鄧奔騰，楊振淮，邱芳華，楊澤填，李東曉

我國有關(guān)癌癥的健康問題日益凸顯，并成為實(shí)現(xiàn)中國醫(yī)療基本保障的重大負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國每年新增160 萬惡性腫瘤病人，因惡性腫瘤而死亡的病人近120萬人［1］。同多數(shù)國家一樣，乳腺癌亦是中國女性最常見的惡性腫瘤［年齡標(biāo)化率（ASR）為21.6例/10 萬女性］，也是中國女性癌癥死亡的第六大原因（ASR 為5.7 例/10 萬女性）；我國乳腺癌女性病人的均齡為45～55 歲，且有年輕化的趨勢(shì)［2］。有鑒于此，乳腺癌早期篩查和診斷的臨床能力亟須提高。對(duì)于乳腺癌的早期篩查和診斷，不僅需要大眾媒體的健康保健宣傳，日常生活中還需增強(qiáng)女性病人有關(guān)乳腺自我查體的防范意識(shí)，但這靠“自摸”遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。臨床上，早期乳腺癌的篩查缺乏腫瘤生化指標(biāo)，常用的影像學(xué)檢查有乳腺鉬靶和高頻彩超，兩者各有其優(yōu)缺點(diǎn)，臨床上常常需聯(lián)合使用來避免漏診［3］。

在近年來對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究中，許多潛在的新蛋白被發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移有關(guān)。人源性多肽（DCD）為其中一種具有天然活性的多肽物質(zhì)，由人類汗液中分離得到［4］。國外研究表明，在肝癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌及其轉(zhuǎn)移等各種腫瘤中，發(fā)現(xiàn)DCD可能作為一種致癌基因蛋白［4-6］。本研究通過檢測(cè)DCD在乳腺癌及其癌周正常組織的表達(dá)，分析其表達(dá)情況與病例資料之間的關(guān)聯(lián)。初步討論DCD作為乳腺癌診斷生物學(xué)標(biāo)志物的可能性，為乳腺癌的早期篩查及診斷提供新的方式。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選用2018 年6 月至2019 年1 月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣州中醫(yī)院乳腺外科行乳腺癌手術(shù)的切除標(biāo)本48例，取各例癌組織及其癌周正常乳腺組織分為兩組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。同時(shí)收集和記錄病人的病例資料，如年齡、絕經(jīng)、臨床分期、腫瘤長徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型及分化程度等。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合診斷：術(shù)中或術(shù)后病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性乳腺癌且為初發(fā)者；（2）病人知情同意。

1.1.2 剔除標(biāo)準(zhǔn) （1）乳腺癌合并其他癌癥者；（2）既往病史中曾行內(nèi)分泌、激素治療或放化療者。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法（WB）檢測(cè) 收集48 例手術(shù)切除標(biāo)本，含癌組織和正常組織標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)步驟如下。

1.2.1 總蛋白的提取 剪取約0.1 g組織樣品，快速放進(jìn)預(yù)冷過的勻漿器中，按1∶10比例加入含苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液，低溫下勻漿直至組織消后將樣品抽到1.5 mL EP 管中，12 000×g相對(duì)離心力（RCF）、4 ℃離心10 min（冷凍高速離心機(jī)，珠海黑馬，型號(hào)TGL-16R），取上清即為所提總蛋白。

1.2.2 總蛋白的保存 將提取的總蛋白加入5×上樣緩沖液（2∶1），升至100 ℃持續(xù)5 min。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 WB 檢測(cè)蛋白的表達(dá) （1）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制作：①將玻璃板與制膠架組裝好，挑選恰宜濃度的分離膠（參考DCD分子量），將四甲基乙二胺（TEMED）添至配置好的分離膠后馬上搖勻、灌膠（留約1.5 cm的高度做濃縮膠），加入400 μL蒸餾水使分離膠面平整成直線，當(dāng)水與膠之間能夠看到一條很明顯的折線時(shí)表明已充分凝固，接著去除膠上層水分即可。②配5%的濃縮膠，添至TEMED 后馬上搖動(dòng)均勻，在剩余空間內(nèi)需要將濃縮膠鋪滿，并將梳子插入其中；濃縮膠凝固后，雙手豎直輕拔出梳子的兩邊，將其放入電泳槽中，放置電泳緩沖液（內(nèi)槽液面需高于膠），用移液器輕輕吹打每個(gè)樣品孔，排出碎膠、雜物等。

（2）電泳：吸取10 μL 樣品緩緩添至樣品孔后，于80 V 下進(jìn)行濃縮膠電泳，當(dāng)指示劑跑到分離膠后，110 V恒壓下指示劑即將跑出時(shí)終止儀器，取下凝膠轉(zhuǎn)膜。

（3）轉(zhuǎn)膜：剪取大小適合的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜和4張濾紙，取前者浸于甲醇中5 min后，與濾紙、海綿共同泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中；于近極端（黑色）轉(zhuǎn)移裝置上依次疊放海綿、兩層濾紙、膠、膜、兩層濾紙、海綿；350 mA 轉(zhuǎn)膜300 min（大分子樣品可適當(dāng)延長時(shí)間）。

（4）孵育抗體：把膜浸在封閉液中，恒溫37 ℃持續(xù)1～2 h；將膜取出后直接放入一抗中，恒溫37 ℃孵育1 h；洗滌液（PBST）洗膜，5 min×4次；將膜轉(zhuǎn)入二抗中，恒溫37 ℃孵育40 min；PBST洗膜，5 min×5次；使用化學(xué)發(fā)光法將膜顯影即可。

經(jīng)上述步驟后，利用Image J 軟件進(jìn)行WB 條帶灰度分析，檢測(cè)樣品灰度值與內(nèi)參比值。

1.3 免疫組織化學(xué)（IHC）染色 收集48 例手術(shù)切除標(biāo)本，包括癌組織及癌周正常組織標(biāo)本。經(jīng)組織切片后脫蠟、抗原修復(fù)、3%過氧化氫室溫濕盒孵育、一抗4 ℃孵育過夜、二抗室溫濕盒30 min、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、封片、顯微鏡觀察及拍照等。

結(jié)果判斷：DCD在癌細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，一般根據(jù)染色強(qiáng)度和廣度進(jìn)行半定量評(píng)分。具體參考HSCORE評(píng)分［7］：即在雙盲下，由兩名病理專業(yè)的醫(yī)師分開對(duì)每張病理切片進(jìn)行評(píng)定。對(duì)顯微鏡照片視野中的腫瘤細(xì)胞分類，分為棕褐色、棕黃色、淡黃色、藍(lán)色四種，分別對(duì)應(yīng)強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性及陰性。醫(yī)師需要人工掃描5 個(gè)高倍鏡視野（×200），由此計(jì)算每視野中各種染色強(qiáng)度的腫瘤細(xì)胞百分比，根據(jù)公式計(jì)算H-score＝∑Pi（i+1），i＝0、1、2、3。將在兩組的組織胞質(zhì)中DCD 的表達(dá)評(píng)分值以中位數(shù)為界限，劃為低表達(dá)組（0～100），高表達(dá)組（≥100～300）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，配對(duì)設(shè)計(jì)計(jì)量資料用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WB 檢測(cè) 與正常組織DCD 表達(dá)（0.641±0.482）相比，WB 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)癌組織中的DCD 表達(dá)（0.886±0.814）明顯上調(diào)（t＝5.330，P＜0.001），具體詳見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法（WB）檢測(cè)人源性多肽（DCD）在乳腺癌癌組織（T）與正常組織（N）中的比較

2.2 IHC檢測(cè) DCD在乳腺癌組織，正常組織中有不同程度的表達(dá)；DCD 在癌組織中35 例高表達(dá)，13例低表達(dá)。而在對(duì)照組48 例正常組織中均為低表達(dá)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝55.082，P＜0.001），見圖2。

2.3 DCD 的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 DCD在乳腺癌組織中的表達(dá)與其病例資料（年齡、絕經(jīng)、臨床分期、腫瘤長徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、分化程度等）之間無明顯關(guān)聯(lián)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如表1。

表1 人源性多肽（DCD）在48例乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病例特征之間的關(guān)系/例

3 討論

本實(shí)驗(yàn)初衷在于使用WB 檢測(cè)、IHC 染色等方法，研究乳腺癌病人的癌組織及正常組織中DCD表達(dá)有無異同，分析其成為乳腺癌篩查及診斷的生物學(xué)標(biāo)志物的可能性，為臨床提高早期乳腺癌篩查和診斷的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與乳腺正常組織相比，在癌組織中通過WB檢查、IHC染色均能有效檢測(cè)出DCD的高表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初步發(fā)現(xiàn)DCD 有望成為乳腺癌臨床診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。在前期本課題組成員邱芳華等［8］在原發(fā)性肝癌并腫瘤轉(zhuǎn)移的病人中發(fā)現(xiàn)血清中DCD 的表達(dá)高于未轉(zhuǎn)移組，而甲胎蛋白的表達(dá)水平與原發(fā)性肝癌是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)聯(lián)，且與單獨(dú)使用血清甲胎蛋白檢測(cè)相比，對(duì)于原發(fā)性肝癌聯(lián)合檢測(cè)DCD及甲胎蛋白的臨床診斷效能更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此我們提出猜想，腫瘤病人血清及癌組織中的DCD可能由癌細(xì)胞本身產(chǎn)生分泌，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程亦可能產(chǎn)生分泌，這不僅僅提示DCD可成為潛在的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物，并有望通過血清學(xué)等臨床方法快速檢測(cè)，補(bǔ)充了乳腺癌早期篩查和診斷依賴影像學(xué)的不足，方便快捷的腫瘤生化檢測(cè)更有利于早期乳腺癌的篩查和診斷，值得臨床推廣使用。

近年來，DCD因其作為一種與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的新蛋白，一直是國外研究的熱點(diǎn)。Brauer HA等［9］在乳腺癌病人中，發(fā)現(xiàn)DCD 表達(dá)水平上調(diào)；Bancovik J等［10］研究人員通過熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)初步證明了乳腺癌組織中的DCD表達(dá)與乳腺癌HER2基因擴(kuò)增相關(guān)，影響其組織分化程度的分級(jí)，并且通過動(dòng)物造模實(shí)驗(yàn)使DCD表達(dá)水平降低，減緩了癌細(xì)胞的繁殖，加快癌細(xì)胞的凋亡程序，使免疫缺陷的動(dòng)物模型減少癌變的可能性，探討了在乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程中DCD可能作出影響的機(jī)制；Stewart GD等［11］在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在缺氧或應(yīng)激等條件下DCD表達(dá)上調(diào)的比缺乏增生抑制因子（PIF）序列的癌細(xì)胞更具生存優(yōu)勢(shì)，說明了DCD 及PIF 的表達(dá)均可能有利于對(duì)癌細(xì)胞的生存及繁殖。

目前，國內(nèi)各大研究所對(duì)于DCD 在癌癥發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程中的研究較少。DCD及其功能、相關(guān)通路的機(jī)制，以及蛇葡萄素、華蟾素等祖國中草藥提取物影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等的研究為本課題組致力鉆研的方向。本課題組前期在肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)中，通過體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)DCD-銜接蛋白（Nck）與肝癌及其侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，明確了DCD-Nck-Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白（WASP）-肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體（Arp2/3）信號(hào)通路的形成，篩選環(huán)狀RNA（circRNA）并明確其對(duì)DCD-Nck 信號(hào)通路的調(diào)控［8，12］。劉麗芳等［13］在研究蛇葡萄素對(duì)DCD-Nck信號(hào)通路的影響中發(fā)現(xiàn)，蛇葡萄素能有效抑制癌細(xì)胞侵襲活力，降低腫瘤基因表達(dá)，從而減緩腸癌、肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。本課題組將在接下來的研究中，利用IHC 染色及WB 檢測(cè)等方法觀察DCD，Nck，神經(jīng)Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白（N-WASP），Arp2/3 這4個(gè)蛋白是否在乳腺癌組織中表達(dá)，試圖研究乳腺癌的發(fā)生，剖析其轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并通過移植性人乳腺癌轉(zhuǎn)移裸鼠的體內(nèi)外研究，嘗試解析華蟾素能否通過DCD信號(hào)通路減緩乳腺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移，并進(jìn)一步揭示華蟾素抗癌及減緩乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為其成為有效的抗腫瘤藥物提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，DCD 在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，因此研究DCD的表達(dá)及其信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用，有助于我們明確乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，提高早期乳腺癌篩查和診斷的臨床能力，提供乳腺癌治療的新關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 人源性多肽（DCD）在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色×200）：A為正常組織；B為癌組織