楊 宙,黃仁良,何 虎,劉建華,曹豐生

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/水稻國家工程實驗室(南昌)/國家水稻改良中心 南昌分中心,江西 南昌 330200)

葉脈是植物莖稈中維管束在葉片中的延伸和分支,能夠發(fā)揮支撐葉片和輸送水分、營養(yǎng)的作用。植物葉脈的形態(tài)結(jié)構(gòu)較為簡單,但是其形成過程涉及到非常復(fù)雜的分子機制。葉脈發(fā)育包括維管束的結(jié)構(gòu)建成和排布延伸兩個步驟,受到多個基因控制和內(nèi)外因素共同影響[1]。單子葉植物和雙子葉植物葉片中維管束的排布延伸方式不同,分別形成網(wǎng)狀葉脈和平行葉脈。

水稻是單子葉植物中的模式植物,其中脈和側(cè)脈沿著葉片縱向分布,其間通過細脈相連[2]。中脈位于水稻葉片的中央,最大的結(jié)構(gòu)特征在于含有兩個被稱為透明細胞的小腔,是由大量細胞的細胞程序性死亡形成[3]。中脈在葉片遠軸面和近軸面還分別具有一個中心維管束和小維管束,是支撐水稻葉片挺立的主要結(jié)構(gòu)。中脈正常發(fā)育可以保證葉片維持直立的形態(tài),增加葉片受光率,提高光合效能。因此,對水稻中葉脈相關(guān)性狀的研究不僅有利于探明單子葉植物葉脈的發(fā)育機制,還能為構(gòu)建水稻理想株型提供依據(jù)。

突變體是進行水稻分子生物學(xué)研究的重要材料,中葉脈缺失會引起水稻葉片披垂,是一個很明顯的突變性狀。Nagasawa等[4]在早期報道了4個葉片披垂的水稻突變體材料dl-1、dl-2、dl-sup1和dl-sup2,它們都不能形成中葉脈,因突變效應(yīng)不同,穎花發(fā)育也出現(xiàn)了不同程度的變異。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)DL基因位于3號染色體的短臂上,上述4個突變體是DL基因發(fā)生了不同等位突變的結(jié)果。DL基因?qū)儆赮ABBY基因家族,編碼的蛋白具有一個N端鋅指結(jié)構(gòu)域和一個C端YABBY結(jié)構(gòu)域。水稻DL基因發(fā)生變異后,葉片中央?yún)^(qū)域的細胞不能沿著葉原基軸正常增殖,導(dǎo)致無法形成中葉脈[5]。此外,DL基因突變還會引起雌蕊發(fā)育異常,并且與SPW1基因之間存在負(fù)調(diào)控[6]。

國內(nèi)也報道了多個水稻葉片披垂的無中葉脈突變體,普遍表現(xiàn)為隱性遺傳,單個基因控制。利用遺傳群體和分子標(biāo)記分析,突變基因dl大多被定位在3號染色體的短臂上[7-11],也有個別被定位在1號染色體上[12]。另外,還有一個名為MR304的突變體的葉片披垂性狀由兩對隱性基因控制,其中一對為主效基因[13]。

水稻的中葉脈缺失會導(dǎo)致葉片披垂,影響葉片的光合性能,是一種不利突變性狀。但是在水稻育種方面,可以將dl基因?qū)氩挥抵?培育葉片披垂的不育系。這種不育系的穗層明顯高于葉層,在雜交制種過程中更容易授粉,從而獲得較高的產(chǎn)量[14-16]。葉片披垂是隱形突變性狀,與野生型外觀區(qū)別明顯,因此還可以作為形態(tài)學(xué)標(biāo)記用于水稻純度鑒定和雜株去除。

目前國內(nèi)外報道的水稻中葉脈缺失突變的癥狀除葉片披垂外,大多還伴隨花器官發(fā)育異常。本研究發(fā)現(xiàn)了一個中葉脈缺失的自然突變體,其花器官發(fā)育沒有受到影響,與之前報道的突變表型不完全相同,命名為dl-7。本研究對該突變表型及遺傳特性進行了分析,利用分子標(biāo)記精細定位了突變基因,旨在為研究水稻葉脈的發(fā)育提供材料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻材料來源于中種恢629與鎮(zhèn)恢084雜交F2代中的一個自然變異單株,突變性狀為葉片披垂。篩選至F10代后,獲得了突變性狀和農(nóng)藝性狀同時穩(wěn)定的株系,命名為dl-7。將中種恢629作為野生型對照材料。

1.2 突變性狀和農(nóng)藝性狀的觀察

在水稻抽穗期觀察突變體和野生型的植株形態(tài),比較各葉位上葉片的形態(tài)和中脈發(fā)育。然后隨機選擇20個突變體單株,每個單株取50個穎花觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。取劍葉的中間段,先用FAA固定液(70%乙醇90 mL,冰醋酸5 mL,37%甲醛5 mL)固定,然后用乙醇脫水。經(jīng)石蠟包埋后用切片機制作5 μm厚的橫切面切片,進行番紅-固綠染色,最后用顯微鏡觀察。待水稻成熟后,收獲突變體和野生型各10個單株,考察結(jié)實率,用成組數(shù)據(jù)的t測驗比較兩者之間的差異。

1.3 遺傳特性分析

以dl-7為母本,分別與本課題組的3個恢復(fù)系材料R071、R077和R112雜交,在F1代觀察突變表型。將自交F2代群體各種植約300株,單本移栽,在水稻抽穗期觀察突變表型,并統(tǒng)計葉片直立和葉片披垂的單株數(shù)量,檢驗遺傳分離比。

1.4 基因定位

以dl-7與R077雜交的F2代作為遺傳群體,對突變基因dl-7進行定位。取水稻葉片用CTAB法抽提小量基因組DNA；SSR標(biāo)記引物序列根據(jù)網(wǎng)上(http://www.gramene.org/)已發(fā)布的序列進行設(shè)計,由江西鼎國創(chuàng)飛生物科技有限公司合成。用512個SSR標(biāo)記對兩個親本進行分析,篩選具有多態(tài)性的標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系和程序參照相關(guān)文獻進行,取2 μL擴增產(chǎn)物用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,經(jīng)銀染顯色后觀察。

用篩選到的多態(tài)性SSR標(biāo)記對30個F2代單株進行檢測,將突變體帶型記為1,野生型帶型記為2,雜合體帶型記為3,利用MAPMAKER(EXP3.0)作圖軟件對植株表型和SSR帶型進行連鎖分析[17]。然后在SSR標(biāo)記定位的目標(biāo)區(qū)域中開發(fā)序列缺失或插入位點(InDel),由Primer Premier 5.0設(shè)計引物。用多態(tài)性的InDel標(biāo)記分析94個F2代突變單株,進一步精細定位dl-7。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變性狀及其影響

水稻株系dl-7在抽穗期的劍葉完全沒有形成中脈,倒二葉、倒三葉和倒四葉的中脈以葉柄為起點,僅分別延伸到葉片1/4、1/2和1/2長度的位置。因此,dl-7各葉位上葉片表現(xiàn)出不同程度的披垂,導(dǎo)致整個植株葉片披散(圖1A)。劍葉由于缺少中脈的支撐,呈現(xiàn)翻轉(zhuǎn)180°～270°的狀態(tài)(圖1B)。20個突變體單株的所有穎花發(fā)育正常,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,沒有受到突變的影響(圖1C)?？疾炝?0個突變體單株的農(nóng)藝性狀,平均結(jié)實率為80.5%±1.7%,野生型對照為81.2%±1.9%,兩者之間沒有顯著差異。

A.植株形態(tài);B.劍葉形態(tài);C.穎花結(jié)構(gòu)。圖1 dl-7的突變表型和穎花結(jié)構(gòu)

從水稻葉片橫切面可以看到,野生型對照的中脈顯微結(jié)構(gòu)中具有透明細胞(CC)、中央大維管束(CLV)和近軸端小維管束(ASV),以及葉肉細胞和薄壁細胞(圖2A)。透明細胞是葉片中央?yún)^(qū)域的細胞大量增殖后,再經(jīng)過細胞程序性死亡形成的空腔,成為中脈的主要結(jié)構(gòu)特征。突變體葉片在中脈位置上形成的葉脈(突變體中脈)沒有透明細胞,其形態(tài)和結(jié)構(gòu)與側(cè)脈類似(圖2B)。將圖2B中虛線框部分放大觀察發(fā)現(xiàn),突變體中脈除了沒有透明細胞外,還缺少了近軸端小維管束,而中央大維管束正常存在(圖2C)。突變體中脈的結(jié)構(gòu)與側(cè)脈類似,細微的差別體現(xiàn)在向近軸端凸起的高度不同,原因在于中脈中央大維管束上方的大型薄壁細胞(LPC)堆積了5～6層,而側(cè)脈僅有2～3層(圖2D)。

2.2 突變表型的遺傳特性

dl-7與3個父本雜交獲得的F1代植株都能形成正常的中葉脈,與野生型一致,表明突變性狀受隱形基因控制。3個F2代群體都能分離出正常單株和突變單株,此外還出現(xiàn)了一種共顯性單株。共顯性單株的部分分蘗為突變型,其余分蘗為野生型；大部分共顯性單株的突變型分蘗多于野生型分蘗。共顯性單株的表型不同于F1代,因此在統(tǒng)計遺傳分離比時將其歸為突變單株。3個F2代群體中的正常單株和突變單株數(shù)比例符合3∶1,表明突變性狀由1對隱形基因控制(表1)。

表1 突變表型在F2代群體中的分離

2.3 突變基因的精細定位

均勻分布于12條染色體的512個SSR標(biāo)記中,在兩個親本之間表現(xiàn)出多態(tài)性的標(biāo)記有110個,多態(tài)性頻率為21.5%。用這110個多態(tài)性SSR標(biāo)記對30個F2代單株進行檢測,發(fā)現(xiàn)RM3392和RM1256兩個標(biāo)記與突變性狀之間存在明顯的連鎖關(guān)系。RM3392和RM1256都位于水稻3號染色體的短臂上；根據(jù)交換單株的信息確定突變基因dl-7與這兩個標(biāo)記之間的遺傳距離分別為6.7 cM和5.0 cM。

為了精細定位突變基因,在RM3392和RM1256之間的區(qū)段內(nèi)開發(fā)了17個具有多態(tài)性的InDel標(biāo)記。通過對94個F2代突變單株的檢測,最終將dl-7定位在I3-14和I3-16之間280 kb的區(qū)域內(nèi),該區(qū)域涵蓋了PAC克隆AC134241、AC135158和AC105732的區(qū)段(圖3)。

A:野生型中脈(50×);B:突變體中脈(50×);C:突變體中脈(200×);D:突變體側(cè)脈(200×)。 ASV:近軸端小維管束;CC:透明細胞;CLV:中央大維管束;LPC:大型薄壁細胞。圖2 水稻葉片的橫切面顯微結(jié)構(gòu)

圖3 突變基因dl-7的精細定位結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前國內(nèi)外報道了多個中葉脈缺失引起葉片披垂的水稻突變體,它們大多表現(xiàn)為中葉脈完全缺失,葉片嚴(yán)重披垂,并對穎花發(fā)育造成不同程度的影響。這些突變大多是由單個隱性基因控制的,突變基因被定位在3號或1號染色體上[7-12]。本研究中的水稻突變體與已報道的突變體不完全相同,具有自身的特點,在突變表型和遺傳特性上都有體現(xiàn),因此將其命名為dl-7。

dl-7僅有劍葉完全沒有形成中脈,出現(xiàn)嚴(yán)重披垂和翻轉(zhuǎn)的特征。倒二葉至倒四葉的中脈都有不同長度的延伸,僅表現(xiàn)出一定程度的披垂,這與羅瓊等報道的整株葉片完全披垂的突變體dl(t)有所不同[7]。在葉片顯微結(jié)構(gòu)上,突變體dl-7的中央葉脈和側(cè)脈結(jié)構(gòu)類似,但是由于中央大維管束上方的大型薄壁細胞堆積層數(shù)有差異,使得兩者向近軸端凸起的高度不同。而在Wang等報道的dl-6突變體中,中央葉脈和側(cè)脈的結(jié)構(gòu)是完全相似的[10]。這些表型特征說明dl-7的中葉脈發(fā)育過程并沒有被完全阻斷,只是在時間或空間上受到了抑制。

dl-7的穎花結(jié)構(gòu)正常,結(jié)實率相比于野生型沒有顯著差異,表明突變沒有對花器官的發(fā)育產(chǎn)生影響。dl-7最重要的特點在于F2代群體中分離出了一種突變型分蘗和野生型分蘗共存的共顯性單株,這一現(xiàn)象在之前的突變體中未見報道。結(jié)合上述兩個特征,我們認(rèn)為dl-7是該類型中突變效應(yīng)最弱的突變體。

突變基因dl-7是隱性基因,被定位在3號染色體短臂上的280 kb區(qū)段內(nèi),與多個文獻報道的結(jié)果[7-11]一致。這個區(qū)段內(nèi)包含一個YABBY基因,它的變異已經(jīng)被證明能引起水稻中葉脈的缺失[5,10-11]。據(jù)此,我們推測這個YABBY基因是dl-7的候選基因,dl-7是這個YABBY基因的一個新的等位突變體。突變可能沒有導(dǎo)致YABBY基因功能完全喪失,只是改變了表達量或表達調(diào)控模式,因此僅產(chǎn)生了較弱的突變效應(yīng)。有關(guān)dl-7發(fā)生突變的具體位點和類型,以及對基因功能的影響,還有待后續(xù)進一步研究。