郭彩娥阮沛樺胡欣鄧紅楊小催周?chē)?guó)彥甘國(guó)興黃治

（1.清遠(yuǎn)市中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 清遠(yuǎn)511500； 2.廣東藥科大學(xué)廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006； 3.廣東藥科大學(xué)廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006）

鮮藥是指未經(jīng)任何可能導(dǎo)致藥材成分改變或損失的手段加工處理的“原生藥材”，在藥材采收及粗加工后即可使用的中藥原料。 鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是一種名貴的中草藥，又名鐵皮斗、黑節(jié)草等，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物的全草，其獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境和保健功效，使之有“救命仙草”的美譽(yù)［1］。 中醫(yī)在用鐵皮石斛時(shí)，常要求以鐵皮石斛鮮品入藥，鮮藥的藥理研究表明，其與干品的藥理作用具有差異，鮮石斛性寒，其寒涼之性強(qiáng)于干品，所以石斛鮮品對(duì)熱證的治療效果優(yōu)于石斛干品［2-4］。

清遠(yuǎn)市中醫(yī)院、清遠(yuǎn)市鮮藥制劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心聯(lián)合廣東藥科大學(xué)根據(jù)臨床用藥需要，選取鮮鐵皮石斛為研究對(duì)象，以鮮藥材投料，研制成顆粒劑，使之完全保留鮮藥的特色，并解決鮮藥的保鮮問(wèn)題。 多糖為鐵皮石斛的主要生物活性成分［5-6］，2015 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定鐵皮石斛的總多糖按干燥品計(jì)算，不得少于25.0%。 多糖有淀粉性多糖和非淀粉性多糖之分，糊精、淀粉屬淀粉性多糖，非淀粉性多糖是指淀粉以外的多糖。 申瑞玲等［7］采用酶-熱水浸提法對(duì)藜麥麩水溶性非淀粉性多糖進(jìn)行提取，效果良好，其中使用的酶為耐熱-α-淀粉酶和糖化酶，本研究參考該方法，采用糖化酶酶解法消除輔料對(duì)鐵皮石斛多糖測(cè)定的影響。 除多糖外，有研究表明，黃酮類(lèi)成分也為鐵皮石斛另一活性成分，有較強(qiáng)的抗氧化活性［8-9］，但黃酮類(lèi)成分的鑒別等指標(biāo)并未納入2015 年版《中國(guó)藥典》。 因此，本研究建立了鮮鐵皮石斛顆粒的薄層鑒別方法，同時(shí)采用UPLC-PDA 法建立鮮顆粒特征圖譜，制定較為完善的鮮鐵皮石斛顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，擬為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AcQuity UPLC（配置PDA，美國(guó)Waters 公司）；BSA224S-CW 型電子分析天平（賽多利斯儀器北京有限公司，感量：0.1 mg）；CP2250 型電子分析天平（賽多利斯儀器北京有限公司，感量：0.01 mg）；ZF-90 性暗箱式紫外透射儀（上海顧村電光儀器廠）；UV-1800 紫外-可見(jiàn)分光光度儀（日本島津公司）；HK3300H 超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；HWS-26 電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；TGL-20B 飛鴿牌離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A 旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥

鮮鐵皮石斛顆粒（自制，批號(hào)分別為S1：180618；S2：180626-1；S3：180626-2；S4：180626-3；S5：180626-4；S6：180628；S7：180912；S8：190314-1；S9：190314-2；S10：190314-3；除批號(hào)S2、S3、S7 所用石斛藥材產(chǎn)地為廣東外，其余批號(hào)的產(chǎn)地均為云南）；芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.9%，批號(hào)：F0940192）、異夏佛塔苷對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.7%，批號(hào)：F0930336）、夏佛塔苷對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.31%，批號(hào)：F0850146）均購(gòu)自中山市成諾生物科技有限公司；葡萄糖（批號(hào)：110833-201506，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；糖化酶（批號(hào)：17122410，10 萬(wàn)U／mL，上海士峰生物科技有限公司）；乙腈、甲醇、四氫呋喃、磷酸為色譜純；其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別［10］

2.1.1 供試品溶液的制備取鮮鐵皮石斛顆粒3 g，用二氯甲烷-甲醇（體積比9 ∶1）振搖提取2 次，每次40 mL，濾過(guò)，合并濾液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備取石斛對(duì)照藥材0.2 g，加二氯甲烷-甲醇（體積比9 ∶1）15 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例制備石斛陰性樣品，照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 薄層色譜條件薄層板：20 cm×10 cm 硅膠G 薄層板；點(diǎn)樣量：供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液各5 μL；展開(kāi)劑：甲苯-甲酸乙酯-甲酸（體積比9 ∶5 ∶1）；顯色及檢視：噴以10%硫酸乙醇試液，在95 ℃烘約3 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。 結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件AcQuity UPLC HSS T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；體積流量：0.3 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：337 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：四氫呋喃-乙腈-甲醇（10 ∶22 ∶5）為流動(dòng)相A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%磷酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0 ～9 min，9%→10%A；9 ～10 min，10%→11%A；10 ～12 min，11%→11.5%A；12 ～13 min，11.5%→14.5%A；13～20 min，14.5%→15%A；20 ～25 min，15%A；25～30 min，15%→38%A；30～32 min，38%→9%A）。

圖1 薄層色譜鑒別圖Figure 1 TLC chromatograms

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品溶液的制備精密稱(chēng)取鮮鐵皮石斛顆粒（批次180626-1）粉末1.5 g，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%（體積分?jǐn)?shù)，下同） 甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理45 min（頻率53 kHz，功率350 W），放冷，70%甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，濾過(guò)，取濾液25 mL 于蒸發(fā)皿蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解移至5 mL 量瓶，并稀釋至刻度，即得。

2.2.2.2 混合對(duì)照品溶液取芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷、夏佛塔苷、異夏佛塔苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL 約含各對(duì)照品10 μg 的溶液。

2.2.3 共有峰匹配和已知峰的指認(rèn)精密吸取混合對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄特征圖譜，并按國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”（2012A 版）進(jìn)行共有峰匹配，結(jié)果10 批樣品共匹配出6 個(gè)共有峰；經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器對(duì)6 個(gè)共有峰的光譜掃描分析（220～380 nm），所代表的成分可定性為黃酮類(lèi)物質(zhì)，各成分的吸收峰見(jiàn)表1。 其中，峰1 為芹菜素-6，8-二-c-葡萄苷，峰3 為夏佛塔苷，峰5 為異夏佛塔苷；峰1 分離度較好，確認(rèn)以峰1 為參比峰（見(jiàn)圖2、圖3）。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液（批號(hào)：180626-1），在0、2、4、8、12 h 分別依法進(jìn)樣，記錄共有峰的峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值分別為1.24%～2.03%、0.45%～0.57%，表明供試品溶液在室溫下12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 6 個(gè)共有峰的紫外吸收波長(zhǎng)Table 1 UV absorption wavelengths of six common peaks

圖2 鮮鐵皮石斛顆粒UPLC 圖譜Figure 2 UPLC chromatograms of fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules

圖3 鮮鐵皮石斛顆粒的特征圖譜Figure 3 Characteristics chromatograms of fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules

2.2.5 精密度試驗(yàn)取供試品溶液（批號(hào)：180626-1），連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄共有峰的峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值分別為2.12%～3.07%和0.31%～0.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同批號(hào)顆粒（批號(hào)：180626-1），制備6 份供試品溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算各已知峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值為0.35% ～1.26%；并采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A 版》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)其相關(guān)系數(shù)＞0.995，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 特征圖譜的建立精密吸取各批次供試品溶液5 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰1 為參照峰，計(jì)算各特征圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2。 可見(jiàn)，特征峰1～6 號(hào)與S 峰（峰1）的相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值為1.000（峰1）、1.261（峰2）、1.309（峰3）、1.396（峰4）、1.536（峰5）、1.688（峰6），各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值的±3%之內(nèi)。

表2 鮮鐵皮石斛顆粒共有峰相對(duì)保留時(shí)間Table 2 The common peak relative retention time of fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules

2.3 非淀粉性多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

2.3.1 輔料對(duì)多糖測(cè)定的影響分別稱(chēng)取鮮鐵皮石斛顆粒約1.5 g，處方量的輔料（糊精∶淀粉＝2 ∶1，質(zhì)量比）適量，精密稱(chēng)定，按《中國(guó)藥典》鐵皮石斛多糖含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描（350 ～600 nm），記錄光譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。 可見(jiàn)，輔料在488 nm 處有吸收，輔料對(duì)鮮鐵皮石斛顆粒劑的多糖測(cè)定有干擾。

2.3.2 糖化酶水解條件的考察糖化酶可特異性水解糊精、淀粉的糖苷鍵從而使它們降解為葡萄糖，參考文獻(xiàn)［11］選取54 ℃作為酶解溫度，考察糖化酶的加入量、酶解時(shí)間對(duì)消除輔料干擾的影響。

2.3.2.1 酶加入量稱(chēng)取輔料適量（約相當(dāng)于1.5 g顆粒的輔料量）6 份，精密稱(chēng)定，分別置于100 mL 量瓶中，加入水50 mL，沸水加熱至輔料分散均勻，冷卻至室溫后，分別加入1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、8.0 mL（1 萬(wàn)U／mL）糖化酶溶液，54 ℃保溫至樣品溶液與碘試劑反應(yīng)不變藍(lán)。 冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻。 精密量取續(xù)濾液2 mL，置于15 mL 離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r／min）20 min，棄去上清液，沉淀加體積分?jǐn)?shù)80%乙醇洗滌2 次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。 精密量取上述溶液1 mL，按《中國(guó)藥典》鐵皮石斛多糖含量測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定法顯色，在488 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，糖化酶溶液加入量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 輔料對(duì)鮮鐵皮石斛顆粒多糖測(cè)定的影響的UV 光譜圖Figure 4 UV spectrogram of the effect of excipients on the determination of polysaccharide content

2.3.2.2 酶解時(shí)間稱(chēng)取輔料適量（約相當(dāng)于1.5 g顆粒的輔料量）5 份，精密稱(chēng)定，分別置于100 mL 量瓶中，加入水50 mL，沸水中加熱至輔料分散均勻。 冷卻至室溫，加入1.5 mL 糖化酶溶液，54 ℃條件下分別保溫10、30、60、90、120 min。 冷卻，加水稀釋至刻度，搖勻。 按“2.3.2.1”項(xiàng)下自“精密量取續(xù)濾液2 mL，置于15 mL離心管中”同法操作，以吸光度為縱坐標(biāo)，酶解時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。

可見(jiàn)，當(dāng)酶解溫度為54 ℃、酶加入量為1.5 mL、酶解時(shí)間為60 min 時(shí)，可消除輔料糊精、淀粉對(duì)測(cè)定鮮鐵皮石斛顆粒中非淀粉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的干擾。

2.3.3 溶液的制備

2.3.3.1 供試品溶液的制備取鮮鐵皮石斛顆粒，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱(chēng)定，置100 mL 量瓶中，加50 mL 水，于沸水浴中使溶解，冷卻至54 ℃下，加10%糖化酶溶液1.5 mL，加塞，于54 ℃保溫1 h，加熱煮沸5 min，冷卻，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液2 mL，置于15 mL 離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r／min）20 min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌2 次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。 備用。

圖5 酶加入量的考察Figure 5 Investigation of the amount of enzyme added

圖6 酶解時(shí)間的考察Figure 6 Investigation of enzymatic hydrolysis time

2.3.3.2 對(duì)照品溶液的制備取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品9.06 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成90.6 μg／mL 的葡萄糖對(duì)照品溶液，備用。

2.3.3.3 陰性溶液的制備按處方量取輔料適量，精密稱(chēng)定，其余操作同“2.3.3.1”項(xiàng)方法，即得。

2.3.4 專(zhuān)屬性的考察精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性溶液各1 mL，按苯酚硫酸法測(cè)定，精密加入5%苯酚溶液1 mL（臨用配制），搖勻，再精密加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)溶劑為空白，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖7。 可見(jiàn)，陰性對(duì)照不干擾測(cè)定，供試品溶液、對(duì)照品溶液在488 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收。

2.3.5 線性關(guān)系精密量取“2.3.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.7、1.0 mL 于10 mL 具塞試管中，各加水補(bǔ)至1.0 mL，其余步驟按“2.3.4”項(xiàng)下方法，以相應(yīng)溶劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在488 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝10．928X- 0．010 3（r＝0.998 4），說(shuō)明D-無(wú)水葡萄糖在18.12 ～90.6 μg／mL 范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

圖7 專(zhuān)屬性試驗(yàn)光譜圖Figure 7 Spectrogram of specificity test

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取“2.3.3.1”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，按“2.3.4”項(xiàng)下方法顯色后，于0、1、2、3、4 h 測(cè)定吸光度值，測(cè)得供試品溶液吸光度RSD 為0.33%，表明供試品溶液在4 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.3.3.1”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，按“2.3.4”項(xiàng)方法顯色，依法連續(xù)測(cè)定6 次，測(cè)得6 次吸光度值RSD 為0.00%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取石斛顆粒（批次180626-1）6 份，按“2.3.3.1”項(xiàng)方法制備溶液，按“2.3.4”項(xiàng)方法顯色后測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得6 份樣品平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.17%，RSD 為3.10%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量的鮮鐵皮石斛顆粒（批次180626-1）6 份，按“2.3.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液0.5 mL，置于比色管中，加入0.5 mL 已知含量的葡萄糖對(duì)照品溶液（約0.063 4 mg／mL），按“2.3.4”項(xiàng)方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。 可見(jiàn)，平均加樣回收率為99.78%，RSD 值為2.38%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.10 鮮鐵皮石斛顆粒中非淀粉性多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)取不同批次的鮮鐵皮石斛顆粒，按“2.3.3.1”項(xiàng)下方法制備溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，通過(guò)回歸方程計(jì)算供試品溶液中非淀粉性多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of sample recovery test（n＝6）

表4 10 批鮮鐵皮石斛顆粒中非淀粉性多糖的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination of non-starch polysaccharides in fresh Dendrobium officinale Kimura et Migo granules（n＝3）w／%

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

本文參考《中國(guó)藥典》方法建立了顆粒劑的薄層鑒別方法，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾。

3.2 特征圖譜的建立

鐵皮石斛中的活性成分主要為多糖、黃酮苷類(lèi)成分，本研究初步建立了10 批鐵皮石斛顆粒的特征圖譜，標(biāo)出6 個(gè)共有特征峰，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器對(duì)共有峰的光譜掃描分析，所代表的成分可定性為黃酮類(lèi)物質(zhì)，特征圖譜的建立能更全面反映制劑的質(zhì)量。

3.3 非淀粉性多糖的測(cè)定

鐵皮石斛多糖由非淀粉性多糖、淀粉性多糖、蛋白和灰分等組成，其中非淀粉性多糖占比78.21%［12］，是多糖的主要組成部分，《中國(guó)藥典》采用的是苯酚硫酸法來(lái)測(cè)定鐵皮石斛總多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 鮮鐵皮石斛顆粒成型過(guò)程中加入了輔料淀粉、糊精，兩者均屬淀粉性多糖，經(jīng)濃硫酸水解后產(chǎn)生單糖，會(huì)與苯酚反應(yīng)從而影響多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的準(zhǔn)確性，因此，本文采用酶解法消除輔料對(duì)多糖測(cè)定影響的方法。 其作用原理是糖化酶能從淀粉、糊精等淀粉性多糖物質(zhì)碳鏈上的非還原性末端逐漸水解α-1，4 糖苷鍵，最后水解為葡萄糖，在80%乙醇沉淀過(guò)程中與非淀粉性多糖分離，可達(dá)到去除淀粉性多糖雜質(zhì)的目的。由于本法使用的對(duì)照品為葡萄糖，在加樣回收試驗(yàn)中如果在第一步酶解試驗(yàn)中加入對(duì)照品，對(duì)照品會(huì)溶于80%乙醇造成損失，所以只能在第二步（硫酸水解-苯酚顯色）加入以考察檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

本研究方法可同時(shí)應(yīng)用于原藥材鐵皮石斛非淀粉多糖的測(cè)定，經(jīng)對(duì)投料藥材非淀粉性多糖的測(cè)定，根據(jù)投料量、收得率計(jì)算顆粒的理論含量，10 批顆粒的非淀粉性多糖的轉(zhuǎn)移率分別為93.5%～102.8%，與實(shí)際工藝情況相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性。

目前，常見(jiàn)的除去淀粉等物質(zhì)對(duì)多糖含量測(cè)定影響的方法有AOAC Roberts 銅法、酶解法［13］等。AOAC Roberts 銅法的作用原理是在堿性條件下，銅離子選擇與具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖結(jié)合生成沉淀。與酶解法相比，AOAC Roberts 銅法需要多次洗滌，操作繁瑣，結(jié)果受操作影響較大。

糖化酶是一種大分子量的糖蛋白，其中含有的組分包括葡萄糖、糖醛酸、甘露糖和半乳糖。 本研究對(duì)酶的加入量進(jìn)行了考察，結(jié)果表明糖化酶用量在1.5～2.0 mL（1 萬(wàn)U／mL）時(shí)可消除輔料的干擾，糖化酶加入量過(guò)多，吸光度反而升高，對(duì)測(cè)定的干擾更大。原因可能是過(guò)量的糖化酶在80%乙醇洗滌步驟中無(wú)法完全除去，因此影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 為了減少糖化酶用量對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，糖化酶加入量應(yīng)適度。