李東風(fēng), 馮 凱

(華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631)

斑胸草雀是研究語言發(fā)聲的模式動物，其高級發(fā)聲中樞HVC(higher vocal center)與人類大腦中的布洛卡區(qū)同源，是鳴禽腦內(nèi)控制鳴曲學(xué)習(xí)前端腦通路(anterior forebrain pathway, AFP)和控制鳴曲發(fā)聲運動通路(vocal motor pathway, VMP )的共同起點.HVC核團(tuán)中的HVCX神經(jīng)元和HVCRA神經(jīng)元通過神經(jīng)投射分別控制AFP通路與VMP通路的X區(qū)與弓狀皮質(zhì)櫟核(robust nucleus of the arcopallium, RA)[1].此外，HVC中還含有一類中間神經(jīng)元HVCINT，在HVC核團(tuán)內(nèi)部分別對上述兩類神經(jīng)元產(chǎn)生抑制作用[2-4].HVCX神經(jīng)元不僅將聽覺信息傳遞給APF通路，而且APF通路的聽覺應(yīng)答也受HVCX神經(jīng)元的影響.AFP通路主要參與鳴曲的學(xué)習(xí)過程，VMP通路主要負(fù)責(zé)鳴曲的發(fā)聲行為.鳴曲的習(xí)得可以幫助斑胸草雀求偶、防御以及維護(hù)領(lǐng)地等社會性行為.

成年雄性斑胸草雀擅長鳴唱，而雌性不會鳴唱.在雌性斑胸草雀皮下埋植睪酮后，可顯著增加HVC核團(tuán)的體積和神經(jīng)元數(shù)量，提示雄激素在鳥類鳴唱系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的作用[5].此外，本實驗室前期工作表明，損毀左側(cè)HVC核團(tuán)，對長鳴和鳴曲的頻域和聲強(qiáng)特征都無顯著影響，而損毀右側(cè)HVC后，則會導(dǎo)致鳴曲特征的顯著性改變，包括鳴曲的振幅、平均頻率和峰頻率的顯著性降低等[6].然而雌雄兩性個體的HVCX神經(jīng)元電生理特性差異尚不清晰，且損毀HVC是破壞整個腦區(qū)的功能，并不能反映單個神經(jīng)元電生理特性的側(cè)別差異.因此，基于前期工作的基礎(chǔ)，探究HVC核團(tuán)神經(jīng)元電生理特性是否具有側(cè)別差異和性別差異為本研究目的.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

成年雌雄斑胸草雀(zebra finch,Taeniopygiaguttata)(>90 d).體重9～15 g，購于廣州花地灣花鳥蟲魚市場.

1.2 試劑藥品

人工腦脊液ACSF(mmol/L)：NaCl 125，NaHCO325，NaH2PO4·H2O 1.27，KCl 2.5，MgSO4·7H2O 1.2，CaCl22.0，Glucose 25；切片液(mmol/L)：Sucrose 248，KCl 5，NaHCO328，Glucose 10，MgSO4·7H2O 1.3，NaH2PO4·H2O 1.26；電極內(nèi)液(mmol/L)：KMeSO4120，NaCl 5，HEPES 10，EGTA 2，Mg-ATP 2，Na-GTP 0.3，pH 7.2.

1.3 主要儀器

膜片鉗放大器，MultiClamp 700B(Axon Instrument, USA)；模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，DIGIDATA 1440A(Axon Instrument, USA)，正置顯微鏡，BX51WI(Olympus, Japan)，微電極拉制儀，P-97(Sutter Ins, USA)，振動切片機(jī)NVSIMI(WPI, USA)，分析天平等.

1.4 腦片制備

10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛(0.05 mL/g)進(jìn)行鳥胸大肌注射，待麻醉后快速斷頭取腦,置于切片液的冰水混合物中冷卻30～60 s，用振動切片機(jī)在冰水混合的切片液中將大腦進(jìn)行矢狀切，切取含有HVC核團(tuán)的250 μm厚的腦片后，將腦片移至溫度為37 ℃且已通混合氣(95%O2+5%CO2)30 min的孵育槽中孵育1 h，之后將溫度調(diào)整為35 ℃，孵育0.5 h后進(jìn)行膜片鉗實驗.

1.5 膜片鉗全細(xì)胞記錄

1.5.1 電極制備及內(nèi)液灌注 用微電極拉制儀將硬質(zhì)玻璃毛坯管(1.5 mm outer diameter, 1.17 mm inner diameter，length 8 cm, Sutter Ins, USA)拉制成微電極.全細(xì)胞記錄電極尖端的阻抗為3～6 MΩ.

1.5.2 HVC神經(jīng)元觀察及記錄 在顯微鏡下觀察置于記錄槽內(nèi)的腦片, 尋找合適的HVC神經(jīng)元.在電極接觸神經(jīng)元后對細(xì)胞給予負(fù)壓進(jìn)行封接，形成高達(dá)GΩ電阻的細(xì)胞吸附式，進(jìn)一步給予負(fù)壓進(jìn)行破膜，形成全細(xì)胞記錄模式.在電流鉗模式下記錄HVC投射神經(jīng)元的誘發(fā)電位及閾值和后超極化幅值等各項電生理指標(biāo).

1.6 數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計分析

用pClampex 10.3軟件采樣系統(tǒng)獲得信號后，根據(jù)HVC各類神經(jīng)元的發(fā)放特性，將記錄到的神經(jīng)元進(jìn)行分類.運用Origin 8.0軟件雙尾t-test檢驗方法對記錄到的HVCX神經(jīng)元的電生理特性指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計與分析.統(tǒng)計指標(biāo)如下：

(1)靜息電位(resting potential，RP)：指細(xì)胞膜未受刺激時，存在于細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)的外正內(nèi)負(fù)的電位差.

(2)動作電位潛伏期(evoked action potential latency):誘發(fā)刺激開始至第一個誘發(fā)動作電位起始所經(jīng)歷的時間.

(3)后超極化達(dá)峰值時間(AHP time to peak)：動作電位下降相降至閾值時起算，直至AHP達(dá)最低點時所經(jīng)歷的時間.

(4)動作電位發(fā)放頻率(spike rate):對500 ms、100 pA刺激下誘發(fā)的動作電位發(fā)放個數(shù)進(jìn)行比較.

2 實驗結(jié)果

2.1 HVC神經(jīng)元的分類

根據(jù)HVC核團(tuán)中3類神經(jīng)元不同的發(fā)放特性，將記錄到的神經(jīng)元進(jìn)行分類[7-8].HVCX神經(jīng)元具有內(nèi)向整流特性，在受到超極化電流刺激時具有明顯的膜電位凹陷(sag)現(xiàn)象.除此之外，在受到持續(xù)地去極化刺激時，發(fā)放頻率較高且存在適應(yīng)性.中間神經(jīng)元HVCINT具有強(qiáng)烈的自發(fā)放活動，受到超極化刺激時，同樣存在sag現(xiàn)象，且比HVCX神經(jīng)元更明顯.此外，在超極化刺激結(jié)束后有一個反彈放電現(xiàn)象，HVCINT接受持續(xù)去極化刺激時會爆發(fā)一種發(fā)放持續(xù)、規(guī)則的緊張型高頻放電模式.HVCRA神經(jīng)元的靜息電位高于另外兩類神經(jīng)元，受到超極化刺激時不存在sag現(xiàn)象，刺激結(jié)束后也沒有反彈放電現(xiàn)象.受到去極化刺激時，只發(fā)放少數(shù)幾個甚至是單個的動作電位(圖1).研究表明，在鳴禽發(fā)聲或聽到多種鳴聲刺激時，HVCX神經(jīng)元都有相同的發(fā)放模式，顯示出了精確的感覺運動一致性[9].故本實驗以HVCX神經(jīng)元為目標(biāo)神經(jīng)元，探究HVCX神經(jīng)元的側(cè)別差異和性別差異.本實驗通過觀察在電流鉗下給予神經(jīng)元500 ms、100 pA的去極化刺激和500 ms、-200～0 pA、步階+20 pA的超極化刺激下的發(fā)放特性來鑒定神經(jīng)元類型.

圖1 HVC核團(tuán)中3類神經(jīng)元發(fā)放特性Fig.1 The firing properties of 3 types of neurons in HVC nucleus

2.2 雌鳥左右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的側(cè)別比較

對雌鳥左右腦HVCX神經(jīng)元施加5 ms、300 pA電流刺激，將記錄到的電生理指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計.結(jié)果顯示，雌鳥右腦的靜息電位值((-61.63±3.77)mV，n=5)顯著低于雌鳥左腦((-66.57±9.51)mV，n=14，P<0.05，圖2B).但是，動作電位潛伏期(圖2C)和后超極化達(dá)峰值時間(圖2D)無顯著性差異.

*P<0.05，差異且有顯著性；**P<0.01,差異極顯著圖2 雌鳥左右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性比較Fig.2 The lateral comparison of electrophysiological properties in adult female zebra finches

2.3 雄鳥左右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的側(cè)別比較

對雄鳥左右腦HVCX神經(jīng)元施加5 ms、300 pA電流刺激，將記錄到的電生理指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計.結(jié)果顯示，右腦HVCX神經(jīng)元的動作電位潛伏期((2.58±0.37) ms，n=5)低于左腦((3.89±0.48) ms，n=12)，且差異極顯著(P<0.01，圖3C).右腦的后超極化達(dá)峰值時間((27.3±7.11) ms，n=5)低于左腦((41.83±6.90) ms，n=6)，且差異極顯著(P<0.01，圖3D).而靜息電位(圖3B)無顯著性差異.說明右腦HVCX神經(jīng)元對傳入信息能夠進(jìn)行更迅速地整合.HVCX神經(jīng)元發(fā)放頻率通過統(tǒng)計單位時間內(nèi)動作電位發(fā)放個數(shù)來表示.在電流鉗下給予HVCX神經(jīng)元500 ms、100 pA刺激，發(fā)現(xiàn)右腦HVCX神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率較高(圖3F).說明雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元的興奮性強(qiáng)于左腦HVCX神經(jīng)元.

*P<0.05，差異且有顯著性；**P<0.01,差異極顯著圖3 雄鳥左右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性比較Fig.3 The lateral comparison of electrophysiological properties in adult male zebra finches

2.4 雌雄鳥左腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的性別差異

對雌雄鳥左腦HVCX神經(jīng)元施加5 ms、300 pA電流刺激，將記錄到的電生理指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計.結(jié)果顯示，靜息電位(圖4B)、動作電位潛伏期(圖4C)和后超極化達(dá)峰值時間(圖4D)均無顯著性差異.

圖4 雌雄鳥左腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的性別差異Fig.4 The sexual dimorphism of electrophysiological properties in left brain of adult male and female zebra finches

2.5 雌雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的側(cè)別比較

對雌雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元施加5 ms、300 pA電流刺激，將記錄到的電生理指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計.雌雄鳥右腦的靜息電位(圖5B)無顯著性差異.雄鳥右腦的動作電位潛伏期((2.58±0.37) ms，n=5)顯著低于雌鳥((3.45±0.56) ms，n=5，P<0.05，圖5C).雄鳥右腦的后超極化達(dá)峰值時間((27.3±7.1) ms，n=5)低于雌鳥右腦((50.58±3.53) ms，n=5)，且達(dá)到極顯著差異(P<0.01，圖5D).在電流鉗下給予HVCX神經(jīng)元500 ms、100 pA刺激，發(fā)現(xiàn)雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率為((11.1±3.18)個，n=10)顯著高于雌鳥右腦((8.71±1.28)個，n=14，P<0.05，圖5F).

圖5 雌雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的性別差異Fig.5 The sexual dimorphism of electrophysiological properties in right brain of adult male and female zebra finches

3 討 論

雄激素對鳴曲的產(chǎn)生和學(xué)習(xí)有著至關(guān)重要的作用.去勢不僅影響鳴曲的學(xué)習(xí)，還會影響鳴唱核團(tuán)的大小.雌鳥埋植雄激素會激發(fā)鳴曲學(xué)習(xí)，增加神經(jīng)元的數(shù)量和增大鳴唱核團(tuán)的體積.雖然雌鳥具有鳴唱核團(tuán)，但因其體內(nèi)缺乏雄激素，故其鳴曲學(xué)習(xí)受阻，只能鳴叫，而不能鳴唱.雌鳥未進(jìn)行系統(tǒng)的鳴曲學(xué)習(xí)，HVC核團(tuán)并不能發(fā)出指導(dǎo)鳴曲的指令，盡管雌鳥左右腦的靜息電位有顯著性差異，但其他指標(biāo)并無差異，且動作電位發(fā)放個數(shù)也無差異，說明左右兩側(cè)神經(jīng)元在接受外界刺激或上游信息輸入時做出的反應(yīng)是一致的.

HVC是鳴禽斑胸草雀發(fā)聲控制通路中的最高級中樞.損毀HVC核團(tuán)不僅會造成音節(jié)丟失，還會導(dǎo)致鳴曲結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且均是損毀右側(cè)HVC造成的影響大于損毀左側(cè)HVC造成的影響[10].損毀左側(cè)HVC未對鳴聲造成顯著影響，而損毀右側(cè)HVC不僅對長鳴和鳴曲的頻域特征和聲強(qiáng)特征產(chǎn)生顯著影響，還會造成主題曲中音節(jié)的丟失和主題曲相似度的下降.分別損毀雄鳥左右側(cè)HVC，鳴曲出現(xiàn)去穩(wěn)定化和音節(jié)丟失，主題曲持續(xù)時間丟失和音節(jié)平均間隔時間均顯著增加.但是，損毀左側(cè)HVC對鳴曲的頻域聲強(qiáng)特征無顯著性影響，說明雙側(cè)HVC共同負(fù)責(zé)鳴曲的時域特征.此外，右側(cè)HVC還負(fù)責(zé)鳴曲的聲強(qiáng)特征[6].雄鳥右腦爆發(fā)的動作電位延時要低于左腦.動作電位的爆發(fā)與鈉離子通道的開放有關(guān)，當(dāng)足夠多的鈉離子通道打開后，局部電位就會增加，達(dá)到閾值進(jìn)而爆發(fā)動作電位.而右腦HVCX神經(jīng)元的動作電位延時短，說明在相同時間內(nèi)鈉離子通道開放數(shù)量更多或者相同數(shù)量的鈉離子通道開放更為迅速，使得其在接受刺激后更易爆發(fā)動作電位.雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元的后超極化達(dá)到峰值時間比左腦低.該指標(biāo)的一個重要作用就是與動作電位的發(fā)放頻率有關(guān).左腦后超極化達(dá)到峰值時間長，限制了其動作電位的發(fā)放.說明雄鳥右側(cè)HVCX神經(jīng)元興奮性高于左側(cè)，提示左右腦HVCX神經(jīng)元在鳴曲學(xué)習(xí)中發(fā)揮不同的功能，右側(cè)HVCX神經(jīng)元的興奮性可能與聲強(qiáng)特征的右側(cè)優(yōu)勢有關(guān).

雌雄斑胸草雀均會長鳴，但是雌鳥長鳴基頻較低，諧波平坦，而雄鳥長鳴音節(jié)時程比較短且穩(wěn)定，基頻較高，在音節(jié)中段及尾段出現(xiàn)向下的頻率調(diào)制.損毀雄鳥左側(cè)HVC前后的長鳴不存在明顯的改變，而損毀右側(cè)HVC后，長鳴已不具備習(xí)得性長鳴的特征，與雌性長鳴和亞鳴期的長鳴類似.雌雄鳥左腦HVCX神經(jīng)元電生理特性并無顯著性差異，雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元的興奮性卻高于雄鳥左腦，提示雄鳥右側(cè)HVC可能是習(xí)得性長鳴與雌性長鳴和亞鳴期長鳴不同的源頭.

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì).雖然雌雄兩性個體HVC核團(tuán)中都有腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體TrkB表達(dá)，但BDNF只存在成年雄性HVC核團(tuán)，雌性HVC中并未檢測到該因子的存在[11].雌鳥中埋植睪酮可以增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量，BDNF通過提高神經(jīng)元的存活率增加HVC核團(tuán)神經(jīng)元數(shù)量和核團(tuán)體積.雌雄鳥性別差異與體內(nèi)睪酮含量有密不可分的聯(lián)系，雌鳥埋植睪酮不僅可提高神經(jīng)元的存活率，而且還會增加神經(jīng)元胞體之間的間隙連接，提示雄鳥大腦中擁有更復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，雌雄鳥的電生理特性的差異可能與此有關(guān).提示雄鳥右側(cè)HVCX神經(jīng)元比雌鳥具有更高的興奮性，利于信息的接收及其向下游核團(tuán)的傳遞，有助于鳴曲的學(xué)習(xí).

本實驗對雌雄兩性的側(cè)別差異和性別差異進(jìn)行了研究.雄鳥個體右側(cè)大腦HVCX神經(jīng)元興奮性強(qiáng)于左腦，即存在右側(cè)優(yōu)勢，提示雙側(cè)HVC核團(tuán)除具備共同的鳴曲學(xué)習(xí)功能外，右側(cè)HVC在鳴曲學(xué)習(xí)中還發(fā)揮其他的作用.雌雄右腦存在性別差異且雄鳥HVCX神經(jīng)元興奮性強(qiáng)于雌鳥，雄鳥HVCX神經(jīng)元能更精準(zhǔn)地接收聽覺信息以及能將聽覺信息有效地進(jìn)一步傳輸給下游核團(tuán)X區(qū)，增強(qiáng)AFP通路信息傳遞能力，從而指導(dǎo)鳴曲的學(xué)習(xí).