼蟲，重復(fù)測量3次，取其平均值，評價不同家系的生長性能。

1.2.5 半致死溫度的確定 從每個家系和對照組中隨機(jī)挑選出30只幼蟲，分別放入12個體積為6.16 L的塑料盆(35 cm×22 cm×8 cm)中，每組設(shè)3個重復(fù)。根據(jù)文獻(xiàn)[20]和其他貝類溫度試驗(yàn)，設(shè)置試驗(yàn)水溫為30、32、34、36、38 ℃ 5個組，升溫方法從正常水溫30 ℃開始按1 ℃/2 h的速度升溫。溫度控制采用曹伏君等[21]方法，使用水銀溫度計、500 W石英加熱管等控溫，溫度控制在±0.1 ℃。脅迫期間, 正常投喂餌料。

以幼蟶50%死亡溫度為半致死溫度，以平均相對存活率為依據(jù)，采用二點(diǎn)法[22]求半致死溫度(UILT50)，計算公式為

UILT50=(P1-50%)/(P1-P2)×(T2-T1)。

其中：T1、T2分別為存活率接近50%時的最低、最高溫度(℃)；P1、P2為相應(yīng)的相對存活率(%)，存活率計算公式為

真正存活率=試驗(yàn)?zāi)┐婊顢?shù)/試驗(yàn)初總數(shù)×100%，

相對存活率=真正存活率/對照組存活率×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件及Excel 2010軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差法分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性分析，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 家系生長比較

從圖1可見，進(jìn)入匍匐幼蟲期后，家系C生長最快，變態(tài)后表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢，10、20、30日齡時，家系C的殼長和殼高生長均顯著快于其他兩個家系(P<0.05)，而群繁對照組幼蟲的殼長和殼高均顯著小于家系試驗(yàn)組(P<0.05)。

2.2 家系間半致死溫度比較

從圖2可見，10、20、30日齡時，家系C的半致死溫度均顯著高于其他兩個家系(P<0.05)，而群繁對照組幼蟲的半致死溫度顯著低于家系試驗(yàn)組(P<0.05)。

3 討論

3.1 縊蟶耐高溫家系的選育

研究表明，高溫刺激會影響貝類的生理、生長、存活等[23-24]，從而對養(yǎng)殖產(chǎn)量造成影響[25]?？O蟶作為生活在潮間帶的灘涂貝類，由于其特殊的棲息方式,受高溫影響更為顯著，在夏季退潮后經(jīng)太陽暴曬的海水水溫快速上升，從出入水孔流進(jìn)蟶穴可導(dǎo)致縊蟶被燙傷或燙死[26]。高溫是影響縊蟶生長和病害發(fā)生的重要環(huán)境因素之一，因此，進(jìn)行縊蟶耐高溫性狀遺傳改良顯得尤為重要。本研究中在高溫季節(jié)通過耐熱性選育，在縊蟶幼蟲及稚貝階段對家系的耐高溫性進(jìn)行提前篩選，不僅可有效提高縊蟶的高溫存活率，而且對探索縊蟶南移養(yǎng)殖新模式開發(fā)具有重要意義。

3.2 家系耐高溫能力與生長性狀的相關(guān)性分析

本研究中以“申浙1號”為基礎(chǔ)群體，采用耐高溫性作為親本選擇指標(biāo)，利用家系選育技術(shù)構(gòu)建縊蟶耐熱家系，試驗(yàn)結(jié)果表明，在生長性狀方面，幼蟲期和稚貝期的不同家系生長性狀在不同日齡均表現(xiàn)出不一致性，但均高于群繁對照組，各家系間的生長快慢與半致死溫度高低有關(guān)，即生長快的個體具有較高的半致死溫度，如家系C，其后代生長及耐高溫性能均表現(xiàn)優(yōu)良。各家系組生長性狀顯著高于對照組，說明家系可固定群體內(nèi)主要經(jīng)濟(jì)效應(yīng)的加性基因，使后代經(jīng)濟(jì)性狀得到遺傳改良。

在高溫存活性能方面，本試驗(yàn)中同一家系內(nèi)不同生長階段的半致死溫度不同，稚貝期各家系的半致死溫度均顯著高于群繁對照組，這可能是由于生長快速家系在機(jī)體各方面生理指標(biāo)都較強(qiáng)，從而具有一定的耐高溫性，從幼蟲的附泥到稚貝出苗，其半致死溫度逐漸上升，縊蟶的耐高溫性狀與日齡增長呈正相關(guān)。在墨西哥灣扇貝耐熱性的研究中發(fā)現(xiàn)，稚貝的高溫耐受性比幼貝低[22]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，各個家系的耐高溫性能有顯著性差異，這與李煉星等[15]的試驗(yàn)結(jié)果相似。這種相關(guān)性可為后續(xù)培育生長快且耐高溫的優(yōu)良品種奠定基礎(chǔ)。各家系的耐高溫能力的優(yōu)勢存在顯著性差異，這也在一定程度上反映出家系選擇在縊蟶耐高溫選育中的高效性。目前，有關(guān)水產(chǎn)動物耐熱性狀遺傳機(jī)制的研究較少，因此，本試驗(yàn)結(jié)果可為以后的耐熱性狀QTL定位等育種相關(guān)工作提供理論依據(jù)。

綜上所述，“申浙1號”具有良好的生長性能和耐熱性能，用生長快、出肉率高的“申浙1號”作為親本進(jìn)行耐熱新品系的選育效果更佳。