沙塔娜提 史 深 廖力夫 孫亞偉 趙紅瓊 徐藝玫

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)， 烏魯木齊 830002)(2.新疆疾病預(yù)防控制中心， 烏魯木齊 830002)

子午沙鼠(Meriones.meridianus)屬于嚙齒目(Rodentia)，倉鼠科(Cricetidae)，沙鼠亞科(Gerbillinae)，小沙鼠屬(Meriones)[1]，為中等體型鼠，體長105～155 mm；因產(chǎn)地不同而存在較大的差異。體背深灰棕色，后足踵部有一點狀小塊裸露區(qū)。本實驗室繁殖的子午沙鼠是分布于吐魯番盆地的葉氏亞種(M.meridianusjei)[2-3]，體型明顯小于其它亞種。子午沙鼠具有耐干旱，性情溫和，易飼養(yǎng)繁殖等特點。自1996年實驗室繁殖以來，子午沙鼠在包蟲病動物模型[4]、戊型肝炎動物模型[5]等方面顯示出明顯的應(yīng)用前景。根據(jù)我國實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化的要求，新培育的子午沙鼠必須按實驗動物標(biāo)準(zhǔn)的要求，逐步完善其生物學(xué)特征的數(shù)據(jù)庫的建立。雖然子午沙鼠的實驗室繁殖已有近20多年的經(jīng)驗，但有關(guān)子午沙鼠雌體發(fā)情周期缺乏詳細(xì)的資料。為掌握子午沙鼠雌體發(fā)情規(guī)律，本文擬用HE染色法對性成熟6月齡子午沙鼠進(jìn)行發(fā)情周期的實驗觀察，為雌性子午沙鼠的科學(xué)合籠配對、種群繁殖和實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化的完成，提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)庫。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新疆吐魯番雌性清潔級6月齡子午沙鼠24只，由新疆自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實驗動物研究中心提供，本實驗在新疆疾病預(yù)防控制中心實驗動物研究中心進(jìn)行(SYXK(新)2016-0001)，飼料為全價小鼠繁殖飼料(成都達(dá)碩實驗動物有限公司)，墊料為新疆自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實驗動物研究中心提供的紙屑墊料，子午沙鼠飼養(yǎng)室控制溫度18～24 ℃，相對濕度40%～70%，明暗交替14 h/10 h[6]。

1.2 試劑與儀器

蘇木精(北京索萊寶科技有限公司)，伊紅染液(上海吉至生化科技有限公司)，磷酸緩沖液(北京萬佳首化生物科技有限公司)，顯微鏡(Nikon MODEL ECLIPSE Ci-L TOKYO,JAPAN)。

1.3 實驗方法

1.3.1采樣：每天間隔4 h采樣一次，保定動物，移液器吸取20 μL生理鹽水?dāng)?shù)次沖洗陰道吸出陰道脫落細(xì)胞，涂于載玻片，自然干，進(jìn)行HE染色后鏡檢及細(xì)胞分類計數(shù)。

1.3.2染色方法：HE染色法是將自然干燥的陰道涂片浸潤蘇木素染液染色5～10 min，流水沖洗，鹽酸乙醇分色數(shù)秒(根據(jù)涂片染藍(lán)色的深淺確定時間)。自來水浸泡返藍(lán)5 min，伊紅染液染色3 min，流水沖洗。干燥，鏡檢[7]。

1.3.3鏡檢及角化細(xì)胞分類計數(shù)：根據(jù)長爪沙鼠發(fā)情規(guī)律[8]，將觀察的圖片根據(jù)角化細(xì)胞分類計數(shù)法分不同的4個發(fā)情周期，分別為發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、發(fā)情間期。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 雌性子午沙鼠發(fā)情周期持續(xù)時間

從表1可知，子午沙鼠的發(fā)情周期為(4.7±1.2)d，其中發(fā)情前期(22.0±12.0) h，發(fā)情期(26.8±8.1) h, 發(fā)情后期(18.2±9.1) h，發(fā)情間期(50.0±38.2) h，占總發(fā)情周期的19.5%、23.8%、16.1%和44.3%。

表1 雌性子午沙鼠發(fā)情周期持續(xù)的時間Table 1 The duration of estrus cycle

2.2 子午沙鼠不同發(fā)情周期陰道脫落細(xì)胞比例變化和特征

圖1顯示，發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和發(fā)情間期的各類上皮細(xì)胞形態(tài)和比例存在顯著性差異。細(xì)胞涂片也存在明顯的不同特征。結(jié)果見圖2。

圖1 子午沙鼠發(fā)情周期各時期陰道脫落細(xì)胞比例注：各發(fā)情周期有核上皮細(xì)胞，角化細(xì)胞，淋巴細(xì)胞都差異顯著(P<0.05)Fig.1 The proportion of vaginal exfoliated cells in Meriones.meridianus different stages of estrus Note：There were nucleated cells, cornified cells and lymphocytes in each estrous cycle (P<0.05)

圖2 雌性子午沙鼠各個發(fā)情周期涂片注: A.發(fā)情前期涂片 B.發(fā)情期涂片 C.發(fā)情后期涂片 D.發(fā)情間期涂片(HE，×100)Fig.2 Slides of M.meridianus each estrous phasesNote: A；Proestrus slide；B：Eestrus slide；C：Metoestrus slide；D：Dioestrus slide(HE，×100)

3 討論

目前在國內(nèi)關(guān)于子午沙鼠生物學(xué)特性已有報道，但僅限于繁殖周期，生仔數(shù)目等內(nèi)容[8-10]，有關(guān)子午沙鼠雌體發(fā)情規(guī)律的相關(guān)內(nèi)容所知甚少，無法滿足今后的研究需要，因此有必要開展子午沙鼠發(fā)情規(guī)律的研究。

目前用于鑒定動物的發(fā)情期方法主要有巴氏染色法，唾液結(jié)晶法[11]，溫度檢測法[11]，瑞氏染色，HE染色，以及陰道外觀和陰道栓觀察法[12]。唾液結(jié)晶法，溫度檢測法，陰道外觀和陰道栓觀察法僅能粗略判斷發(fā)情周期，巴氏染色法染色步驟較繁雜，瑞氏染色雖然步驟簡單，易操作，但辨認(rèn)細(xì)胞需要一定的經(jīng)驗。HE染色法[7]操作簡易便捷，可快速觀察鑒定動物的陰道上皮細(xì)胞，是目前動物發(fā)情周期常用的方法。

本實驗用HE染色法觀察并記錄角化細(xì)胞的分類和數(shù)量，證實雌性子午沙鼠的發(fā)情周期為(4.7±1.2)d，發(fā)情周期分4個時期：發(fā)情前期(22.0±12.0) h，發(fā)情期(26.8±8.1) h，發(fā)情后期(18.2±9.1) h和發(fā)情間期(50.0±38.2) h。從實驗結(jié)果和已有文獻(xiàn)[7]看，HE染色法和間隔4 h采樣法可以判定雌性子午沙鼠發(fā)情的各個性周期。

陳立青等[8]每天采樣一次長爪沙鼠陰道材料，用瑞氏染色和HE染色法觀察陰道各類上皮細(xì)胞形態(tài)和比例，提供簡易、便捷、快速觀察鑒定長爪沙鼠陰道上皮細(xì)胞的方法，顯示長爪沙鼠的發(fā)情周期為(4.4 ±1.5) d，鄭鵬等[12]用陰道外觀和陰道栓每隔12 h采樣觀察昆明小鼠的發(fā)情，發(fā)情周期范圍大概在(4～5)d[13]，該方法操作人員需要一定的經(jīng)驗才能熟練。本研究用間隔4 h采樣，結(jié)合HE染色法觀察了子午沙鼠的發(fā)情周期為(4.7±1.2) d，與長爪沙鼠和昆明小鼠的發(fā)情周期略有不同，但獲得的發(fā)情周期更準(zhǔn)確，表明適當(dāng)短的采樣間隔時間比間隔12 h或1 d的采樣獲得的發(fā)情周期更易準(zhǔn)確。從本實驗早期預(yù)實驗結(jié)果看，間隔(4～8)h采樣對細(xì)胞數(shù)量和發(fā)情周期觀察影響有限，而太短的采樣間隔時間可能會對細(xì)胞數(shù)量和發(fā)情周期分析造成一些影響。

據(jù)陳立青等[8]報道，長爪沙鼠的發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和發(fā)情間期分別占發(fā)情期的19.9%、24.4%、16.7%和45.5%，子午沙鼠各相應(yīng)發(fā)情期為19.5%、23.8%、16.1%和44.3%，兩者數(shù)據(jù)非常接近，可能與同屬小沙鼠屬動物，遺傳上親緣較近有關(guān)。