劉三立，蔡未，劉子泉，侯世科，樊毫軍，丁輝

1中國人民武裝警察部隊后勤學院，天津300162；2中國人民解放軍98985部隊衛(wèi)生連；3天津大學災(zāi)難醫(yī)學研究院

高原肺水腫是發(fā)生在健康人群快速進入海拔2 500 m以上高度時常出現(xiàn)的威脅生命的急性并發(fā)癥[1, 2]。高原肺水腫起病急，進展快，如救治不及時，可在較短時間內(nèi)發(fā)展至呼吸衰竭甚至死亡，病死率36.36%～90%[3]，是嚴重威脅高原人群健康和生命的急性重癥高原病。個體所處的海拔高度、上升速率、預(yù)適應(yīng)能力及其易感性是導致高原肺水腫發(fā)生的主要因素[4]。張西南等[5]發(fā)現(xiàn)，385例急性高原病患者中重型高原病175例，死亡5例，病死率1.3%。我國高原面積大，常駐人口多，如何預(yù)防高原肺水腫的發(fā)生及減輕其嚴重程度是高原醫(yī)學領(lǐng)域亟待解決的重大課題。

microRNA(miRNA)是一組21～25 nt長的非編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，能通過堿基配對與mRNA分子的3′UTR相結(jié)合，降解mRNA或抑制靶基因的翻譯，從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后表達的調(diào)控。2007年，Kulshreshtha 等[6]首次報道了缺氧與miRNA的關(guān)系，采用基因芯片技術(shù)篩選出了27個缺氧相關(guān)miRNA。Alam 等[7]首次研究了miRNA在高原肺水腫病理生理方面發(fā)揮的重要作用。大量缺氧介導的差異表達miRNA參與了與高原肺水腫發(fā)病機制密切相關(guān)的諸如離子通道、肺動脈高壓、血管功能和應(yīng)激反應(yīng)等的調(diào)控過程，表明高原肺水腫受miRNA遺傳調(diào)控作用的影響。2018年12月～2019年6月，本研究在低氧暴露不同時間條件下，建立穩(wěn)定大鼠高原肺水腫模型，運用基因芯片技術(shù)篩選出差異表達高原肺水腫大鼠與健康大鼠肺組織差異表達miRNA，并進行靶基因預(yù)測及miRNA對靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析和生物學信息分析，揭示這些差異表達miRNA與高原肺水腫的內(nèi)在聯(lián)系，為探索高原肺水腫發(fā)病機制提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器 SPF級成年雄性SD大鼠24只(購自軍事醫(yī)學科學院動物中心)，體質(zhì)量180～200 g；芯片類型：miRNA 4.0 Rat(美國Affymetrix公司)：GeneChip WT Terminal Labeling and Controls Kit、Ambion WT Expression Kit、GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit；芯片設(shè)備、軟件(美國Affymetrix公司)：基因芯片洗脫工作站GeneChip Fluidics Station 450、基因芯片雜交爐GeneChip Hybridization Oven 645、基因芯片掃描儀GeneChip Scanner 3000 7G、GeneChip GCOS軟件Affymetrix GeneChip Operating Software；TRIzol RNA提取試劑(美國invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，SYBR Green預(yù)混液(日本TaKaRa公司)，IL-6、TNF-α、IL-10 ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，BCA總蛋白試劑盒(北京索萊寶公司)，熒光定量PCR儀(美國Bio-RAD公司)，超微量紫外分光光度計(德國implen公司)，DMI3000B生物倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 高原肺水腫大鼠模型建立及鑒定 將大鼠隨機分為4組：對照組和低氧24、48、72 h組，每組6只。低氧組使用數(shù)字化動物實驗艙(武警后勤學院)模擬6 000 m低壓低氧環(huán)境，運行時間依據(jù)每次造模時間設(shè)置，設(shè)置艙內(nèi)溫度為(10±2)℃，濕度保持在(60±10)%，艙內(nèi)汞壓 54.5 kPa，氧濃度 9.76%，氧分壓9.9 kPa，泵切換時間720 min，高度上升/下降速率為10 m/s，啟動制冷開啟模式。對照組在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)72 h。造模完成后，各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(2 mL/0.1 kg)麻醉，取仰臥位固定。經(jīng)會陰上方腹部正中做縱行切口，充分暴露腹腔后，腹主動脈抽取2 mL動脈血。采集的血樣本4 ℃、3 000 r/min、離心后取血清保存于-80 ℃冰箱，采用ELISA法檢測IL-6、TNF-α、IL-10。打開胸腔結(jié)扎右主支氣管，氣管插管通過左主支氣管向左肺緩緩注入生理鹽水4 mL，緩慢回抽生理鹽水再重新注入，重復(fù)沖洗2～3次，將收集到的肺泡灌洗液(BALF)800 g，4 ℃離心10 min，保留上清液，采用ELISA法檢測IL-6、TNF-α、IL-10。分離右肺，右上葉用于測量肺組織含水量，右中葉用4%多聚甲醛固定用于肺組織HE染色，右下葉-80 ℃低溫冰箱中保存，進行后續(xù)miRNA芯片分析。低氧24、48、72 h組及對照組血清IL-6水平分別為(68.20±9.66)、(99.83±13.10)、(88.39±14.71)、(37.03±14.22)pg/μL；TNF-α水平分別為(218.19±25.76)、(311.08±34.91)、(281.68±32.92)、(173.95±24.04)pg/μL；IL-10水平分別為(39.34±4.51)、(54.05±7.57)、(64.70±8.22)、(23.98±5.91)pg/μL。低氧24、48、72 h組及對照組BALF中IL-6水平分別為(105.25±9.38)、(145.39±17.25)、(129.83±14.16)、(79.86±15.29)pg/μL；TNF-α水平分別為(303.94±27.79)、(370.14±34.00)、(365.74±19.58)、(260.61±29.92)pg/μL；IL-10水平分別為(53.88±5.40)、(66.47±6.48)、(79.21±9.82)、(38.37±5.34)pg/μL。低氧24、48、72 h組及對照組總蛋白量分別為(0.36±0.10)、(0.39±0.13)、(0.38±0.03)、(0.20±0.05)mg/μL。低氧24、48、72 h組及對照組肺含水量分別為0.79±0.01、0.80±0.02、0.80±0.01、0.78±0.02。與對照組相比，低氧24、48、72 h組血清和BALF中IL-6、IL-10、TNF-α水平升高，BALF中總蛋白含量增多(P均<0.01)。與對照組相比，低氧48、72 h組肺組織含水量增加(P均<0.05)。病理染色結(jié)果示，各低氧組表現(xiàn)出明顯的肺泡及間質(zhì)水腫、肺泡間隔增厚伴紅細胞浸潤、炎性滲出。以上結(jié)果提示高原肺水腫模型成功建立。

1.3 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達miRNA篩選、靶基因預(yù)測及其相互作用分析 利用miRNA 4.0-Rat芯片(美國Affymetrix公司)對肺組織miRNA進行篩選。取1 μg 肺組織總RNA進行樣本RNA質(zhì)量檢測?？俁NA加尾后，加入FlashTag Biotin HSR Ligation Mix(美國Affymetrix公司)至已加尾混合液中按照廠家說明進行生物素標記和純化，用GeneChip Hybridization Oven 645(美國Affymetrix公司)與Affymetrix miRNA 4.0 microarray(美國Affymetrix公司)雜交，用GeneChip Fluidics Station 450(美國Affymetrix公司)進行芯片洗脫，然后用GeneChip Scanner 3000 7G(美國Affymetrix公司)掃描芯片。原始數(shù)據(jù)由GeneChip GCOS(美國Affymetrix公司)分析處理，差異表達miRNA比較，P<0.05, FC>2.0被認為是差異基因。采用miRanda和TargetScan 兩個數(shù)據(jù)庫對得到的差異miRNA進行靶基因預(yù)測，最后對兩種預(yù)測的結(jié)果取交集以增加結(jié)果的可靠性。

1.4 大鼠肺組織差異表達miRNA基因本體功能(GO)及信號通路分析 將以上得到的差異表達miRNA靶基因基于 GO數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋，KEGG數(shù)據(jù)庫進行信號通路注釋，顯著性篩選的標準，P<0.05。

1.5 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達miRNA檢測 在連續(xù)上調(diào)和下調(diào)的差異表達miRNA中選擇相對表達強度上調(diào)較為明顯和相對表達強度下調(diào)較明顯者進行qPCR。使用TRIzol試劑提取樣本組織總RNA。RNA在260 nm處通過吸光度定量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。qPCR儀進行實時PCR反應(yīng)。采用U6作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示目的基因表達水平。

2 結(jié)果

2.1 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達miRNA 以FC>2.0為準，篩選出的差異表達miRNA有14種，其中上調(diào)的有5種，分別為rno-miR-324-5p、rno-miR-6215、rno-miR-3473、rno-miR-344g、rno-miR-541-5p；下調(diào)的有9種，分別為rno-miR-3544、rno-miR-322-3p、rno-miR-203a-3p、rno-miR-342-5p、rno-miR-3556b、rno-miR-532-5p、rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p、rno-miR-187-3p。在這些差異表達miRNA中，隨著時間推移，表達量持續(xù)上調(diào)和下調(diào)的miRNA有5種。其中上調(diào)的有2種，分別為rno-miR-344g和rno-miR-541-5p，四組之間rno-miR-541-5p比較，低氧72 h組<低氧24 h組、低氧48 h組、對照組(P均<0.05)，而低氧48 h、低氧24 h組與對照組之間比較，P均>0.05；四組之間rno-miR-344g比較，P>0.05。下調(diào)的有3種，分別為rno-miR-3556b、rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p，四組rno-miR-3556b比較：低氧48、72 h組<對照組(P均<0.05)；四組rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p比較：低氧48、72 h組<低氧24 h組、對照組(P均<0.05)。

2.2 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達miRNA靶基因預(yù)測結(jié)果及其對靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 低氧組與常氧組差異表達miRNA靶基因在miRanda和TargetScan數(shù)據(jù)庫中的交集較多。差異miRNA調(diào)控的靶基因很多，如：rno-miR-344g(76個)、rno-miR-541-5p(111個)、rno-miR-3556b(5個)、rno-miR-361-3p(198個)、rno-miR-101a-5p(48個)、rno-miR-187-3p(19個)、rno-miR-203a-3p(113個)、rno-miR-322-3p(36個)、rno-miR-324-5p(77個)、rno-miR-342-5p(32個)、rno-miR-3473(50個)、rno-miR-3544(39個)、rno-miR-532-5p(58個)、rno-miR-6215(15個)。同時，這些miRNA之間存在多個相互關(guān)聯(lián)的靶基因。其中，rno-miR-203a-3p與rno-miR-541-5p的交互靶基因有1個(Nrp1)，與rno-miR-324-5p的交互靶基因有1個(Med22)，與rno-miR-322-3p的交互靶基因有1個(Plekhh2)，與rno-miR-3544的交互靶基因有1個(Parg)；rno-miR-101a-5p與rno-miR-541-5p的交互靶基因有1個(Rora)，與rno-miR-361-3p的交互靶基因有2個(Ldoc1l、Pnoc)，與rno-miR-187-3p的交互靶基因有1個(Naa38)；rno-miR-541-5p與rno-miR-361-3p的交互靶基因有1個(Dcx)，與rno-miR-342-5p的交互靶基因有2個(Lrch1、Slc1a2)，與rno-miR-532-5p的交互靶基因有1個(C1orf21)；rno-miR-361-3p與rno-miR-324-5p的交互靶基因有2個(Scn2b、Lama4)，與rno-miR-322-3p的交互靶基因有2個(Otud3、Zc3h13)，與rno-miR-3544的交互靶基因有2個(Tle3、Ube2d4)，與rno-miR-3473的交互靶基因有1個(Zbtb24)，與rno-miR-344g的交互靶基因有1個(Sbno1); rno-miR-324-5p與miR-3473的交互靶基因有1個(Hoxb3)；rno-miR-3473與rno-miR-532-5p的交互靶基因有1個(Znf652)；rno-miR-532-5p與rno-miR-344g的交互靶基因有1個(Bsnd)；rno-miR-344g與rno-miR-6215的交互靶基因有1個(Pmfbp1)。

2.3 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達miRNA的基因本體功能及信號通路 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達miRNA參與的生物學過程有66種，主要涉及核酸的調(diào)控如RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控(GO:0000122)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控(GO:0006357)等，蛋白泛素化如蛋白K63有關(guān)泛素化(GO:0070534)、蛋白K6有關(guān)泛素化(GO:0070534)等，信號通路如Wnt信號通路(GO:0016055)、胞內(nèi)受體信號通路(GO:0030522)等，血管生理如血管發(fā)育(GO:0001568)、血管新生(GO:0001525)等以及生物進程如大腦發(fā)育(GO:0007420)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育(GO:0007399)等。在細胞的組成成分層面有28種，主要涉及細胞內(nèi)組成如核漿(GO:0005654)、胞質(zhì)(GO:0005829)等，細胞器如蛋白復(fù)合體(GO:0043234)、多核糖體(GO:0005844)等，細胞膜如基膜(GO:0005605)、膜組成部分(GO:0005887)，細胞功能如神經(jīng)元投射(GO:0043005)、細胞黏附連接(GO:0005913)等。在基因分子功能層面有30種，主要涉及與生物分子有關(guān)的結(jié)合如蛋白結(jié)合(GO:0019901)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(GO:0033613)等，生物分子的活性如泛素蛋白轉(zhuǎn)移活性(GO:0004842)、氯離子通道活性(GO:0005254)，分子功能(GO:0003674)等。差異表達miRNA涉及的信號通路有11種，主要有PI3K-Akt信號通路(pathway ID：rno04151)、癌癥通路(pathway ID：rno05200)、細胞外基質(zhì)受體相互作用通路(pathway ID：rno04512)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路(pathway ID：rno04141)、泛素介導的蛋白水解作用通路(pathway ID：rno04120)等。

2.4 四組關(guān)鍵差異miRNA 比較 在5種連續(xù)上調(diào)和下調(diào)的高原肺水腫大鼠肺組織差異表達miRNA中選擇相對表達強度上調(diào)較為明顯的rno-miR-541-5p，和相對表達強度下調(diào)較為明顯的rno-miR-101a-5p進行熒光定量qPCR驗證。低氧72 h組、低氧48 h組、低氧24 h組、對照組rno-miR-541-5p分別為1.72±0.18、1.43±0.36、1.46±0.14、1，rno-miR-101a-5p分別為0.64±0.23、0.46±0.25、0.91±0.23、1。與對照組相比，rno-miR-541-5p在低氧暴露各組相對表達量顯著升高(P均<0.05);與對照組相比，rno-miR-101a-5p在低氧暴露組相對表達量下降，其中低氧48 h組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低氧24 h組與低氧48 h組比較，P<0.05。與miRNA芯片結(jié)論一致。

3 討論

當個體在適應(yīng)高原環(huán)境的過程中，機體的基因表達會發(fā)生一系列變化，以平衡缺氧引起的應(yīng)激，其調(diào)控元件如miRNA參與了高原肺水腫的發(fā)展過程。文獻報道了多種miRNA參與調(diào)控了急性肺損傷的發(fā)生，并可能成為分子治療的潛在靶標。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物靶向miR-381介導的NLRP3的表達，能夠減輕LPS誘導的急性肺損傷。Zhou等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-126-3p的過表達能夠抑制炎癥蛋白HMGB1和血管通透性因子VEGF-A，增加緊密連接蛋白的表達。Zhang等[10]證實了miR-96和miR-330均可通過與AQP5的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合來調(diào)節(jié)AQP5的表達，從而減輕LPS誘導的急性肺水腫。有研究[11, 12]發(fā)現(xiàn)，miR-144和miR-155被認為是兩種相互拮抗的miRNA，miR-144可減弱肺血管中ROCK1/MLC通路的激活，起到抗炎作用，而在miR-155基因敲除的小鼠中，Ang-2- Tie-2-MLC信號通路活性降低，炎癥相關(guān)蛋白被下調(diào)，表明miR-155對LPS誘導的急性肺損傷具有促進作用。相關(guān)研究表明，miR-16、miR-20b，miR-22、miR-206和miR-17/92在低氧暴露中表達下調(diào)，抑制離子通道并增加肺動脈壓，從而導致血管功能障礙和細胞完整性喪失。而miR-23b，miR-26a和miR-155抑制TGF信號傳導并導致肺動脈壓升高，miR-210能夠抑制線粒體功能，這些生理功能與高原肺水腫密切相關(guān)，表明高原肺水腫是一種器官特異性(肺)和環(huán)境應(yīng)激誘導的疾病[7]。

本研究在建立低氧暴露24、48、72 h模型的基礎(chǔ)上，運用基因芯片技術(shù)，以FC>2.0為標準，選取了14種差異表達miRNA，其中上調(diào)的有5種，下調(diào)的有9種。miRNA對基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，上述miRNA存在多種交互基因如Scn2b、Lama4、Hoxb3、Zc3h13等，預(yù)測它們可能共同參與調(diào)控了高原肺水腫的發(fā)生發(fā)展，其具體機制有待進一步研究。進一步篩選分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在低氧24、48、72 h組表達量連續(xù)上調(diào)或下調(diào)的miRNA有5種，其中上調(diào)的miRNA有rno-miR-344g和rno-miR-541-5p,下調(diào)的miRNA有rno-miR-3556b、rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p。說明上述5種miRNA在低氧暴露的同時，隨著低氧時間的延長，相對表達呈現(xiàn)出明顯的時間相關(guān)性，其在低氧中的上調(diào)或下調(diào)影響著特定靶基因表達的增加或降低，可能發(fā)揮著諸如改變細胞整合和屏障功能、血管滲透性等高原肺水腫的病理生理因素等[7]。有文獻報道m(xù)iR-541-5p與肺纖維化的發(fā)生有關(guān)，其通過在蛋白翻譯水平上調(diào)節(jié)PDE1A的表達而成為肺成纖維細胞的關(guān)鍵因子，同時，我們通過基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)RORα是rno-miR-101a-5p參與血管新生的靶基因之一，這兩種在本研究中上調(diào)和下調(diào)較為明顯的miRNA 是否也通過特定機制發(fā)揮對高原肺水腫的調(diào)控作用，有待進一步研究[13～15]。

低氧是引起高原肺水腫的重要因素，高原引發(fā)肺水腫的發(fā)生機制主要有：①低氧引起肺動脈強烈收縮、肺血管損傷、通透性增加導致液體滲入肺泡增多，肺水腫形成；②低氧誘導免疫因子和炎癥因子增多，促進肺動脈血管通透性增加；③低氧抑制Na+-K+-ATP酶活性，引起肺泡上皮細胞鈉離子和水等清除障礙，導致肺組織水潴留[16, 17]。有文獻報道，在人肺微血管內(nèi)皮細胞中，通過激活PI3K/Akt信號通路可以改善內(nèi)皮細胞屏障功能障礙。鄧旺等[18, 19]研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K /Akt 信號通路能上調(diào)ENaC的表達，清除急性肺損傷時肺內(nèi)多余的水腫液，從而減輕肺組織損傷，表明PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)肺水腫方面發(fā)揮著重要作用。Villar等[20]在大鼠COPD模型中發(fā)現(xiàn)抑制Wnt信號通路可減輕肺組織損傷，改善肺功能并重新建立肺泡上皮細胞表面標志物的表達，說明Wnt信號通路影響著肺泡-毛細血管屏障的通透性。在本研究中，我們通過信號通路的顯著性分析發(fā)現(xiàn)miRNA對Wnt、PI3K/Akt信號通路也具有相關(guān)調(diào)控作用，說明篩選出的相關(guān)miRNA可能通過調(diào)控特定信號通路對高原肺水腫的產(chǎn)生起到正性或負性調(diào)節(jié)作用。此外，通過對14種miRNA的靶基因進行關(guān)于細胞組分、分子功能、生物過程的富集分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-101a-5p、miR-203a-3p、rno-miR-361-3p、rno-miR-541-5p、rno-miR-324-5p、rno-miR-344g、rno-miR-532-5p、rno-miR-3473等具有調(diào)控血管新生的功能，而血管新生可以誘導肺毛細血管通透性的增加導致肺水腫的發(fā)生[21, 22]。結(jié)合本研究對miRNA的生物信息學分析，我們推斷高原低氧下差異表達的miRNA參與了對高原肺水腫的調(diào)控過程。

綜上所述，在高原肺水腫大鼠肺組織中差異表達miRNA有14種，其中持續(xù)上調(diào)的有rno-miR-344g、rno-miR-541-5p，下調(diào)的有rno-miR-3556b、rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p。這些miRNA之間存在許多交互靶基因，并與其靶基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要參與核酸的調(diào)控等生物學過程，影響細胞內(nèi)組成如核漿、胞質(zhì)等，涉及生物分子有關(guān)的結(jié)合，相關(guān)的信號通路主要有PI3K-Akt信號通路等。高原肺水腫大鼠肺組織中差異表達miRNA及其靶基因參與了諸如血管新生、血管發(fā)育、細胞黏附連接、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、PI3K-Akt信號通路等與高原肺水腫形成機制緊密相關(guān)的細胞分子生物學過程，表明這些差異表達miRNA可能參與調(diào)控了高原肺水腫發(fā)生的可能機制，這為進一步探索高原肺水腫發(fā)病機制及其預(yù)防治療提供了新思路。