張崇威，吳志明，李華岑，趙逢冰，陳 薔，宋志超

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008)

豬肉、雞肉及雞蛋作為人們的重要食物來源，其質(zhì)量安全問題越來越受到關(guān)注。獸藥殘留作為影響食品安全的重要因素之一，始終是焦點(diǎn)話題，因此對獸藥殘留的檢測顯得尤為重要。常用的獸藥殘留檢測方法主要有液相色譜法[1]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[2-4]、氣相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、酶聯(lián)免疫法[7]等。目前，對動物源食品中獸藥多殘留檢測的研究相對較少，檢測方法多為高分辨質(zhì)譜篩查[8-10]，定量效果欠佳。利用液相色譜法[11]及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]進(jìn)行多殘留分析雖有報(bào)道，但分析物種類不全、基質(zhì)單一、操作復(fù)雜。例如，郭德華等[14]報(bào)道的多殘留檢測方法不包含氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、抗病毒類、鎮(zhèn)靜劑類及麻醉劑類等常用獸藥，且采用HLB柱及MCX柱凈化，前處理過程繁瑣。郝杰等[15]報(bào)道的多殘留檢測方法不包含硝基咪唑類、鎮(zhèn)靜劑類及麻醉劑類藥物，且檢測樣品主要為水產(chǎn)品。因此，建立一種快速、簡便的豬肉、雞肉、雞蛋基質(zhì)中常用獸藥多殘留的檢測方法顯得極為重要。

新型的Captiva EMR-Lipid固相萃取柱可通過體積排阻和疏水相互作用選擇性捕獲脂類，使體積較大的分析物被阻止在外，因而具有良好的凈化效果。本研究以Captiva EMR-Lipid為凈化手段，對豬肉、雞肉、雞蛋中的β-受體激動劑類、磺胺類、氟喹諾酮類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、抗病毒類、四環(huán)素類、抗膽堿類、局部麻醉劑類共9類51種常用藥物進(jìn)行了快速篩查和定量分析。該方法的凈化效果好，靈敏度高，且檢測藥物種類覆蓋了目前養(yǎng)殖及運(yùn)輸環(huán)節(jié)的常用或禁用藥物，能夠滿足豬肉、雞肉、雞蛋中多種類獸藥篩查確證工作的需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Waters Acquity UPLC-Xevo TQ-S三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；3K-30型臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；TTL-DCⅡ氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；ES3200型天平(感量0.01 g)；Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司)；KQ 5800 B型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；TARGIN TECH VX-03多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；IKA MS3 Basic圓周振蕩器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)；移液器(德國 Eppendorf 公司)。

1.2 材料與試劑

乙腈(色譜純，美國Merck公司)；甲酸(色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；Na2HPO4·12H2O、C6H8O7·H2O及Na2EDTA·2H2O(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液：將12.9 g C6H8O7·H2O、27.6 g Na2HPO4·12H2O和37.2 g Na2EDTA·2H2O溶于900 mL水中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 4.0±0.1，加水稀釋至1 000 mL即得。Captiva EMR-Lipid固相萃取柱(3 mL/300 mg，用前無需活化，安捷倫科技有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)品：51種待測物標(biāo)準(zhǔn)品(見表1)，內(nèi)標(biāo)物：金剛烷胺-D15、沙丁胺醇-D3、克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3，純度均大于95%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取對照品各約10 mg(以單體計(jì))，用甲醇稀釋成1 000 μg/mL的貯備液。再分別移取0.1 mL上述各貯備液，以50%乙腈稀釋至10 mL，得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃保存。

混合內(nèi)標(biāo)溶液：分別準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)對照品各約10 mg(以單體計(jì))，用甲醇稀釋成1 000 μg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。準(zhǔn)確移取0.1 mL上述各貯備液，以50%乙腈稀釋至10 mL，得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液，于-20 ℃保存。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：以50%乙腈將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋成質(zhì)量濃度為5、10、20、50、80、100 μg/L的系列標(biāo)液中間液。以50%乙腈將混合內(nèi)標(biāo)溶液逐步稀釋成質(zhì)量濃度為50 μg/L的內(nèi)標(biāo)中間液。分別精密吸取各質(zhì)量濃度的標(biāo)液中間液及內(nèi)標(biāo)中間液各0.1 mL于相應(yīng)經(jīng)前處理所得的空白樣品洗脫液中，氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇復(fù)溶過濾后，待測。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取豬肉、雞肉、雞蛋樣品各2 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入1.0 mL Mcllvaine-Na2EDTA及5.0 mL 0.2%甲酸乙腈溶液，加入陶瓷均質(zhì)子振蕩10 min，于5 ℃以10 000 r/min離心10 min，移取上清液于另一50 mL離心管中，殘?jiān)尤?.0 mL 5%甲酸乙腈溶液重復(fù)提取1次。合并2次提取液，混勻后于5 ℃以10 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL過Captiva EMR-Lipid柱，混勻后取2.0 mL濾液氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?.0 mL 10%甲醇復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測定。

1.5 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序： 0～1.0 min，5% A；1.0～3.0 min，5%～15% A；3.0～7.0 min，15%～40% A；7.0～9.0 min，40%～95% A；9.0～12.0 min，95%A；12.0～15.0 min，95%～5% A；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；錐孔氣流量：150 L/h；脫溶劑氣流量：1 000 L/h。51種化合物的定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓如表1所示。

表1 51種化合物的定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓

(續(xù)表1)

CategoryCompoundQualitative ions(m/z)Cone voltage(V)Collisionvoltage(eV)Erythromycin(紅霉素)734.37>158.02?,734.37>576.2742.0,42.026.0,16.0Clarithromycin(克拉霉素)748.38>158.08?,748.38>590.3024.0,24.024.0,16.0Azithromycin(阿奇霉素)749.41>158.08?,749.41>591.3934.0,34.036.0,24.0Guitarmycin(吉它霉素)772.41>109.01?,772.41>174.0650.0,50.040.0,28.0Tilmicostar(替米考星)869.47> 174.07?,869.47>696.3610.0,10.044.0,38.0Roxithromycin(羅紅霉素)837.43>158.01?,837.43>679.3316.0,16.030.0,18.0

* quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液兩種流動相體系的分離效果，結(jié)果顯示乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相時的分離效果更好，出峰時間更快，縮短了分析時間。進(jìn)一步比較了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.5%甲酸水溶液作為流動相時各化合物的響應(yīng)值，結(jié)果顯示響應(yīng)值無明顯變化，考慮到色譜柱損耗及實(shí)驗(yàn)成本，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。并采用梯度洗脫方式，第1.0 min用5%乙腈將極性較大的雜質(zhì)洗脫，然后逐漸增加乙腈比例，使各化合物在1.0～9.0 min內(nèi)完全出峰，9.0～12.0 min內(nèi)乙腈比例保持為95%，將進(jìn)樣通道內(nèi)剩余雜質(zhì)全部洗脫，12.0～15.0 min為色譜柱壓力平衡時間，為下一針進(jìn)樣做準(zhǔn)備，最終實(shí)現(xiàn)了51種化合物的有效分離。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-4,12-13]，所檢各化合物的離子模式均為正離子模式，因此本實(shí)驗(yàn)采用正離子模式對各化合物進(jìn)行全掃描，通過一級質(zhì)譜獲取穩(wěn)定的[M+H]+分子離子，以確定母離子。MRM模式下，在二級質(zhì)譜中母離子與Ar碰撞后發(fā)生斷裂或重排等裂解反應(yīng)，產(chǎn)生不同質(zhì)荷比(m/z)的碎片離子，選取干擾最少、強(qiáng)度較高的2個離子碎片分別作為定量和定性離子，并優(yōu)化碰撞能量使各離子碎片的響應(yīng)值達(dá)到最高。優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.5”所示。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯以及這3種提取溶劑中分別加入0.1%、0.2%、0.5%、1%、5%甲酸或0.1%、0.2%、0.5%、1%、5%氨水對51種化合物提取效率的影響。結(jié)果顯示，甲醇及乙酸乙酯提取液的雜質(zhì)多；氟喹諾酮類藥物在堿性條件下的回收率很差，只有20%左右。乙腈作為提取溶劑的回收率整體較好，且在乙腈中加入0.2%甲酸可將回收率提高10%以上，這主要是因?yàn)榇郎y物均含有堿性基團(tuán)，甲酸可提供酸性環(huán)境，并與待測物形成有機(jī)鹽，提高待測物極性，根據(jù)相似相溶原理，從而提高了待測物的提取效率。隨著甲酸比例的增加，大多數(shù)化合物的回收率有所提高，但四環(huán)素類藥物的回收率明顯下降，說明該類藥物在酸性條件下不穩(wěn)定。因此，確定第1次提取時采用低濃度的0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑，同時加入1.0 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液，以提高四環(huán)素類藥物的提取效率；第2次采用高濃度的5%甲酸乙腈，以增加其余化合物的提取效率。

2.3.2 凈化方法的選擇目前多殘留檢測主要采用QuEChERS[16-17]、PEP-2[18-19]、Prime HLB[20]、Captiva EMR-Lipid 4種樣品凈化方法。對比了上述4種方法的凈化效果(如圖1)，結(jié)果顯示：QuEChERS法的除雜質(zhì)效果不理想，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，西馬特羅、非諾特羅因雜質(zhì)干擾而無法分辨主峰；采用Prime HLB凈化萃取后，四環(huán)素類藥物的回收率不足50%，可能其對四環(huán)素類藥物的吸附能力較強(qiáng)，不易洗脫所致；與PEP-2相比，Captiva EMR-Lipid對51種化合物具有更好的凈化效果，除四環(huán)素類藥物的回收率為60%～80%外，其余化合物的回收率均為75%～110%，因此選用Captiva EMR-Lipid作為凈化用固相萃取柱。

圖1 4種凈化方法的回收率比較

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用HPLC-MS/MS分析樣品時，基質(zhì)效應(yīng)是影響定量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素[21]。基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指在樣品測定過程中，由于待測物以外其他物質(zhì)的存在或其他物理、化學(xué)因素直接或間接影響離子化效果，從而影響待測物響應(yīng)的現(xiàn)象?；|(zhì)效應(yīng)的計(jì)算多采用提取后添加法，該法最早由Matuszewski等[22]提出，是將空白樣品處理凈化后，在所得空白提取液中添加待測物，在相同儀器條件下，比較空白基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┲心繕?biāo)化合物的離子強(qiáng)度，從而評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。其計(jì)算公式ME(%)=X/Y×100，其中X、Y分別為空白基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┑捻憫?yīng)值。若ME值小于100%，表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；若ME值大于100%，表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；若ME值等于100%，表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。表2為部分化合物的基質(zhì)效應(yīng)。

表2 部分藥物的基質(zhì)效應(yīng)

由表2可知，除雞肉中環(huán)丙沙星外，各目標(biāo)化合物的ME值均小于100%，表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)及基質(zhì)匹配方法消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺、金剛烷胺4種化合物采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，其余化合物則采用基質(zhì)匹配外標(biāo)校正的方法，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5 方法學(xué)評價(jià)

2.5.1 線性關(guān)系對豬肉、雞肉、雞蛋中51種藥物殘留進(jìn)行檢測，采用基質(zhì)匹配曲線校正，以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，豬肉、雞肉、雞蛋3種基質(zhì)中各化合物均在0.5～10 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均不小于0.999 0。其中，豬肉基質(zhì)的相關(guān)參數(shù)見表3。

表3 豬肉中51種化合物的相關(guān)系數(shù)(r)、線性方程、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

(續(xù)表3)

CompoundrLinear equationMean recovery(%)5 μg/kg10 μg/kg20 μg/kgRSD(%)5 μg/kg10 μg/kg20 μg/kgClorprenaline0.999 0Y=409 011X+9 67489.788.488.93.94.86.2Cimaterol0.999 1Y=128 716X+7 54080.983.681.96.34.65.8Terbutaline0.999 8Y=57 801X+8 06678.275.981.65.16.34.1Tulobuterol0.999 6Y=421 551X+23 54678.478.979.12.34.61.8Salbutamol0.999 5Y=1.303X+0.143 410110299.21.10.441.7Ractopamine0.999 6Y=1.127X+0.106 098.497.91020.900.521.0Clenbuterol0.999 6Y=0.432 6X+0.044 841081061011.10.920.33Fenoterol0.999 5Y=3 084X+41388.979.877.12.63.94.9Penbuterol0.999 2Y=516 352X-40 11680.977.675.93.94.77.6Sulfamethoxazole0.999 4Y=37 044X+15 94786.584.690.62.61.75.9Sulfamethazine0.999 4Y=202 634X+22 40810699.81016.54.85.1Sulfamonomethoxine0.999 6Y=83 443X+10 28988.882.681.22.65.43.6Sulfaquinoxaline0.999 1Y=22 206X+3 51779.877.879.12.84.56.8Sulfadimethoxine0.999 2Y=101 587X+20 07275.679.982.11.95.26.1Trimethoprim0.999 3Y=243 645X-9 14578.981.076.93.32.91.9Sulfadoxine0.999 1Y=180 023X+50 58489.995.599.91.95.64.4Atropine0.999 2Y=618 873X+56 92976.979.982.10.322.10.64Scopolamine0.999 4Y=255 901X-4 08978.980.175.61.92.91.7Anisodamine0.999 0Y=272 925X-36 03178.980.981.21.72.12.3Lidocaine0.999 0Y=881 893X-24 97078.978.979.91.30.542.1Procaine0.999 0Y=172 658X-13 90675.978.977.11.20.921.3Flumequine0.999 3Y=372 330X+46 84281.283.686.52.91.85.9Oxolinic acid0.999 6Y=347 072X+36 66888.986.187.10.570.851.6Norfloxacin0.999 0Y=118 559X-4 39977.678.982.52.64.93.4Ciprofloxacin0.999 2Y=82 536X+2 34378.981.977.65.64.13.8Pefloxacin0.999 1Y=102 166X+3 23677.178.980.92.01.91.8Lomefloxacin0.999 4Y=163 785X+22 58077.989.585.63.12.44.5Danofloxacin0.999 7Y=29 674X+1 83577.979.985.55.96.21.5Enrofloxacin0.999 2Y=131 360X-17 81278.188.979.56.94.15.4Ofloxacin0.999 1Y=160 976X+1 41580.978.587.11.62.40.77Marbofloxacin0.999 2Y=91 493X-95681.185.679.35.64.93.4Sarafloxacin0.999 6Y=29 502X+4 50989.982.991.71.10.932.1Orbifloxacin0.999 6Y=108 255X-2 12688.987.991.81.22.60.76Tetracycline0.999 5Y=128 667X-17 22066.167.171.53.75.61.5Doxycycline0.999 2Y=19 393X-1 44764.163.967.91.92.01.6Terramycin0.999 2Y=151 469X-10 91267.975.668.11.92.01.0Aureomycin0.999 2Y=12 215X-60762.364.271.01.60.932.3Clindamycin0.999 3Y=366 137X+33 03081.982.489.91.92.61.1Tiamulin0.999 2Y=875 027X-51 74888.489.592.91.92.00.76Erythromycin0.999 8Y=3 836X-48588.978.581.62.11.90.67Clarithromycin0.999 1Y=290 553X-58 48776.579.577.12.93.64.1Azithromycin0.999 6Y=74 162X-17 47476.979.981.91.12.10.87Guitarmycin0.999 5Y=55 389X-13 16281.677.976.95.42.93.6Tilmicostar0.999 5Y=6 419X-40680.689.91065.56.94.5Roxithromycin0.999 2Y=92 139X-17 04881.998.495.61.93.60.92

2.5.2 檢出限與定量下限向空白豬肉、雞肉、雞蛋樣品中添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.4”處理后采用“1.5”條件進(jìn)行分析。 以特征質(zhì)量色譜峰的信噪比S/N>3時對應(yīng)的加標(biāo)水平為檢出限，S/N>10時對應(yīng)的加標(biāo)水平為定量下限，得到豬肉、雞肉、雞蛋樣品中51種化合物的檢出限均為2.5 μg/kg，定量下限均為5.0 μg/kg。

2.5.3 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在空白豬肉、雞肉、雞蛋樣品中分別添加5、10、20 μg/kg 3個濃度水平的藥物含量進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每一濃度做5個平行，其中豬肉基質(zhì)的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表3。結(jié)果表明：3種基質(zhì)中各目標(biāo)物在3個加標(biāo)水平下的回收率為60%～110%，RSD小于10%，滿足殘留分析的要求。圖1為空白豬肉中加標(biāo)量均為5 μg/kg時部分化合物的色譜圖。

圖2 51種藥物在空白豬肉基質(zhì)中添加量為5 μg/kg的代表性藥物色譜圖

2.6 實(shí)際樣品的檢測

采用本方法對市場抽取的48份豬肉、48份雞肉和72份雞蛋進(jìn)行了檢測，同時與國標(biāo)方法[23-26]相比較。結(jié)果顯示，2份豬肉中檢出多西環(huán)素，殘留量分別為9.76 μg/kg/11.1 μg/kg(表示本方法檢測量/國標(biāo)方法檢測量，下同)、7.44 μg/kg/8.01 μg/kg；5份豬肉中檢出金霉素，本方法與國際方法檢測的殘留量均為5～10 μg/kg。2份雞肉中檢出金剛烷胺，殘留量分別為4.90 μg/kg/5.12 μg/kg、3.55 μg/kg/3.81 μg/kg；10份雞肉中檢出土霉素，殘留量為5.83～12.9 μg/kg/6.00～14.3 μg/kg；1份雞肉中檢出金霉素，殘留量為7.72 μg/kg/7.68 μg/kg。2份雞蛋中檢出金剛烷胺，殘留量分別為3.60 μg/kg/3.78 μg/kg、2.74 μg/kg/2.65 μg/kg；2份雞蛋中檢出甲氧芐啶，殘留量分別為11.2 μg/kg/10.5 μg/kg、91.3 μg/kg/99.9 μg/kg；1份雞蛋中檢出環(huán)丙沙星、4份雞蛋中檢出恩諾沙星、1份雞蛋中檢出氧氟沙星，殘留量為3.09～33.9 μg/kg/2.89～48.8 μg/kg；1份雞蛋中檢出多西環(huán)素，殘留量為25.2 μg/kg/28.4 μg/kg；2份雞蛋中檢出土霉素，殘留量分別為46.3 μg/kg/50.4 μg/kg、35.1 μg/kg/33.1 μg/kg。

3 結(jié) 論

本研究建立了測定豬肉、雞肉、雞蛋中51種藥物殘留的Captiva EMR-Lipid固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，各目標(biāo)物的檢出限均為2.5 μg/kg，定量下限均為5.0 μg/kg，在5、10、20 μg/kg加標(biāo)水平下的平均回收率為60%～110%，RSD小于10%。該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確度高，能夠滿足豬肉、雞肉、雞蛋中多殘留檢測的需求。