黃穎鳳，林雪霏，黃歡歡，吳愛(ài)武

（廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東 廣州 510182）

艱難梭菌是產(chǎn)芽孢的革蘭陽(yáng)性桿菌，屬于梭狀芽孢桿菌屬中的專(zhuān)性厭氧菌[1]。艱難梭菌主要的致病因子為毒素A和毒素B，一部分高產(chǎn)毒的艱難梭菌還可以產(chǎn)生二元毒素（Clostridium difficilebinary toxin，Cdt），該毒素由CdtA和CdtB 2個(gè)獨(dú)立的蛋白亞基組成，其中CdtA具有酶活性，CdtB具有結(jié)合能力[2-3]，Cdt具有肌動(dòng)蛋白特異的二磷酸腺苷核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可導(dǎo)致細(xì)胞骨架解聚[4]，產(chǎn)Cdt的菌株可使毒素A表達(dá)量提高到約為普通菌株的16倍，毒素B表達(dá)量提高到約為普通菌株的23倍[5]，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的致病性，導(dǎo)致更高的死亡率。艱難梭菌感染（Clostridium difficileinfection，CDI）主要表現(xiàn)為不同程度的腹瀉和偽膜性腸炎[6]。2003年以來(lái)，北美、歐洲等地區(qū)CDI發(fā)病率和病死率明顯增加，這與曾暴發(fā)流行的RT 027型艱難梭菌以及一小部分RT 078型高產(chǎn)毒CDI有關(guān)[5]。除此之外，暴發(fā)流行的艱難梭菌菌株還有RT 017、RT 018、RT 106、RT 176和RT 244型。2008年，我國(guó)香港首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)毒的RT 027型艱難梭菌菌株[7]，但目前尚未見(jiàn)全國(guó)性CDI流行病學(xué)調(diào)查分析結(jié)果的報(bào)道，因歐洲和北美洲高產(chǎn)毒艱難梭菌菌株暴發(fā)感染的前車(chē)之鑒[8]，分泌Cdt的高產(chǎn)毒艱難梭菌菌株之潛在危害不可小覷。目前，抗菌藥物治療CDI復(fù)發(fā)率高達(dá)20%[9]，為了防止艱難梭菌引起的大規(guī)模CDI暴發(fā)，給易感患者接種艱難梭菌疫苗是最理想的方法，該疫苗接種最適用于計(jì)劃住院治療、需要長(zhǎng)期護(hù)理、入住養(yǎng)老院和需要長(zhǎng)期或高頻率服用抗菌藥物的人群，但經(jīng)過(guò)20多年的研究，目前仍無(wú)被批準(zhǔn)上市的艱難梭菌疫苗[10-11]。本研究以可引起CDI暴發(fā)流行的、能產(chǎn)生Cdt的艱難梭菌為研究重點(diǎn)，對(duì)CdtA的原核表達(dá)及免疫原性進(jìn)行初步探究。

1 材料和方法

1.1 菌種來(lái)源及試劑

pET-28b質(zhì)粒保存菌種及包被96孔板的CdtA（C129-1392）蛋白由廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；艱難梭菌RT 027型菌株DNA由加拿大圭爾夫大學(xué)Scott博士惠贈(zèng)；大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞、小劑量質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、Premix Taq聚合酶等購(gòu)自大連TaKaRa公司；羊抗鼠IgG二抗-HRP購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣arigo公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）曝光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；弗氏完全、不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)驗(yàn)中所用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物合成及基因測(cè)序由上海英濰捷基有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)GenBank上的cdtA基因全長(zhǎng)序列，利用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)引物，并在上下游引物5'端分別添加限制性內(nèi)切酶及其保護(hù)堿基。上游引物為5'-CATGCCATGG GC AAAAAATTTAGGAAACATAAAAGGATT-3'（斜體字母為保護(hù)堿基，下劃線部分為NcoⅠ限制性內(nèi)切酶，加框部分為補(bǔ)齊堿基），下游引物為5'-GCGCAAGCTTAGGTATCAATGTTTGCA TCAACAATTAA-3'（斜體字母為保護(hù)堿基，下劃線部分為HindⅢ限制性內(nèi)切酶）。

1.2.2 PCR擴(kuò)增cdtA全長(zhǎng)序列 以RT 027型艱難梭菌DNA為PCR模板，按大連TaKaRa公司的高保真酶PremixSTAR HS的使用方法設(shè)定PCR循環(huán)條件，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，初步鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 pET-28b-cdtA原核表達(dá)載體的構(gòu)建 純化后的PCR產(chǎn)物與pET-28b載體分別經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后連接，導(dǎo)入大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于kana/LB/X-Gal平板，隨機(jī)挑取23個(gè)白色菌落，分別增菌后用pET-28b載體的通用引物T7和T7ter行菌液PCR，選取陽(yáng)性菌株測(cè)序。

1.2.4 His-CdtA重組蛋白的表達(dá) 取構(gòu)建成功的pET-28b-cdtA表達(dá)菌株大量增菌，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，探索可溶性重組蛋白大量表達(dá)的最佳條件。當(dāng)菌液達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期[600 nm處吸光度（A）值=0.6]時(shí)，搖床溫度分別設(shè)定為25 ℃、30 ℃、37 ℃；異丙基-β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）濃度分別為0、0.5、1.0和1.5 mmol/L，時(shí)間分別為8、10和12 h；同時(shí)設(shè)立pET-28b空載體為陰性對(duì)照，分別收集不同條件下誘導(dǎo)的菌液，1 789×g離心15 min，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，沉淀后置冰盒超聲破碎，4 ℃、13 684×g離心15 min分離蛋白上清和沉淀，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，確定His-CdtA重組蛋白的最佳表達(dá)條件。

1.2.5 His-CdtA重組蛋白的純化及鑒定 用最佳誘導(dǎo)條件大量誘導(dǎo)His-CdtA蛋白表達(dá)，利用鎳柱親和層析法，通過(guò)調(diào)節(jié)A液（磷酸鹽緩沖液）和B液（500 mmol/L咪唑）比例，使咪唑濃度分別為10、50、100、200和300 mmol/L，探索His-CdtA重組蛋白的最佳純化條件，SDS-PAGE驗(yàn)證表達(dá)及純化結(jié)果。同時(shí)設(shè)立相同誘導(dǎo)條件下的pET-28b空載體表達(dá)蛋白陰性對(duì)照。

1.2.6 動(dòng)物免疫 將純化后的His-CdtA重組蛋白按100 μg/只給予6周齡的雌性Balb/c小鼠右后腿肌注，同時(shí)設(shè)立磷酸鹽緩沖液陰性對(duì)照。分別在第1、7和14天進(jìn)行小鼠免疫，首次免疫將His-CdtA重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻，第2、3次免疫將His-CdtA重組蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1混勻。最后1次免疫10 d后收集小鼠血清，分析抗CdtA抗體滴度。

1.2.7 His-CdtA重組蛋白的抗原性分析 將實(shí)驗(yàn)室保存的CdtA（C129-1392）重組蛋白按2 ng/μL包被96孔板，4 ℃包被過(guò)夜，分別加入100 μL按1∶102、1∶：103、1∶104和1∶105稀釋的小鼠血清，做2個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵育2 h后洗5次，加入100 μL按1∶104稀釋的羊抗鼠IgG二抗-辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），37℃孵育1 h后洗5次，加入四甲基聯(lián)苯胺顯色液避光15 min后加入終止液，測(cè)450 nm處的A值。

1.2.8 His-CdtA重組蛋白的免疫印跡法鑒定 純化后的His-CdtA重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后經(jīng)電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，3%牛血清白蛋白封閉1 h，三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液洗3次，以加入1∶500稀釋的免疫后的小鼠血清為一抗，4 ℃振蕩孵育過(guò)夜后洗3次，加入1∶104羊抗鼠IgG二抗-HRP，室溫振蕩孵育1 h后洗4次，加入混勻后的ECL工作液，在ECL呈像儀上曝光并保存結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增cdtA全長(zhǎng)序列

將以RT 027型艱難梭菌菌株為模板的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在1 000～1 500 bp處有1條特異條帶，序列大小與cdtA理論值1 392 bp相符。見(jiàn)圖1。

圖1 cdtA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 菌液PCR鑒定pET-28b-cdtA擴(kuò)增產(chǎn)物

隨機(jī)挑取23個(gè)白色單菌落行菌液PCR，結(jié)果見(jiàn)圖2。由于通用引物T7、T7ter包括載體自身片段約200 bp，故PCR擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)比cdtA的理論值大，位于1 500 bp左右。選取14號(hào)菌為代表，測(cè)序后經(jīng)Blast比對(duì)與GenBank上的艱難梭菌CdtA的序列100%匹配（登錄號(hào)為HQ639678.1）。

圖2 菌液PCR鑒定pET-28b-cdtA的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 His-CdtA重組蛋白的最佳表達(dá)條件

當(dāng)培養(yǎng)物A600達(dá)到0.6時(shí)，調(diào)節(jié)搖床溫度為37 ℃，IPTG濃度為0，160 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，此條件下的上清液在相對(duì)分子質(zhì)量45 000上方有較多的蛋白表達(dá)，且根據(jù)遷移率計(jì)算該蛋白大小與His-CdtA重組蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量53 000相符（圖3、圖4），而陰性對(duì)照（泳道9）不表達(dá)（圖3）。

2.4 His-CdtA重組蛋白的純化

收集各濃度咪唑洗脫液行SDS-PAGE（圖5）。上樣穿透液（泳道2）目的蛋白明顯減少，說(shuō)明His-Cdt A重組蛋白已成功與鎳柱結(jié)合，當(dāng)洗脫液咪唑濃度為10 m mol/L時(shí)能有效洗脫雜蛋白（泳道3），直到濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)才能成功洗下目的蛋白（泳道6）。最終確定本研究His-CdtA重組蛋白的最佳純化條件為：咪唑濃度為10 mmol/L時(shí)洗脫雜蛋白，咪唑濃度為200 mmol/L時(shí)完全洗脫His-CdtA目的蛋白。另外，pET-28b自身攜帶His標(biāo)簽，用相同條件表達(dá)純化后雖然也有低濃度的蛋白被純化，但與His-CdtA目的蛋白大小不一致（圖4），進(jìn)一步驗(yàn)證His-CdtA重組蛋白非載體自身表達(dá)蛋白。

圖3 誘導(dǎo)pET-28b-CdtA蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖

圖4 鎳柱親和層析純化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖

圖5 重組菌與空白載體的表達(dá)蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖

2.5 His-CdtA重組蛋白的抗原性分析

免疫3次后的小鼠血清抗CdtA抗體效價(jià)達(dá)到1∶104。見(jiàn)表1。

表1 His-CdtA重組蛋白的抗體滴度分析

2.6 His-CdtA重組蛋白的Western blot鑒定

免疫后的小鼠血清與純化后的His-CdtA重組蛋白可特異性結(jié)合，而對(duì)應(yīng)大小的pET-28b表達(dá)蛋白無(wú)此現(xiàn)象。見(jiàn)圖6。

圖6 His-CdtA重組蛋白的Western Blot鑒定結(jié)果

3 討論

艱難梭菌可引起艱難梭菌相關(guān)性感染（Clostridium difficile-associated diarrhea，CDAD），是目前唯一能引起院內(nèi)感染的革蘭陽(yáng)性厭氧芽孢梭菌，約25%的抗菌藥物相關(guān)性腹瀉、75%的抗菌藥物相關(guān)性腸炎和約100%的假膜性腸炎均由此菌引起[12]。我國(guó)曾有1例老年患者感染RT 027型艱難梭菌導(dǎo)致休克的報(bào)道[13]，2018年的1篇文獻(xiàn)也報(bào)道了在分離自我國(guó)老年人群的116株艱難梭菌中發(fā)現(xiàn)1株RT 027型和6株RT 078型高產(chǎn)毒艱難梭菌[14]，提示老年人群中存在高產(chǎn)毒艱難梭菌暴發(fā)感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，與非高產(chǎn)毒艱難梭菌比較，更嚴(yán)重、更易復(fù)發(fā)且預(yù)后差，但目前我國(guó)對(duì)艱難梭菌Cdt的研究非常少，更缺少可用的疫苗，故針對(duì)高產(chǎn)毒艱難梭菌菌株毒素抗原性的研究和疫苗的研制對(duì)預(yù)防艱難梭菌暴發(fā)感染十分重要。本研究成功構(gòu)建了CdtA的全長(zhǎng)基因（1 392 bp）原核表達(dá)載體pET-28b-CdtA，重組序列測(cè)序結(jié)果與GenBank中的CdtA序列（登錄號(hào)為HQ639678.1）100%符合。實(shí)驗(yàn)中經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的可溶性His-CdtA重組目的蛋白通過(guò)鎳柱親和層析的方法純化產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為45 000～66 200，根據(jù)遷移率計(jì)算≈CdtA理論值（53 000），純化的His-CdtA免疫小鼠后產(chǎn)生了高效價(jià)的抗CdtA抗體，經(jīng)免疫印跡法鑒定，能與免疫后的小鼠血清特異結(jié)合，這些研究為后續(xù)相關(guān)蛋白單克隆抗體的制備和疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。由于目前尚無(wú)商品化的艱難梭菌CdtA標(biāo)準(zhǔn)蛋白，本研究利用實(shí)驗(yàn)室保存的、以能產(chǎn)Cdt的標(biāo)準(zhǔn)菌株艱難梭菌（ATCCBAA-1870）為PCR模板構(gòu)建pET-28b-CdtA（C129-1392）質(zhì)粒，以表達(dá)并純化的重組CdtA（C129-1392）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白包被96孔板，結(jié)果顯示，小鼠產(chǎn)生的抗CdtA抗體的特異性和編碼包被96孔板的本實(shí)驗(yàn)室保存的重組蛋白CdtA（C129-1392）的DNA來(lái)自產(chǎn)Cdt的標(biāo)準(zhǔn)菌株艱難梭菌（ATCC-BAA-1870），與本研究誘導(dǎo)制備的His-CdtA的DNA模板（加拿大圭爾夫大學(xué)Scott博士惠贈(zèng)）的RT 027型艱難梭菌菌株的DNA來(lái)自不同菌株，二者雖多肽鏈片段長(zhǎng)度有差異，但CdtA（C129-1392）與His-CdtA含有相同的抗原表位。本研究結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)室保存的重組蛋白CdtA（C129-1392）能與實(shí)驗(yàn)中小鼠產(chǎn)生的抗CdtA抗體結(jié)合，間接驗(yàn)證了本研究誘導(dǎo)表達(dá)的CdtA重組蛋白His-CdtA的抗原特異性。由于目前尚無(wú)商品化的抗CdtA特異性一抗，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠免疫后的血清與實(shí)驗(yàn)純化的His-CdtA重組蛋白可特異性結(jié)合，進(jìn)一步說(shuō)明本研究的蛋白純化產(chǎn)物為艱難梭菌CdtA。后續(xù)可考慮用His-CdtA刺激小鼠，制備相應(yīng)的單克隆抗體，為Cdt的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及疫苗研制奠定基礎(chǔ)。