楊徐寧，張國治

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

阿魏酸化學(xué)名為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸(Ferulic acid, FA)，具有較強(qiáng)的抗氧化性和還原性，見光容易分解[1]。阿魏酸是一種生物活性物質(zhì)，既是抗氧化劑又是抗炎癥因子，這些功能特性使得阿魏酸被廣泛應(yīng)用到日化和醫(yī)藥行業(yè)[2]。

青麥仁是乳熟后期、蠟熟期的小麥籽粒，含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維和α、β-淀粉酶[3]，還含有酚酸類和黃酮類等活性物質(zhì)。現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)賦予麩糠類物質(zhì)的新功能，引起了國外學(xué)者對(duì)其研究、開發(fā)及應(yīng)用的極大興趣[4]。青麥仁麩皮中的主要酚酸類物質(zhì)為阿魏酸，其含量高達(dá)14.435 mg/g，至少是黑小麥和普通小麥麩皮的6倍和12倍[5-6]，可見阿魏酸提取工藝的研究對(duì)青麥仁麩皮的開發(fā)利用具有重要意義。

在谷物中，麩皮中的阿魏酸通常通過羧酸基團(tuán)與木聚糖的α-1-阿拉伯糖基側(cè)鏈的羥基形成酯鍵與細(xì)胞壁聚合物連接[7-8]。因此，作者采用堿醇法破壞酯鍵釋放結(jié)合型阿魏酸，并利用超聲波技術(shù)縮短提取時(shí)間，可提高青麥仁麩皮中阿魏酸的提取率，并添加0.2 g/L的亞硫酸鈉，以提高青麥麩中阿魏酸保留率[5]。本研究為青麥仁麩皮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青麥仁購自付利基地；95%乙醇、氫氧化鈉、亞硫酸鈉等為國產(chǎn)分析純；甲醇、三氟乙酸為色譜純；超純水、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(20 mg)購自北京索萊寶公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；A590型紫外可見分光光度計(jì)：上海翱藝儀器有限公司；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；JW-1042型低速離心機(jī)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；1260型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 阿魏酸提取工藝

對(duì)青麥麩進(jìn)行去淀粉、去蛋白、去色素處理后，進(jìn)行冷凍干燥。取一定量預(yù)處理后的青麥麩、氫氧化鈉和95%的乙醇置于小燒杯中并封口，放入超聲清洗器，在特定超聲條件下反應(yīng)一段時(shí)間后，以4 000 r/min離心10 min，向容量瓶中加入2.5 mL 0.2 g/L的亞硫酸鈉，收集上清液并定容，用蒸餾水洗殘?jiān)箅x心，重復(fù)上述步驟3次，平行試驗(yàn)進(jìn)行3次[9]。

1.3.2 阿魏酸的檢測(cè)方法

采用Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.05%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長315 nm。梯度洗脫與等度洗脫結(jié)合如下：0 min，流動(dòng)相A 100%；10 min，流動(dòng)相A 85%，流動(dòng)相B 15%；15 min，流動(dòng)相A 15%，流動(dòng)相B 85%；20 min，流動(dòng)相A 15%，流動(dòng)相B 85%[10-11]。

1.3.3 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，添加甲醇至刻度，搖勻，制得2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；用標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別制成質(zhì)量濃度為0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL的溶液各1 mL[12]。采用1.3.2中的方法測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

通過預(yù)試驗(yàn)考察了料液比、堿醇體積比、堿液質(zhì)量濃度、超聲功率、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)青麥仁麩皮中阿魏酸提取率的影響[13]，確定超聲功率、堿醇體積比、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲溫度為主要影響因素，在料液比為1∶12(g/mL)、超聲時(shí)間30 min時(shí)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。青麥麩中阿魏酸提取率按下式計(jì)算：

阿魏酸提取率=M1/M0×100%，

式中：M1為提取液中阿魏酸的質(zhì)量，mg；M0為青麥麩中阿魏酸的總質(zhì)量，14.435 mg。

而從醫(yī)院本身來講，無錫市人民醫(yī)院是一個(gè)體量很大的醫(yī)院。它是由原無錫市第一人民醫(yī)院、兒童醫(yī)院和第五人民醫(yī)院于2007年11月整建組合而成的，是無錫地區(qū)最大的公立醫(yī)院。醫(yī)院占地270畝，建筑面積32.486萬平方米，根據(jù)不同功能以英文字母分成了行政，門診，醫(yī)技檢查，病房，急診、手術(shù)中心，后勤綜合樓，感染性疾病區(qū)，兒童醫(yī)院，心肺診療中心，體檢中心、特診中心10個(gè)區(qū)域。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲功率、堿醇體積比、堿液質(zhì)量濃度和超聲溫度為考察因素，通過Design-Expert 8.0.6軟件，設(shè)計(jì)四因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)[14]，優(yōu)化青麥仁麩皮中阿魏酸的提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1、圖2分別為阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為青麥仁麩皮阿魏酸的高效液相色譜圖。

圖1 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ferulic acid standard

圖2 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ferulic acid

圖3 青麥仁麩皮阿魏酸高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of ferulic acid from green wheat bran

由圖1和圖3可知，阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品和青麥麩中阿魏酸的保留時(shí)間均為16.5 min左右。由圖2可見，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=25 159X+97.026(R2=0.999 4，n=5)，其中X為阿魏酸質(zhì)量濃度，Y為峰面積。阿魏酸質(zhì)量濃度在0～0.5 mg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲功率對(duì)阿魏酸提取率的影響

圖4 超聲功率對(duì)阿魏酸提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of ferulic acid

由圖4可知，在料液比為1∶12(g/mL)、堿醇體積比為2∶1、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、超聲溫度為60 ℃、超聲時(shí)間為30 min的條件下，隨著超聲功率增大，青麥仁麩皮阿魏酸提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)，在超聲功率為210 W時(shí)，提取率達(dá)到最大。原因可能是游離的阿魏酸不穩(wěn)定，超聲功率過大會(huì)促使其分解，導(dǎo)致提取率下降。因此，選取最佳超聲功率為210 W。

2.2.2 堿醇體積比對(duì)阿魏酸提取率的影響

在料液比為1∶12(g/mL)，堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，超聲溫度為60 ℃、超聲功率為240 W、超聲時(shí)間30 min的條件下，考察堿醇體積比對(duì)阿魏酸提取率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可見，隨著堿醇體積比的增大，阿魏酸提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)，這說明堿液量過小時(shí)，只能使部分阿魏酸被釋放，而堿醇體積比達(dá)到2∶1時(shí)，阿魏酸提取率最大。因此，選擇堿醇體積比為2∶1。

圖5 堿醇體積比對(duì)阿魏酸提取率的影響Fig.5 Effect of alkali alcohol volume ratio on extraction rate of ferulic acid from green wheat bran

2.2.3 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)阿魏酸提取率的影響

在料液比為1∶12(g/mL)，堿醇體積比為2∶1，超聲溫度為60 ℃、超聲功率為240 W、超聲時(shí)間30 min的條件下，考察堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)阿魏酸提取率的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，阿魏酸提取率呈先增大后減小然后平穩(wěn)的趨勢(shì)。堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過小時(shí)，不能使阿魏酸與多糖等大分子物質(zhì)分離，而堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%時(shí)，阿魏酸提取率最大。因此，選擇堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%[13]。

圖6 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)阿魏酸提取率的影響Fig.6 Effect of alkali mass fraction on extraction rate of ferulic acid

2.2.4 超聲溫度對(duì)阿魏酸提取率的影響

在料液比為1∶12(g/mL)，堿醇體積比為2∶1，堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，超聲時(shí)間為30 min、超聲功率為240 W的條件下，考察超聲溫度對(duì)阿魏酸提取率的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著超聲溫度升高，阿魏酸提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大，原因可能是溫度過高會(huì)造成阿魏酸與提取液中的其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而降低提取率。綜合考慮，選擇最佳超聲溫度為60 ℃。

圖7 超聲溫度對(duì)阿魏酸提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of ferulic acid

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到模擬回歸方程為：

Y=81.01-0.80A+3.29B-1.08C+3.08D+0.65AB-0.29AC+1.27AD-4.53BC-6.98BD+3.65CD+4.65A2-7.40B2-4.72C2-4.09D2。

由表1可知，在不同組合條件下青麥仁麩皮中阿魏酸提取率為51.47%～83.97%，說明阿魏酸提取率受不同因素組合的影響較大。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化青麥仁麩皮阿魏酸的提取工藝具有可行性。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of Box-Behnken experiments

各因素的交互作用對(duì)青麥仁麩皮的阿魏酸提取率的影響見圖8、圖9。由圖8、圖9可知，堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與超聲溫度、堿醇體積比與超聲溫度曲面稍陡峭且等高線密集程度適中。在表2中BC顯示顯著，表明堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)B與提取溫度C有較強(qiáng)的交互作用；隨堿醇體積比的增大阿魏酸提取率呈先增大后小幅減小的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槌跗趬A液量過小，無法使大部分阿魏酸分解成游離狀態(tài)，后期堿液量過大、醇用量過小可能使提取液流動(dòng)性減小以及無法使游離出的阿魏酸溶解，也可能因?yàn)閴A和部分阿魏酸中和從而影響阿魏酸的提取率。

表2 方差分析Table 2 Variance analysis

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到了超聲輔助堿醇法提取青麥仁麩皮阿魏酸的最佳工藝條件，考慮試驗(yàn)的可操作性，對(duì)最佳理論提取工藝條件進(jìn)行調(diào)整，即超聲功率240 W、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.56%、超聲溫度57 ℃、堿醇體積比2.3∶1。在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到阿魏酸的實(shí)際提取率為 85.68%，與理論值86.06%接近。試驗(yàn)結(jié)果表明，響應(yīng)面法優(yōu)化模型能很好地預(yù)測(cè)青麥仁麩皮阿魏酸的提取率，其最佳工藝條件及預(yù)測(cè)結(jié)果具有可靠性。

圖8 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲溫度交互作用對(duì)阿魏酸提取率的影響Fig.8 Effect of interaction between alkali mass fraction and ultrasonic temperature on the extraction rate of ferulic acid

圖9 超聲溫度與堿醇體積比的交互作用對(duì)阿魏酸提取率的影響Fig.9 Effect of interaction between ultrasonic temperature and alkali alcohol volume ratio on the extraction rate of ferulic acid

3 結(jié)論

超聲輔助堿醇提取法具有操作簡單、易于控制、提取時(shí)間短、阿魏酸提取率較高的特點(diǎn)。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到超聲波輔助堿醇法提取青麥仁麩皮中阿魏酸的最佳工藝條件：料液比1∶12、超聲時(shí)間30 min、超聲功率240 W、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.56%、超聲溫度57 ℃、堿醇體積比2.3∶1，在此條件下得到青麥麩阿魏酸提取率為85.68%，與理論值86.06%接近，說明該模型與實(shí)際情況較為吻合。本研究為探究青麥仁麩皮中的活性物質(zhì)阿魏酸提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)，有利于青麥仁的開發(fā)利用與功能性食品的制備。