魏亞南，張東升，林 青，孫廣偉，雷兆霖，張津源，郭 超，陳濟豐，周 瑋,3

( 1.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023； 2.廣州市海大集團，廣東 廣州 510000； 3.大連市水產產業(yè)技術創(chuàng)新聯(lián)合會，遼寧 大連 116023 )

池塘養(yǎng)殖是遼寧、山東沿海海參的重要養(yǎng)殖方式，隨著海參養(yǎng)殖時間的延長，海參病害頻發(fā)[1]，有效改善海參池塘水質質量、實現(xiàn)高效健康養(yǎng)殖是相關研究的熱點問題。自然納潮[2]是海參養(yǎng)殖中原始的水質調控方式，運行成本低，但沉積物中有機質的分解能力較弱，高溫和溫躍層時期易造成池塘底部缺氧。微孔曝氣[3]是近年流行的一種海參養(yǎng)殖水質調控方式，其方法是在池底鋪設微孔增氧管道，提高水體氧化效率。但氣孔易堵塞，難于清理，維護成本較高。養(yǎng)水機是本項目團隊在實施“十二五”國家支撐計劃項目中開發(fā)設計的新型水質調控設備，作用方式是將表層水經過生物包再沖入底層水，從而使得表、底層水持續(xù)交換，達到凈化水質的目的。前期試驗顯示，養(yǎng)水機調控下的池塘海參成活率可達95%以上[2]，其水質凈化效果與海參養(yǎng)殖效果均有明顯提高。

土壤中的酶反映了土壤的肥力[4]。施肥、耕種方式、土壤性質都影響土壤中酶的活力，從而影響土壤中氮、磷、鉀等元素的可利用性，影響植物生長，因此深受農業(yè)學者的重視，而有關養(yǎng)殖池塘中各種酶活性的變化，研究較少。林海[5]的研究表明，增氧池塘沉積物中蛋白酶、脲酶、蔗糖酶等酶活性分別高于自然池塘的3.98%、1.11%、1.25%。前期研究表明，養(yǎng)水機可以有效降低海參池塘沉積物有機質含量[6]，提高異養(yǎng)菌數(shù)量[7]，上述結論與沉積物中酶活性的相關性研究，尚未見報道。筆者以自然納潮池塘、微孔曝氣池塘、養(yǎng)水機池塘為對象，對3種調控方式下海參池塘沉積物中淀粉酶、蛋白酶、堿性磷酸酶、脫氫酶的周年活性變化情況進行跟蹤比較研究，擬從酶活性角度對3種水質調控方式的機理進行探討，旨在為海參健康養(yǎng)殖水質調控提供背景資料。

1 材料與方法

1.1 池塘條件

在大連寶發(fā)海珍品有限公司分別選擇自然海參養(yǎng)殖池塘2口，運行1年的微孔曝氣池塘和養(yǎng)水機池塘各2口。池塘規(guī)格均為長605 m、寬85 m的標準矩形池塘。池塘均為泥沙底質，鋪設網(wǎng)礁，水泥護坡。每月大潮期間換水3～5 d，年水深為1.2～2.0 m。自然池塘未設相關水質調控設施；微孔曝氣池塘底部鋪設1套微孔曝氣系統(tǒng)，由空壓機(0.15 W/m2)、總供氣管和微孔曝氣盤組成，按設備使用規(guī)范進行管理操作；養(yǎng)水機池塘在池塘出水口設置養(yǎng)水機1臺(功率750 W)，每日21:00至翌日9:00共工作12 h，冬季正常工作。各池塘仿刺參(Apostichopusjaponicus)規(guī)格、密度相同，不投餌、不投藥，試驗期間統(tǒng)一管理。

1.2 樣品的采集及處理采樣時間及采樣點

2015年10月至2016年9月，每月大潮(農歷十五)前3～5 d進行采樣，冬季時將冰面鑿開采樣。采樣點設在進水口、出水口及池塘中間位置。

間隙水采集：將間隙水采集器向水下垂直插入沉積物至預定深度(-10 cm)，靜置等待采集裝置內充滿間隙水后，將其裝入具塞小瓶帶回實驗室進行分析。

沉積物采集：參照《海洋調查規(guī)范》[8]第6部分海洋生物調查中規(guī)定的方法進行采集，使用圓柱形采泥器(橫截面直徑5 cm)采集泥樣，取表層0～10 cm沉積物，去除植物根系、貝殼、石塊等雜質，裝入無菌自封袋中帶回實驗室后，放在通風良好且避光處風干至恒定質量，將風干后樣品進行研磨，用100目篩絹進行過濾、混勻、封袋，4 ℃下保存待測。

1.3 沉積物部分理化因子的檢測

按照《海洋調查規(guī)范》[8]手冊采用YSI Prouplus型水質分析儀測定間隙水溫度、pH、溶解氧；沉積物間隙水的總氮測定采用過硫酸鉀氧化法；底泥耗氧速率的測定采用實驗室測定法[9]；按照《海洋監(jiān)測規(guī)范》[10]中的的重鉻酸鉀氧化—還原容量法測定沉積物總有機碳、灼燒法測定沉積物有機質含量。

1.4 酶活性的檢測

按照文獻[11]中方法，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定沉積物中淀粉酶活性，茚三酮比色法測定蛋白酶活性，磷酸苯二鈉比色法測定堿性磷酸酶活性，氯化三苯基四氮唑比色法測定脫氫酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各種酶的試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，各池塘酶和水質之間的相關性采用SPSS 17.0軟件進行雙變量相關性分析，以皮爾森系數(shù)表示相關性的大小，以P<0.05為相關，P<0.01為極相關。

2 結 果

2.1 3種水質調控方式對海參池塘沉積物中淀粉酶活性的影響

各池塘沉積物中淀粉酶活性周年變化見圖1。其變化趨勢基本一致，自然納潮、微孔曝氣、養(yǎng)水機池塘最高值分別出現(xiàn)在6月、3月、5月，最低值均出現(xiàn)在1—2月。自然納潮池塘年變化為0.126～0.695 mg/g，極差0.569 mg/g，年均值(0.290±0.169) mg/g；微孔曝氣池塘年變化為0.210～0.830 mg/g，極差0.62 mg/g，年均值(0.410±0.199) mg/g；養(yǎng)水機池塘年變化為0.348～0.880 mg/g，極差0.532 mg/g，年均值(0.540±0.171) mg/g。3種水質調控方式相比，養(yǎng)水機池塘沉積物中淀粉酶活性最高，但波動最小，自然池塘淀粉酶活性最低。

圖1 3種水質調控方式下池塘沉積物中淀粉酶活性周年變化Fig.1 The annual change in amylase activity in pond sediments under three water quality control methods

2.2 3種水質調控方式對海參池塘沉積物中蛋白酶活性的影響

各池塘沉積物中蛋白酶活性周年變化見圖2。其變化趨勢基本一致，自然納潮池塘和微孔曝氣池塘最高值均出現(xiàn)在10月，養(yǎng)水機池塘最高值出現(xiàn)在1月，各池塘最低值均出現(xiàn)在7—8月。自然池塘沉積物中蛋白酶活性年變化為0.063～0.472 mg/g，極差0.409 mg/g，年均值(0.230±0.084) mg/g；微孔曝氣池塘年變化為0.044～0.354 mg/g，極差0.310 mg/g，年均值(0.190±0.101) mg/g；養(yǎng)水機池塘年變化為0.024～0.294 mg/g，極差0.270 mg/g，年均值(0.16±0.125) mg/g。3種水質調控方式相比，養(yǎng)水機池塘沉積物中蛋白酶活性最低，波動最小，自然池塘活性最高，波動最大。

圖2 3種水質調控方式下池塘沉積物中蛋白酶活性周年變化Fig.2 The annual change in protease activity in pond sediments under three water quality control methods

2.3 3種水質調控方式對海參池塘沉積物中堿性磷酸酶活性的影響

各池塘沉積物中堿性磷酸酶活性周年變化見圖3。其周年變化趨勢基本一致，最高值均出現(xiàn)在8月，最低值自然納潮池塘在3月，微孔曝氣和養(yǎng)水機池塘均在10月。自然池塘沉積物中堿性磷酸酶活性年變化為0.165～1.042 mg/g，極差0.877 mg/g，年均值(0.47±0.243) mg/g；微孔曝氣池塘年變化為0.068～0.726 mg/g，極差0.658 mg/g，年均值(0.32±0.193) mg/g；養(yǎng)水機池塘年變化為0.083～0.633 mg/g，極差0.550 mg/g，年均值(0.24±0.152) mg/g。3種水質調控方式相比，養(yǎng)水機池塘沉積物堿性磷酸酶活性最低，波動最小，自然池塘年均值最高，波動最大。

圖3 3種水質調控方式下池塘沉積物中堿性磷酸酶活性周年變化Fig.3 The annual change in alkaline phosphatase activity in pond sediments under three water quality control methods

2.4 3種水質調控方式對海參池塘沉積物中脫氫酶活性的影響

各池塘沉積物中脫氫酶活性周年變化見圖4。其變化趨勢不一致，自然納潮池塘最高值出現(xiàn)在11月，最低值出現(xiàn)在8月，年變化為19.681～52.794 mL/g，極差33.113 mL/g，年均值(34.78±10.010) mL/g；微孔曝氣池塘最高值出現(xiàn)在6月，最低值出現(xiàn)在10月，年變化為12.200～31.638 mL/g，極差19.438 mL/g，年均值(19.88±6.184) mL/g；養(yǎng)水機池塘最高值出現(xiàn)在1月，最低值出現(xiàn)在7月，年變化為12.092～41.411 mL/g，極差29.319 mL/g，年均值(26.28±8.69) mL/g。3種水質調控方式相比，微孔曝氣池塘沉積物脫氫酶活性最低，波動最小，與養(yǎng)水機池塘酶活性差異不顯著，自然池塘活性最高，波動性也最大，與微孔曝氣、養(yǎng)水機池塘差異性顯著(P<0.05)。

圖4 3種水質調控方式下池塘沉積物中脫氫酶活性周年變化Fig.4 The annual change in dehydrogenase activity in pond sediments under three water quality control methods

2.5 3種水質調控方式下沉積物部分理化指標情況

3種水質調控方式下沉積物部分理化指標見表1。自然納潮池塘、微孔曝氣池塘及養(yǎng)水機池塘間隙水溫度年變化分別為-2.1～27.5 ℃、-2.0～27.1 ℃、-2.0～27.5 ℃，各池塘差異不顯著；間隙水pH年變化分別為7.3～8.5、7.4～8.5、7.4～8.6，各池塘差異不顯著；間隙水總氮年變化分別為23.930～48.140 mg/L、26.540～49.960 mg/L、28.730～40.540 mg/L，各池塘差異不顯著；沉積物總有機碳年變化分別為83.270～249.680 mg/L、77.690～408.510 mg/L、53.970～375.170 mg/L，各池塘差異不顯著；沉積物有機質年變化為1.020%～1.430%、0.930%～1.230%、0.750%～1.030%，各池塘之間差異均極顯著(P<0.01)；沉積物底泥耗氧率年變化為711～996 mg/(m2·d)、666～731 mg/(m2·d)、633～726 mg/(m2·d)，自然納潮池塘與微孔曝氣池塘、養(yǎng)水機池塘差異均極顯著(P<0.01)，微孔曝氣池塘與養(yǎng)水機池塘差異不顯著。

表1 3種水質調控方式下沉積物部分理化指標Tab.1 Some of physicochemical indices of sediments under three water quality control methods

綜上所述，沉積物有機質、蛋白酶、耗氧率、堿性磷酸酶及脫氫酶活性均在自然池塘中均值最高，變化幅度最大，淀粉酶活性則最低；而間隙水溫度、pH、總氮、總有機碳均在微孔曝氣池塘中均值最高。

2.6 3種水質調控方式池塘沉積物酶活性與間隙水理化因子相關性

各池塘沉積物酶活性與間隙水理化因子相關性見表2。各池塘淀粉酶均與pH呈正相關；蛋白酶均與總氮呈正相關，與有機質、pH、底泥耗氧率呈極負相關，與溫度呈負相關，在微孔曝氣池塘與養(yǎng)水機池塘中蛋白酶活性分別與堿性磷酸酶活性呈極負相關、負相關；堿性磷酸酶與總有機碳、溫度呈正相關；脫氫酶活性在自然納潮池塘與養(yǎng)水機池塘中與總氮呈正相關。

表2 3種水質調控方式各池塘沉積物酶活性與間隙水理化因子的相關性Tab.2 Correlation between sediment enzyme activity and interstitial water physicochemical factors in three water quality control methods

注：*在0.05級別，相關性顯著；**在0.01級別，相關性極顯著.

Note: * denotes that the correlation is significant at the level of 0.05;** denotes that the correlation is very significant at the level of 0.01.

3 討 論

池塘沉積物酶是構成沉積物的重要組成之一，數(shù)量少，作用大，產生于沉積物中的微生物、動物和植物根系生命活動的積累過程[12-15]。沉積物酶作為沉積物中一切生物化學反應的主要參與者，在沉積物生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量轉化中起著非常重要的作用，反映了沉積物中各種生物化學過程的強度和方向，其活性大小代表了沉積物中物質代謝的旺盛程度[16]。

3.1 3種調控方式下各池塘沉積物酶活性周年變化分析

3.1.1 沉積物脫氫酶活性變化原因分析

在沉積物所含的所有酶中，脫氫酶反映了微生物代謝強度的大小，可以作為微生物氧化還原系統(tǒng)的指標，被認為能很好地表征沉積物中微生物的氧化能力[17]，與沉積物呼吸呈正相關，而與微生物量無關[17-18]。本研究測定的自然納潮池塘底泥耗氧量和脫氫酶含量最高，而同期測定的自然納潮池塘沉積物中可培養(yǎng)異養(yǎng)菌數(shù)量[7]最低，這樣的結果與文獻一致，這可能與采樣時間有關。采樣時自然納潮池塘與其他兩類池塘相比，有機質含量最高，導致其微生物活性仍處于較高的水平，從側面反映了自然納潮池塘在換水前仍有大量可被微生物利用的有機質存在，說明自然納潮池塘僅通過交換水不能有效地清除過多累積的有機物；而養(yǎng)水機和微孔曝氣池塘脫氫酶活性采樣時較低，說明池塘中可被微生物利用的有機質較少[6]，這樣可被細菌利用的有機質不會過多積累于池塘底部，在夏季高溫期，就不會大量消耗氧氣，產生有害化合物，而使池塘底部溶氧較高、水質較好，有利于海參健康生長，特別是養(yǎng)水機池塘。

3.1.2 沉積物蛋白酶、堿性磷酸酶活性變化原因分析

蛋白酶廣泛存在于細菌、放線菌和真菌中，提供生物可利用氮，與土壤總氮呈正相關[19-21]，堿性磷酸酶能加速有機磷的脫磷速度[22]，與土壤中總磷呈正相關[4,20,23]，本研究測定的養(yǎng)水機池塘沉積物中蛋白酶含量和堿性磷酸酶含量與脫氫酶含量一樣，均最低，說明此時養(yǎng)水機池塘有機氮和有機磷的剩余量較少[6]，即養(yǎng)水機能夠快速去除池塘沉積物中的有機氮和有機磷，避免池塘沉積物有機氮和有機磷的積累，避免夏季高溫期厭氧發(fā)酵，毒害海參。

3.1.3 沉積物淀粉酶活性變化原因分析

淀粉酶是參與碳循環(huán)的重要酶類[24]，碳源分解一方面為細菌的生長提供碳源，另一方面為微生物生長提供能源。本研究養(yǎng)水機池塘淀粉酶活性最大，說明養(yǎng)水機池塘沉積物有機碳分解強度較大。這與每月采樣時間有關，每月采樣時間均為池塘納水半個月后，此時供細菌生長的有機氮、有機磷已很少，養(yǎng)水機池塘較其他兩種水質調控方式池塘產生大量細菌及真菌[7,25]，為供其生存，需消耗淀粉獲得能量，導致養(yǎng)水機池塘淀粉酶活性最高。

本試驗從酶的角度探究了3種水質調控方式下，池塘沉積物中酶的活性變化情況，研究可知養(yǎng)水機池塘由于打破上下層水體交換，使上層水中的溶氧輸入下層水，使沉積物中有機質輸入上層水中，加快了有機質的降解效率，致使進水一段時間后，蛋白酶和堿性磷酸酶活性降低，在本試驗條件下，養(yǎng)水機比自然池塘和微孔曝氣池塘更加快速的降解了含氮、含磷有機質，目前養(yǎng)水機的使用功率比微孔曝氣在去除有機質方面更加有效，但這種功率是否為最佳，有待于進一步研究。

3.2 池塘沉積物酶活性與其他環(huán)境因子的關系

沉積物酶活性與沉積物的理化因子、生物因子密切相關，本研究測定的3種水質調控方式池塘沉積物中淀粉酶、蛋白酶、堿性磷酸酶及脫氫酶含量均不同，可能與3種水質調控方式下沉積物中微生物組成不同有關[26]。

值得注意的是,養(yǎng)水機池塘脫氫酶活性與蛋白酶活性呈正相關，說明養(yǎng)水機池塘決定微生物活性強度的是氮，而微孔曝氣池塘決定微生物活性的卻是磷，因此，為加強養(yǎng)水機池塘微生物活性，是否可在水中加有機氮，有待于進一步研究。

一般在底物含量充足及其他環(huán)境適合的條件下，在一定溫度范圍內，酶活性隨溫度的升高而升高，本研究淀粉酶、堿性磷酸酶與此情況相一致(表2)，而蛋白酶卻具有隨溫度升高而呈下降的趨勢，這可能是因為蛋白酶底物是有機氮，而各池塘有機氮含量隨溫度升高而下降，因此蛋白酶呈現(xiàn)出夏季低冬季高的特點。自然納潮池塘的脫氫酶活性在溫度較低的11月和3月較高，而養(yǎng)水機池塘脫氫酶活性在溫度最低的1月較高，而不是在溫度較高的7—8月較高，這兩類池塘的脫氫酶活性均與池塘總氮呈正相關，而微孔曝氣池塘脫氫酶活性卻在溫度較高的6、8月較高，這種現(xiàn)象值得進一步試驗，以了解這些酶發(fā)生變化的機制。此外，養(yǎng)水機和微孔曝氣池塘中脫氫酶活性在3、10、11月，堿性磷酸酶活性在5、8、10、11月，蛋白酶活性在5、6、11月均顯著低于自然納潮池塘，雖然周年沉積物酶活性與水中的氨氮、亞硝態(tài)氮含量相關性不顯著，但在上述時間段沉積物中酶的含量與水中的氨氮、亞硝態(tài)氮含量一致[27]，養(yǎng)水機池塘中酶活性、氨氮、亞硝態(tài)氮含量最低，自然納潮池塘中最高，這段時間正是海參復蘇，大量進食階段，養(yǎng)水機池塘氨氮和亞硝態(tài)氮低含量均有利于海參的生長。