吳甘林　鄧玉婷　張瑞泉　譚愛(ài)萍　趙飛　姜蘭

摘要：【目的】評(píng)估不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境中喹諾酮類耐藥菌產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，篩選出水產(chǎn)養(yǎng)殖耐藥性監(jiān)測(cè)指示菌，為建立科學(xué)的水產(chǎn)品耐藥防控技術(shù)提供參考依據(jù)?！痉椒ā窟x取萘啶酸（第一代）和恩諾沙星（第三代）2種喹諾酮類藥物，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)不同養(yǎng)殖階段（苗種階段、中間階段及上市階段）羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境（池塘水和底泥）中喹諾酮類耐藥菌的數(shù)量及耐藥率，然后采用高通量測(cè)序分析不同養(yǎng)殖階段喹諾酮類耐藥菌群的結(jié)構(gòu)特征及組成變化。【結(jié)果】在不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及其養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌總數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，羅非魚腸道的細(xì)菌總數(shù)維持在4.6×105～1.6×106 CFU/g，池塘水的細(xì)菌總數(shù)維持在5.2×103～2.1×104 CFU/g，池塘底泥的細(xì)菌總數(shù)維持在4.8×103～3.2×104 CFU/g。苗種階段羅非魚腸道菌群對(duì)萘啶酸和恩諾沙星的耐藥率均高于中間階段和上市階段，分別為34.7%和19.0%。各養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境優(yōu)勢(shì)菌群均以氣單胞菌屬、埃希菌—志賀氏菌屬、鯨桿菌屬、鄰單胞菌屬、芽孢桿菌屬和腸桿菌屬細(xì)菌為主。隨著養(yǎng)殖階段的推移，羅非魚腸道中的氣單胞菌屬相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，而鯨桿菌屬呈上升趨勢(shì);而養(yǎng)殖環(huán)境中的菌群結(jié)構(gòu)無(wú)明顯規(guī)律性變化。在羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境喹諾酮類耐藥菌群中，埃希菌—志賀氏菌屬和氣單胞菌屬的相對(duì)豐度較高，且隨著養(yǎng)殖階段的推移呈不同程度上升趨勢(shì)?！窘Y(jié)論】羅非魚養(yǎng)殖的耐藥風(fēng)險(xiǎn)主要集中在養(yǎng)殖前期階段，埃希菌屬和氣單胞菌屬是喹諾酮類耐藥的主要菌群，應(yīng)加強(qiáng)不同養(yǎng)殖階段的飼養(yǎng)管理，減少病害發(fā)生以減輕抗菌藥物使用帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，可選用埃希菌屬和氣單胞菌屬作為水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)的指示菌，實(shí)時(shí)監(jiān)控喹諾酮類藥物耐藥性的產(chǎn)生與傳播。

關(guān)鍵詞： 羅非魚;腸道;養(yǎng)殖環(huán)境;喹諾酮類藥物;耐藥菌群

中圖分類號(hào)： S965.125? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）12-3073-10

Abstract：【Objective】In order to evaluate the bacterial resistance risk to quinolones in tilapia intestine and its culture envrionment， and find out the bacterial indicator of antimicrobial resistance surveillance， which could provide reference for the establishment of scientific prevention and control technology of aquatic product drug resistance. 【Method】Two quinolones of nalidixic acid （first generation） and enrofloxacin （third generation） were selected. The number and resistance rate of quinolones resistant bacteria in intestinal tract and culture environment （pond water and sediment） of tilapia were calculated by plate counting method， then high throughput sequencing was used to analyze the structural characteristics and composition of quinolones resistant flora in different breeding stages. 【Result】The results showed that total viable counts of bacteria in the tilapia intestine and the culture environment was comparatively stable at different breeding stages. The total number of bacteria in tilapia intestine， pond water and sediment maintained at 4.6×105-1.6×106 CFU/g， 5.2×103-2.1×104 CFU/g and 4.8×103-3.2×104 CFU/g， respectively. The resistance rates of fish intestinal bacteria to nalidixic acid and enrofloxacin at the fingerling stage were higher than other two stages， reaching 34.7% and 19.0%， respectively. The dominant flora of tilapia intestines and culture environment at each breeding stage were Aeromonas， Escherichia-Shige-lla， Cetobacterium， Plesiomonas， Bacillus and Enterobacter. As breeding time progressed， the flora of tilapia intestine was observed that the relative abundance of Aeromonas was decreased， while the relative abundance of Cetobacterium was increased. There was no obvious regular change in the structure of the bacterial community in the culture environment. Among the quinolone-resistant flora of tilapia intestines and culture environment， the relative abundance of Escherichia-Shigella and Aeromonas was relatively high， and increased in varying degrees with the pass of the breeding stage.【Conclusion】In conclusion， high risk of quinolones resistance is observed in tilapia intestine and aquatic environment at the fingerlings stage. Escherichia and Aeromonas are the dominant? flora? of quinolone resistance. It is necessary to strengthen the feeding management of different breeding stages and reduce the occurrence of diseases to reduce the risk of antimicrobial use. Escherichia and Aeromonas should be as indicator bacteria of antimiorcobial resistance in aquaculture， to monitor? drug resistance occurrence and transmission of quinolones.

Key words： tilapia; intestine; aquaculture environment; quinolone;? drug resistance microbiota

Foundation item：National Key Research and Development Program of China（2017YFC1600704）;? Construction Project of Modern Agricultural Industry Technology System（CARS-46）; Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund of Chinese Academy of Fishery Sciences（2018SJ-YB04）

0 引言

【研究意義】隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；图s化程度的不斷提高，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物各種病害的發(fā)生與流行日趨嚴(yán)重，為減輕水產(chǎn)病害發(fā)生造成的損失，養(yǎng)殖過(guò)程不可避免地使用抗菌藥物（Kümmerer，2009）。但與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)抗菌藥物的使用管理仍不規(guī)范，在養(yǎng)殖過(guò)程中不科學(xué)合理使用抗菌藥物的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生;且抗菌藥物的不合理使用極易導(dǎo)致耐藥細(xì)菌增加，其中又以喹諾酮類藥物的耐藥問(wèn)題最嚴(yán)重（Hao et al.，2015;Liu et al.，2017）。細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性已成為全球嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題，世界衛(wèi)生組織將其列為未來(lái)幾十年人類健康的三大威脅之一（McEwen and Collignon，2018）。在水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中，耐藥菌群數(shù)量越多，其攜帶的耐藥基因傳遞給耐藥致病菌的可能性越大，同時(shí)可能會(huì)通過(guò)水產(chǎn)動(dòng)物源食品及環(huán)境污染等進(jìn)入食物鏈，而對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅（McEwen and Collignon，2018）。因此，在耐藥致病菌出現(xiàn)或廣泛傳播前，了解水產(chǎn)養(yǎng)殖各環(huán)節(jié)的耐藥風(fēng)險(xiǎn)，并制定相應(yīng)的預(yù)警和防控措施，對(duì)確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】羅非魚因其繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美及骨刺少等特點(diǎn)，已發(fā)展成為全球性的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，也是我國(guó)出口量較大的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一（葉富良，2004;代云云等，2016）。在羅非魚養(yǎng)殖過(guò)程中，以鏈球菌（Streptococcus）和氣單胞菌（Aeromonas）等病原菌引起的細(xì)菌性疾病最常見(jiàn)，且危害較大（黃鈞等，2012;Deng et al.，2014;黎銘等，2019;謝云丹等，2019）。水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)及其養(yǎng)殖環(huán)境中含有豐富的微生物和遺傳物質(zhì)資源，養(yǎng)殖過(guò)程中若大量投喂抗菌藥物，在抗菌藥物的壓力下其正常菌群可能因自身基因改變或捕獲外源耐藥基因等而對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，并通過(guò)耐藥元件如質(zhì)粒、整合子及插入序列等將耐藥基因傳遞給致病菌（Zhang et al.，2011;Liu et al.，2017）。喹諾酮類藥物是水產(chǎn)養(yǎng)殖中治療細(xì)菌性疾病最常用的抗菌藥物之一。萘啶酸是第一代最早開發(fā)的喹諾酮類藥物，但抗菌譜窄且易產(chǎn)生耐藥性;第三代藥物（氟喹諾酮類）在喹諾酮母核引入氟原子后有效增強(qiáng)了抗菌活性，恩諾沙星即為第三代動(dòng)物專用代表藥物（王瑞旋和陳畢生，2007）。不同代的喹諾酮類藥物因分子結(jié)構(gòu)不同，細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制也存在明顯差異。呂小麗等（2017）在檢測(cè)羅非魚鏈球菌對(duì)不同喹諾酮類藥物的耐藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)，依諾沙星的耐藥率最高（80%），諾氟沙星的耐藥率也達(dá)40%，而環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左氟沙星的耐藥率均低于10%。隨著喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的推廣應(yīng)用，喹諾酮類耐藥性也不斷增強(qiáng)（王瑞旋和陳畢生，2007;Hao et al.，2015;Liu et al.，2017）。已有研究證實(shí)，羅非魚嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氧氟沙星等常見(jiàn)喹諾酮類藥物的耐藥率均高于39%（林居純等，2009;丁正峰等，2011）。【本研究切入點(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境或水產(chǎn)品的細(xì)菌耐藥性研究多限于某一種屬的菌株，其結(jié)果對(duì)反映魚體內(nèi)或養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌的耐藥情況存在片面性（袁偉，2017;Lee and Wendy，2017;郭學(xué)中等，2018），且鮮見(jiàn)針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的耐藥風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)分離自同一樣品不同科屬細(xì)菌的耐藥表型及耐藥基因分布差異顯著（郭學(xué)中等，2018），但耐藥菌株在動(dòng)物體內(nèi)和環(huán)境介質(zhì)中的傳播機(jī)制尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選取萘啶酸（第一代）和恩諾沙星（第三代）2種喹諾酮類藥物，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法了解不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境中喹諾酮類耐藥菌的產(chǎn)生比例，評(píng)估不同養(yǎng)殖階段的耐藥風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)分析喹諾酮類耐藥菌群組成，篩選出水產(chǎn)養(yǎng)殖耐藥監(jiān)測(cè)指示菌，以期為建立科學(xué)的水產(chǎn)品耐藥防控技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 含藥培養(yǎng)基配制

根據(jù)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）針對(duì)萘啶酸和恩諾沙星的藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)，選取這2種藥物的耐藥值作為耐藥菌的篩選濃度。分別配制含萘啶酸（終濃度128 μg/mL）和恩諾沙星（終濃度4 μg/mL）的平板計(jì)數(shù)瓊脂瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）及不含藥物的PCA培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基。

1. 2 樣品采集

選定廣東省陽(yáng)春市的3個(gè)羅非魚養(yǎng)殖場(chǎng)，分別于2018年6、8和10月進(jìn)行樣品采集，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)均采集羅非魚、池塘水和池塘底泥等樣品。不同養(yǎng)殖階段的羅非魚各取5～10尾，體重分別為：苗種階段24.6±3.0 g/尾，中間階段242.72±76.8 g/尾，上市階段809.1±72.7 g/尾。每個(gè)池塘選取3個(gè)采水點(diǎn)，用采水器采集魚塘表面下10～15 cm的水體1 L，相同采水點(diǎn)位置各采集池塘底泥50 g。

1. 3 樣品處理

羅非魚樣品處理：將采集的羅非魚先進(jìn)行體重及體長(zhǎng)測(cè)量，然后以75%酒精擦拭魚體體表并置于超凈工作臺(tái)上。用無(wú)菌剪刀自肛門處沿腹部剪至嘴部，取出腸道置于干凈解剖盤中，去除腸道外圍脂肪及血液等，以無(wú)菌剪刀剪下全部腸道。將同一養(yǎng)殖場(chǎng)的羅非魚腸道樣品混合，剪碎研磨，腸道樣品稱重后按腸與水1∶5的比例加入無(wú)菌生理鹽水，置于裝有玻璃珠的三角燒瓶中，在振蕩器中以160 r/min的速度振蕩30 min后靜置30 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆?。水樣處理：同一養(yǎng)殖場(chǎng)不同采樣點(diǎn)的水樣各取500 mL混合，4 ℃保存?zhèn)溆?。池塘底泥樣品處理：同一養(yǎng)殖場(chǎng)的底泥樣品各稱取20 g，混合后置于裝有玻璃珠的三角燒瓶中，按泥與水1∶5的比例加入無(wú)菌生理鹽水，在振蕩器中以160 r/min的速度振蕩30 min再靜置30 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)

取預(yù)處理樣品，用無(wú)菌生理鹽水按10倍系列稀釋為5個(gè)梯度，然后從5個(gè)梯度稀釋液中各取1.0 mL接種于含萘啶酸或恩諾沙星及不含藥的PCA培養(yǎng)基上，30 ℃靜置培養(yǎng)48～72 h后計(jì)數(shù)，再對(duì)樣品耐藥率進(jìn)行計(jì)算。

耐藥率（%）=樣品在藥物篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的

菌落數(shù)/樣品在不含藥培養(yǎng)基上? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?生長(zhǎng)的菌落總數(shù)×100

1. 5 細(xì)菌總DNA提取及16S rDNA高通量測(cè)序

取預(yù)處理樣品0.1 mL，分別涂布于含萘啶酸或恩諾沙星及不含藥的TSA培養(yǎng)基上，30 ℃靜置培養(yǎng)18～20 h。用無(wú)菌生理鹽水洗下TSA培養(yǎng)基上的菌落，吹打混勻，5000×g離心5 min，棄上清液，細(xì)菌沉淀物采用Bacterial DNA Kit試劑盒（OMEGA）進(jìn)行DNA提取。以提取獲得的DNA為模板，以27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TA CGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)膠回收和純化試劑盒分別回收純化后，送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序，測(cè)序區(qū)域?yàn)閂3～V4區(qū)，測(cè)序平臺(tái)為HiSeq2500 PE250。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境的菌群數(shù)量特征

2. 1. 1 羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌總數(shù)在養(yǎng)殖過(guò)程中的變化情況 通過(guò)平板計(jì)數(shù)法對(duì)所采集的樣品進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)分析，結(jié)果（表1）顯示，羅非魚腸道、池塘水和底泥在苗種階段、中間階段及上市階段的細(xì)菌總數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）;但羅非魚腸道樣品的細(xì)菌總數(shù)顯著高于養(yǎng)殖環(huán)境樣品（P<0.05，下同）。其中，羅非魚腸道的細(xì)菌總數(shù)維持在4.6×105～1.6×106 CFU/g，池塘水的細(xì)菌總數(shù)維持在5.2×103～2.1×104 CFU/g，池塘底泥的細(xì)菌總數(shù)維持在4.8×103～3.2×104 CFU/g。

2. 1. 2 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥情況 羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境樣品經(jīng)含萘啶酸或恩諾沙星的PCA培養(yǎng)基培養(yǎng)48～72 h后，分別統(tǒng)計(jì)篩選獲得的耐藥菌菌落數(shù)，并與不含藥物PCA培養(yǎng)計(jì)數(shù)后的菌落總數(shù)進(jìn)行比較，計(jì)算出不同來(lái)源樣品菌群在不同養(yǎng)殖階段的耐藥率。結(jié)果顯示，不同來(lái)源樣品菌群對(duì)萘啶酸的耐藥率均高于對(duì)恩諾沙星的耐藥率。其中，羅非魚腸道菌群對(duì)萘啶酸的耐藥菌數(shù)平均為2.3×105 CFU/g，耐藥率為25.6%，對(duì)恩諾沙星的耐藥菌數(shù)平均為1.3×105 CFU/g，耐藥率為14.6%;養(yǎng)殖環(huán)境（池塘水和底泥）無(wú)論從耐藥菌數(shù)和耐藥率均遠(yuǎn)低于羅非魚腸道。對(duì)比不同養(yǎng)殖階段，發(fā)現(xiàn)苗種階段羅非魚腸道菌群對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率高于中間階段和上市階段。苗種階段羅非魚腸道菌群對(duì)萘啶酸的耐藥率為34.7%、中間階段的耐藥率為29.4%、上市階段的耐藥率為11.3%，苗種階段羅非魚腸道菌群對(duì)恩諾沙星的耐藥率為19.0%、中間階段的耐藥率為15.3%、上市階段的耐藥率為10.4%;而池塘水和底泥菌群在各養(yǎng)殖階段的耐藥率波動(dòng)相對(duì)較?。ū?）。

2. 2 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境的菌群結(jié)構(gòu)特征

2. 2. 1 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境的微生物多樣性分析 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境微生物α多樣性指數(shù)顯示，OTU稀釋曲線趨于平緩并達(dá)平臺(tái)期（圖1），說(shuō)明測(cè)序量趨于飽和，高通量測(cè)序結(jié)果可較全面反映樣品中的微生物組成。其中，羅非魚腸道微生物在苗種階段和上市階段的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)較接近，且均小于中間階段，即中間階段的羅非魚腸道微生物多樣性高于苗種階段和上市階段;池塘水微生物在苗種階段和上市階段的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也較接近，但均大于中間階段，說(shuō)明中間階段的池塘水微生物多樣性低于苗種階段和上市階段;池塘底泥微生物在3個(gè)養(yǎng)殖階段的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均較接近，說(shuō)明池塘底泥微生物多樣性在養(yǎng)殖期間較穩(wěn)定，變化不明顯。

2. 2. 2 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境的微生物物種組成 經(jīng)高通量測(cè)序可知，羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境中的可培養(yǎng)微生物主要可歸類為8個(gè)門（圖2），分別是變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、平生菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中，3個(gè)采樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌群均集中在變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門;羅非魚腸道微生物在各養(yǎng)殖階段均以變形菌門和梭桿菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（二者相對(duì)豐度之和超過(guò)80%），而池塘水和底泥微生物在各養(yǎng)殖階段以變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（相對(duì)豐度均超過(guò)75%）。

羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境中的可培養(yǎng)微生物主要可歸類為10個(gè)屬（圖3），分別是氣單胞菌屬（Aeromonas）、埃希菌—志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、鯨桿菌屬（Cetobacterium）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、摩根氏菌屬（Morganella）、愛(ài)德華菌屬（Edwardsiella）和變形桿菌屬（Proteus）。各養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境（池塘水和底泥）的優(yōu)勢(shì)菌群均以氣單胞菌屬、埃希菌—志賀氏菌屬、鯨桿菌屬、鄰單胞菌屬、芽孢桿菌屬和腸桿菌屬為主。隨著養(yǎng)殖階段的推移，羅非魚腸道中的氣單胞菌屬相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，而鯨桿菌屬呈上升趨勢(shì);養(yǎng)殖環(huán)境（池塘水和底泥）中的菌群結(jié)構(gòu)在不同養(yǎng)殖階段無(wú)明顯規(guī)律性變化，可能是受外界環(huán)境因素影響較大。

2. 3 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境喹諾酮類耐藥菌的菌群結(jié)構(gòu)特征

2. 3. 1 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境萘啶酸耐藥菌的菌群結(jié)構(gòu)特征 通過(guò)含萘啶酸TSA培養(yǎng)基篩選菌群再進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果顯示其屬分類水平的優(yōu)勢(shì)菌群主要為埃希菌—志賀氏菌屬、腸桿菌屬和氣單胞菌屬（圖4）。羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境樣品中對(duì)萘啶酸耐藥的優(yōu)勢(shì)菌群主要為埃希菌—志賀氏菌屬、腸桿菌屬和氣單胞菌屬，三者的相對(duì)豐度之和在羅非魚腸道樣品中超過(guò)70%，在養(yǎng)殖環(huán)境（池塘水和底泥）中高達(dá)90%以上。隨著養(yǎng)殖階段的推移，羅非魚腸道及池塘水中的埃希菌—志賀氏菌相對(duì)豐度逐漸上升，底泥中則表現(xiàn)為氣單胞菌屬相對(duì)豐度逐漸上升。

2. 3. 2 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境恩諾沙星耐藥菌的菌群結(jié)構(gòu)特征 通過(guò)含恩諾沙星TSA培養(yǎng)基篩選菌群再進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果顯示其屬分類水平的優(yōu)勢(shì)菌群主要為埃希菌—志賀氏菌屬和氣單胞菌屬（圖5），兩者的相對(duì)豐度之和在羅非魚腸道樣品中在50%以上，在養(yǎng)殖環(huán)境（池塘水和底泥）中高達(dá)90%以上。比較不同養(yǎng)殖階段，羅非魚腸道菌群中對(duì)恩諾沙星耐藥的氣單胞菌屬在中間階段的相對(duì)豐度顯著高于苗種階段和上市階段;養(yǎng)殖環(huán)境（池塘水和底泥）樣品中對(duì)恩諾沙星耐藥的菌群無(wú)明顯規(guī)律性變化。

3 討論

關(guān)于魚類腸道菌群及養(yǎng)殖環(huán)境微生物多樣性分析是近年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。魚腸道菌群可分為固有菌群和非固有菌群，在魚類維持機(jī)體代謝、發(fā)育進(jìn)化及免疫等方面發(fā)揮重要作用（Wang et al.，2017）。魚類腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)特征不僅受限于魚體自身且與其養(yǎng)殖環(huán)境密切相關(guān)，還與其所處環(huán)境的各種理化性質(zhì)及生物因子相關(guān)（陳孝煊等，2005）。魚類腸道內(nèi)的細(xì)菌種類繁多，包括好氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌，且數(shù)量龐大。由于所處水體環(huán)境和食性等因素的差異，不同魚類的腸道細(xì)菌組成和數(shù)量也各不相同。魚類腸道中的厭氧菌總數(shù)遠(yuǎn)大于需氧菌總數(shù)，但厭氧菌多數(shù)定殖于腸壁，其含量相對(duì)較穩(wěn)定;而需氧菌主要游離于腸腔內(nèi)，其含量隨機(jī)波動(dòng)性較大。本研究采用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)得出羅非魚腸道的細(xì)菌總數(shù)在4.6×105～1.6×106 CFU/g，與已報(bào)道其他淡水魚類（鰱、鯉和鯽）腸道的細(xì)菌數(shù)量差異不明顯，但低于草魚腸道的細(xì)菌總數(shù)（在107 CFU/g左右）（周玉法等，2012）。

已有研究表明，非固有菌群中存在多種條件致病菌，包括氣單胞菌屬、假單胞菌屬和分支桿菌屬等，且這些細(xì)菌多數(shù)為需氧菌或兼性厭氧菌（Dong et al.，2018）。為了解非固有菌群中潛在的條件致病菌和耐藥菌組成，本研究采用高通量測(cè)序分析不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境的菌群結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明，羅非魚腸道可培養(yǎng)微生物中的優(yōu)勢(shì)菌群主要是氣單胞菌屬、埃希菌—志賀氏菌屬、鯨桿菌屬、鄰單胞菌屬和腸桿菌屬細(xì)菌，且隨著養(yǎng)殖階段的推移，羅非魚腸道中的氣單胞菌屬相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，而鯨桿菌屬呈上升趨勢(shì);C采樣點(diǎn)羅非魚腸道鯨桿菌屬的變化趨勢(shì)與A和B采樣點(diǎn)的變化趨勢(shì)略有不同，可能與飼料投喂和營(yíng)養(yǎng)攝入差異有關(guān)。佟延南等（2018）研究表明，羅非魚腸道優(yōu)勢(shì)菌群主要為乳球菌屬（Lactococcus）、聚球藻屬（Synechococcus）、梭菌屬（Clostridium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）和鯨桿菌屬;劉志剛等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，健康羅非魚腸道優(yōu)勢(shì)菌群為芽孢桿菌屬、乳球菌屬和鯨桿菌屬，鏈球菌發(fā)病羅非魚腸道優(yōu)勢(shì)菌群為鏈球菌屬、分支桿菌屬和芽孢桿菌屬?？梢?jiàn)，羅非魚腸道存在比例較高的條件致病菌，且多屬于可培養(yǎng)的需氧或兼性厭氧菌，可在細(xì)菌病害或細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)中作為指示菌。養(yǎng)殖環(huán)境（池塘水和底泥）的優(yōu)勢(shì)菌群組成與羅非魚腸道菌群組成存在一定差異，其中羅非魚腸道優(yōu)勢(shì)菌群種類與池塘水的優(yōu)勢(shì)菌群種類相似，但相對(duì)豐度有明顯差異，如養(yǎng)殖池塘水中的鯨桿菌屬相對(duì)豐度小于1%，而羅非魚腸道中的鯨桿菌屬相對(duì)豐度大于20%，與劉志剛等（2018）的研究結(jié)果相似。鯨桿菌屬細(xì)菌是淡水魚腸道中常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌（Larsen et al.，2014），可產(chǎn)生醋酸及維生素B12等物質(zhì)，在魚類生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Tsuchiya et al.，2008;Li et al.，2015）。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖階段的推移，羅非魚腸道中的鯨桿菌屬相對(duì)豐度逐漸上升趨勢(shì)，符合魚體的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)羅非魚喹諾酮類藥物的耐藥性研究主要集中在羅非魚體內(nèi)分離獲得的病原菌。Lee和Wendy（2017）對(duì)分離自紅色雜交羅非魚（Oreochromis spp.）的嗜水氣單胞菌和遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）進(jìn)行16種抗菌藥物的耐藥性分析，袁偉（2017）對(duì)我國(guó)南方地區(qū)的羅非魚源無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行5種喹諾酮類藥物的敏感性測(cè)定，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)不同病原菌對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性各有差異，與不同地區(qū)、不同來(lái)源及不同菌種等有關(guān)。郭學(xué)中等（2018）研究表明，分離自同一羅非魚產(chǎn)品的氣單胞菌和大腸埃希菌（Escherichia coli）對(duì)恩諾沙星的耐藥率也存在明顯差異，其中，氣單胞菌對(duì)恩諾沙星的耐藥率為2.50%，而大腸埃希菌對(duì)恩諾沙星的耐藥率為25.82%。本研究采用平板計(jì)數(shù)法分析各樣品的總體耐藥細(xì)菌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅非魚腸道中對(duì)萘啶酸耐藥的細(xì)菌數(shù)量平均為2.3×105 CFU/g，耐藥率為25.6%，對(duì)恩諾沙星耐藥的細(xì)菌數(shù)量平均為1.6×105 CFU/g，耐藥率為17.9%;而養(yǎng)殖環(huán)境（池塘水和底泥）無(wú)論從耐藥菌數(shù)量和耐藥率均低于羅非魚腸道。余麗等（2016）采用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)水產(chǎn)品中的四環(huán)素耐藥細(xì)菌情況，結(jié)果顯示魚腸中四環(huán)素耐藥菌數(shù)量達(dá)106 CFU/g。可見(jiàn)，魚類腸道可能是耐藥細(xì)菌蓄積的主要場(chǎng)所。Singh等（2009）采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)不同養(yǎng)殖階段的鯉進(jìn)行四環(huán)素耐藥性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成魚階段對(duì)土霉素的耐藥菌數(shù)及耐藥率均高于魚苗階段和魚卵階段，但本研究發(fā)現(xiàn)魚苗階段的喹諾酮類耐藥菌數(shù)相對(duì)較高，可能與不同品種的具體養(yǎng)殖情況有關(guān)。本研究的3個(gè)樣品采集養(yǎng)殖場(chǎng)在試驗(yàn)期間均未發(fā)生病害，也未使用抗菌藥物，苗種階段的喹諾酮類耐藥菌數(shù)較高可能與培苗過(guò)程曾使用藥物有關(guān)。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，耐藥性研究已從單一細(xì)菌耐藥轉(zhuǎn)變?yōu)橐晕⑸锶郝錇閷?duì)象的耐藥組學(xué)研究（Boolchandani et al.，2019）。腸道菌群是一個(gè)龐大而復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，細(xì)菌個(gè)體間緊密接觸更利于耐藥基因通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移在菌群間傳播，因此，腸道菌群組成的耐藥基因儲(chǔ)庫(kù)可介導(dǎo)菌群間多種耐藥基因持續(xù)、廣泛傳播（高琰宇等，2018）?？咕幬镏苯臃靡鹉c道菌群結(jié)構(gòu)改變，是導(dǎo)致菌群耐藥菌株和耐藥基因增多且廣泛分布的主要原因（高琰宇等，2018）。Yuan等（2019）通過(guò)檢測(cè)市售四大家魚腸道菌群的耐藥菌株和耐藥基因，發(fā)現(xiàn)四大家魚的腸道菌群主要有梭菌門、變形門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，不同類型的耐藥基因與不同菌群相關(guān)，如四環(huán)素耐藥基因tetA主要與棒桿菌屬（Corynebacterium）相關(guān)、β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaTEM-1主要與布魯氏菌（Brucella）相關(guān)。Zimmermann和Curtis（2019）對(duì)42篇關(guān)于喹諾酮類藥物對(duì)人類腸道菌群影響的報(bào)道進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有4篇報(bào)道中志愿者服用環(huán)丙沙星后，其腸道菌群多樣性呈不同程度的降低，而多篇報(bào)道指出經(jīng)喹諾酮類藥物治療后，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細(xì)菌、大腸埃希菌、芽孢桿菌屬及棒狀桿菌屬的相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，彎曲桿菌屬（Citrobacter）、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬（Klebsilla）的相對(duì)豐度則呈上升趨勢(shì)，此外，多數(shù)厭氧菌如擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和梭菌屬（Clostridium）的相對(duì)豐度也有不同程度的下降趨勢(shì)。恩諾沙星主要作用需氧和兼性厭氧菌，對(duì)腸道菌群占優(yōu)勢(shì)地位的厭氧菌作用不強(qiáng)（秦玉玲等，2009）。本研究采用含恩諾沙星TSA培養(yǎng)基篩選耐藥菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅非魚腸道耐藥菌群以埃希菌屬—志賀氏菌屬和氣單胞菌屬的相對(duì)豐度較高，且氣單胞菌屬在中間階段的相對(duì)豐度較高;通過(guò)含萘啶酸TSA培養(yǎng)基篩選的耐藥菌群以埃希菌屬—志賀氏菌屬和腸桿菌屬為主，腸桿菌屬在苗種階段的相對(duì)豐度較高，但隨著養(yǎng)殖階段的推移而下降，埃希菌屬—志賀氏菌屬的相對(duì)豐度則隨著養(yǎng)殖階段的推移呈上升趨勢(shì)?？梢?jiàn)，埃希氏菌屬和氣單胞菌屬最易產(chǎn)生喹諾酮類耐藥。埃希菌屬的大腸埃希菌是人類和動(dòng)物體內(nèi)及環(huán)境中分布最廣泛的細(xì)菌，也是常見(jiàn)的食源性細(xì)菌。不同來(lái)源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性已呈越來(lái)越嚴(yán)重的趨勢(shì)（郭學(xué)中等，2018;Poirel et al.，2018;Tomova et al.，2018），對(duì)食品安全及人類健康已產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。氣單胞菌屬是水產(chǎn)動(dòng)物的常見(jiàn)病原菌，其耐藥性的產(chǎn)生同樣會(huì)對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全產(chǎn)生影響（郭學(xué)中等，2018;譚愛(ài)萍等，2019）。此外，埃希菌屬—志賀氏菌屬和氣單胞菌屬耐藥細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的喹諾酮類耐藥風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高，提示大腸埃希菌和氣單胞菌可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖喹諾酮類耐藥性監(jiān)測(cè)的指示菌。

4 結(jié)論

羅非魚養(yǎng)殖的耐藥風(fēng)險(xiǎn)主要集中在養(yǎng)殖前期階段，埃希菌屬和氣單胞菌屬是喹諾酮類耐藥的主要菌群，應(yīng)加強(qiáng)不同養(yǎng)殖階段的飼養(yǎng)管理，減少病害發(fā)生以減輕抗菌藥物使用帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，可選用埃希菌屬和氣單胞菌屬作為水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)的指示菌，實(shí)時(shí)監(jiān)控喹諾酮類藥物耐藥性的產(chǎn)生與傳播。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）