任鶴菲，于昕儀，陳立軍，張馨予，雷 靜，陳 健，于利人

不同訓(xùn)練負(fù)荷下，骨骼肌的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生明顯的變化，肌原纖維和三聯(lián)體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的改變，影響收縮和能量供應(yīng)系統(tǒng)[1]。骨骼肌供能主要依靠線粒體呼吸鏈，線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的表達(dá)水平與線粒體呼吸及能量代謝功能密切相關(guān)[2]。骨骼肌供能的同時(shí)產(chǎn)生超氧化產(chǎn)物，線粒體超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)可及時(shí)清除超氧化產(chǎn)物并修復(fù)細(xì)胞損害[3, 4]。如何科學(xué)訓(xùn)練才能保護(hù)骨骼肌結(jié)構(gòu)，最大限度發(fā)揮線粒體功能需要進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)檢測4周訓(xùn)練后大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)及線粒體功能的變化，探討訓(xùn)練對骨骼肌結(jié)構(gòu)和能量代謝的影響及保護(hù)機(jī)制，為科學(xué)訓(xùn)練提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級雄性SD大鼠24只，鼠齡2個(gè)月，體質(zhì)量(214±11) g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，許可證號SCXK2002-0001，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在21～25 ℃，濕度范圍40%～60%，照明按自然晝夜供給，進(jìn)食和飲水自由。本實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物的處理方法符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 訓(xùn)練模型的建立 實(shí)驗(yàn)大鼠先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后隨機(jī)分為正常對照組、有氧訓(xùn)練組和無氧訓(xùn)練組，每組8只，組間動(dòng)物體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行3 d適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練(坡度為0°，速度8.2 m/min，10 min/d)后，實(shí)驗(yàn)參照Bedford等[5]的方法建立動(dòng)物模型。參考Shepherd等[6, 7]的方法確定訓(xùn)練強(qiáng)度和分組：訓(xùn)練強(qiáng)度在64%～76%最大攝氧量(maximal oxygen uptake, VO2max)確定為有氧訓(xùn)練組，訓(xùn)練強(qiáng)度>80% VO2max確定為無氧訓(xùn)練組。有氧訓(xùn)練組采用遞增負(fù)荷訓(xùn)練，以15 m/min為起始速度，速度逐漸增快，第5分鐘增至18 m/min，第10分鐘增至20 m/min并保持恒定不變，同時(shí)增加坡度至5°，計(jì)時(shí)60 min。無氧訓(xùn)練組以50 m/min為起始速度，訓(xùn)練6 min后休息5 min，此過程重復(fù)3次。兩組在訓(xùn)練過程中始終保證訓(xùn)練強(qiáng)度恒定。訓(xùn)練4周，每周保證在同一時(shí)間段開展訓(xùn)練，時(shí)間每周不少于6 d。對照組大鼠于籠內(nèi)正常生活，不做任何額外處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織勻漿的制備 大鼠訓(xùn)練后立刻處死，迅速取其腓腸肌，用介質(zhì)Ⅰ(0.12 M KCl，20 mM Hepes，5 mM MgCl2，1 mM EDTA，5 mg defatted BSA/ml pH 7.4)沖洗，剔除脂肪及結(jié)締組織并剪碎，加10 ml介質(zhì)Ⅰ。電動(dòng)勻漿器勻漿，1200 r/min，上下3次。600 r/min離心10 min。棄沉淀，上清液于17 000 r/min離心10 min。沉淀用介質(zhì)Ⅰ懸浮，7000 r/min離心10 min。沉淀懸浮在20 ml介質(zhì)Ⅱ(0.3M Sucrose，2.0mM Hepes，0.1 mM EDTA，2 mg defatted BSA/ml pH 7.4)中，3500 r/min離心10 min。沉淀懸浮于0.3 ml介質(zhì)Ⅱ中。以上操作均在0～4 ℃下進(jìn)行。線粒體蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測定，采用可見-紫外分光光度計(jì)280 nm下校正的BSA作標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性的測定 參照上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司試劑盒說明書測定。分光光度法分別在340 nm(酶復(fù)合體Ⅰ)、600 nm(酶復(fù)合體Ⅱ)和550 nm(酶復(fù)合體Ⅲ和Ⅳ)處測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用Folin-酚法測定各組線粒體蛋白濃度。計(jì)算公式：復(fù)合體酶比活性=[(△A樣品-△A背景)×樣品稀釋倍數(shù)]/[0.1(樣品質(zhì)量，mg)×吸光系數(shù)×1(反應(yīng)時(shí)間，min)]/線粒體蛋白濃度(mg/ml)。

1.3.3 總超氧化物歧化酶、錳超氧化物歧化酶和銅鋅超氧化物歧化酶活性的測定 采用比色法測定總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, Mn-SOD)和銅鋅超氧化物歧化酶(copper zincsuperoxide dismutase, CuZn-SOD)活性，試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.3.4 透射電鏡觀察骨骼肌線粒體的超微結(jié)構(gòu) 大鼠處死后迅速取腓腸肌，取1 mm2的骨骼肌組織用2.5%戊二醛孵育過夜。1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水后氧化丙烯浸透，環(huán)氧樹脂包埋，包埋好的樣品制成超薄切片，醋酸鉛鈾雙重染色，進(jìn)行電鏡樣品制備。Philips EM400ST透射電鏡觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)，采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1 不同訓(xùn)練條件下骨骼肌形態(tài)及線粒體分布 在正常對照組中，肌漿內(nèi)含大量與細(xì)胞長軸平行排列的肌原纖維，相鄰肌原纖維間可見線粒體，每條肌原纖維上有明暗相間的帶(圖1A)。肌原纖維由大量平行排列的粗、細(xì)肌絲組成，可見粗、細(xì)肌絲橫斷面；肌膜下的肌漿中可見電子密度較高的線粒體(圖1B)。在有氧訓(xùn)練組中，與正常對照組相比，肌原纖維排列更加規(guī)則，肌原纖維增粗，肌漿網(wǎng)、橫小管發(fā)達(dá)，構(gòu)成明顯的三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，線粒體數(shù)量增多(圖1C、D)。在無氧訓(xùn)練組中，與正常對照組相比，肌漿中，肌原纖維之間可見大量發(fā)生腫脹的線粒體，電子密度較正常染色體低；肌原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，明帶與暗帶界線不清，明帶中Z線不明顯，暗帶中H帶與M線不明顯，提示粗細(xì)肌絲排列紊亂(圖1E、F)。

圖1 不同訓(xùn)練負(fù)荷下大鼠骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)透射電鏡特點(diǎn)

A.正常對照組骨骼肌縱切面，Bar=0.5 μm；B.正常對照組骨骼肌橫切面，Bar=0.5 μm；C.有氧訓(xùn)練組骨骼肌縱切面，Bar=1 μm；D.有氧訓(xùn)練組骨骼肌縱切面，Bar=0.5 μm；E.無氧訓(xùn)練組為骨骼肌縱切面，Bar=1 μm；F.無氧訓(xùn)練組為骨骼肌縱切面，Bar=0.5 μm

2.2 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性變化 訓(xùn)練4周后，有氧訓(xùn)練組大鼠線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性水平均高于正常對照組和無氧訓(xùn)練組，無氧訓(xùn)練組大鼠線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性水平較正常對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3 T-SOD，Mn-SOD和CuZn-SOD活性測定 訓(xùn)練4周后，有氧訓(xùn)練組大鼠線粒體T-SOD、CuZn-SOD和Mn-SOD水平高于正常對照組和無氧訓(xùn)練組，無氧訓(xùn)練組大鼠線粒體T-SOD、Mn-SOD水平較正常對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。CuZn-SOD活性與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 大鼠線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性

酶復(fù)合體正常對照組有氧訓(xùn)練組無氧訓(xùn)練組Ⅰ5.99±0.126.81±0.39①5.43±0.10①②Ⅱ2.34±0.162.69±0.09①1.92±0.08①②Ⅲ4.29±0.054.66±0.08①4.13±0.24①②Ⅳ6.82±0.119.25±0.21①6.19±0.19①②

注：與正常對照組相比，①P<0.05；與有氧訓(xùn)練組相比，②P<0.05

表2 T-SOD, Mn-SOD和CuZn-SOD活性

酶正常對照組有氧訓(xùn)練組無氧訓(xùn)練組T-SOD22.92±1.2139.41±2.91①16.96±1.29①②CuZn-SOD3.73±1.246.71±0.77①2.68±0.61②Mn-SOD19.19±0.9732.7±3.20①14.28±1.12①②

注：與正常對照組相比，①P<0.05；與有氧訓(xùn)練組相比，②P<0.05

3 討 論

不同訓(xùn)練負(fù)荷可以誘發(fā)骨骼肌發(fā)生相應(yīng)的適應(yīng)性改變，無氧訓(xùn)練超過機(jī)體承受能力會(huì)導(dǎo)致骨骼肌產(chǎn)生暫時(shí)性的生理機(jī)能減退現(xiàn)象，即會(huì)發(fā)生訓(xùn)練疲勞。本實(shí)驗(yàn)中，電鏡下觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同程度的變化，有氧訓(xùn)練組大鼠骨骼肌肌原纖維排列更加規(guī)則，三聯(lián)體結(jié)構(gòu)明顯。無氧訓(xùn)練組大鼠骨骼肌肌漿中，電子密度較正常染色體低，粗細(xì)肌絲排列紊亂，超微電鏡結(jié)果顯示，有氧訓(xùn)練可加強(qiáng)骨骼肌收縮能力，提高應(yīng)激狀態(tài)下骨骼肌能量供應(yīng)，無氧訓(xùn)練則導(dǎo)致骨骼肌損傷。

不同訓(xùn)練負(fù)荷可誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)性疲勞，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的失調(diào)是運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生的重要潛在因素。高強(qiáng)度氧化應(yīng)激可使線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔道(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)更易于開放，線粒體膜電位的缺失及mPTP的開放進(jìn)一步誘導(dǎo)線粒體腫脹，進(jìn)而影響骨骼肌的結(jié)構(gòu)。線粒體反向電子傳遞理論指出，在應(yīng)激缺氧狀態(tài)下，大量電子在復(fù)合體Ⅱ處聚集無法向下傳遞，而當(dāng)無氧訓(xùn)練終止時(shí)，大量氧氣致使游離電子涌向復(fù)合體Ⅰ，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生，誘發(fā)機(jī)體損傷[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4周有氧訓(xùn)練后大鼠骨骼肌線粒體數(shù)量增多，線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性顯著增強(qiáng)，這可能與持續(xù)性的有氧訓(xùn)練使得骨骼肌增加對能源物質(zhì)的需求有關(guān)。無氧訓(xùn)練組線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性低于正常對照組和有氧訓(xùn)練組，肌原纖維之間可見大量發(fā)生腫脹的線粒體，這可能是因?yàn)闊o氧訓(xùn)練損傷了線粒體呼吸鏈，使得電子傳遞發(fā)生障礙。

不同訓(xùn)練負(fù)荷下機(jī)體可產(chǎn)生如氧自由基等訓(xùn)練副產(chǎn)物，自由基的細(xì)胞毒作用可引起膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[9]。自由基如不能得到及時(shí)有效的清除將導(dǎo)致機(jī)體氧化與抗氧化功能平衡的失調(diào), 破壞組織細(xì)胞，影響生物體行為訓(xùn)練能力及機(jī)體正常的氧化代謝功能[10, 11]。正常機(jī)體內(nèi)存在以SOD為代表的自由基清除體系，其活力可以反映機(jī)體清除自由基的能力[12]。SOD以錳或銅和鋅等作為輔因子，兩者均是自由基的清除酶，是維持細(xì)胞正常代謝和生長必不可少的抗氧化物質(zhì)[13]。過氧化氫是一類自由基，無氧訓(xùn)練可引起小鼠腓腸肌線粒體過氧化氫含量明顯增加[14]。Mn-SOD基因的啟動(dòng)子通過與過氧化氫相結(jié)合，使得Mn-SOD基因轉(zhuǎn)錄水平顯著提高[15]，有利于提高自由基的清除能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有氧訓(xùn)練組T-SOD、Mn-SOD和CuZn-SOD水平均高于正常對照組和無氧訓(xùn)練組。說明有氧訓(xùn)練提高能量代謝能力顯著高于無氧訓(xùn)練，能通過進(jìn)一步提高SOD的表達(dá)水平，增加超氧陰離子自由基的清除，使得抗氧化能力得到了增強(qiáng)。高強(qiáng)度的無氧訓(xùn)練由于線粒體呼吸鏈電子傳遞發(fā)生障礙，還原型輔酶Ⅰ得不到氧化而堆積，導(dǎo)致氧自由基生成增加，破壞了機(jī)體氧化與抗氧化功能的平衡，進(jìn)而影響線粒體的呼吸及氧化代謝功能。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無氧訓(xùn)練并不能顯著降低CuZn-SOD水平，原因可能是因?yàn)闊o氧運(yùn)動(dòng)主要影響線粒體，而CuZn-SOD主要存在于胞漿中，受影響變化不明顯。

綜上所述，不同訓(xùn)練負(fù)荷對骨骼肌超微結(jié)構(gòu)和線粒體功能影響不同，其機(jī)制復(fù)雜，對其進(jìn)行深入的研究具有重要意義。有氧訓(xùn)練可以改善骨骼肌的能量代謝及抗氧化功能，增加細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量及相關(guān)代謝酶活性，從而改善骨骼肌形態(tài)，提高機(jī)體抗疲勞能力，這與線粒體能量代謝及SOD等抗氧化功能密切相關(guān)。但對不同訓(xùn)練負(fù)荷引起骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能改變的機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。