楊珍珍邊力張巖常青陳四清劉長(zhǎng)琳葛建龍胡建成張盛農(nóng)

圓斑星鰈基因的克隆與表達(dá)分析*

楊珍珍1,2邊 力2,3張 巖2,3常 青2,3陳四清2,3①劉長(zhǎng)琳2,3葛建龍2,3胡建成2,3張盛農(nóng)2

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

本研究采用RACE末端擴(kuò)增方法，得到全長(zhǎng)為3872 bp的圓斑星鰈()基因序列，命名為，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)為3192 bp，編碼1063個(gè)氨基酸，5￠-UTR和3￠-UTR的長(zhǎng)度分別140 bp和540 bp?；贓xPASy、SMART、Signal4.1和NCBI的保守結(jié)構(gòu)域(CDD)數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)分析對(duì)蛋白序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，推斷編碼的氨基酸分子量為118.6 kDa，理論等電點(diǎn)為9.02，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽，有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：ArgoL1結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域及PIWI結(jié)構(gòu)域。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)圓斑星鰈不同發(fā)育時(shí)期的胚胎、仔稚魚(yú)以及雌雄成魚(yú)的不同組織表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，基因從胚胎發(fā)育早期至高囊胚期均大量表達(dá)，之后呈下降趨勢(shì)，直至孵化階段。由于胚胎從卵裂至囊胚時(shí)期的發(fā)育過(guò)程主要受細(xì)胞質(zhì)成分引導(dǎo)，直至原腸早期，mRNA開(kāi)始大量轉(zhuǎn)錄合成，實(shí)現(xiàn)由母源型向合子型的過(guò)渡，推斷是母源性基因。孵化后仔稚魚(yú)68 d時(shí)，基因表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期，表明的功能可能與圓斑星鰈性腺分化過(guò)程相關(guān)；基因在雌雄成魚(yú)性腺中的表達(dá)量顯著高于其他組織，且卵巢中的表達(dá)量顯著高于精巢，推測(cè)基因在卵巢功能的維持中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為解析圓斑星鰈性別決定機(jī)制提供了新的靶標(biāo)基因，為建立全雌化苗種繁育技術(shù)打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

圓斑星鰈；；基因克??；表達(dá)分析

(P-element-induced wimpy testis)基因?qū)儆贏rgonaute (AGO)蛋白家族，該蛋白家族包括AGO亞家族、PIWI亞家族和亞家族(Kawaji, 2008)。其中，PIWI亞家族主要與piRNA (Piwi- interacting RNAs)結(jié)合形成PIWI/piRNA復(fù)合體，在配子發(fā)生、DNA甲基化及維持基因組完整性等方面起重要作用(Houwing, 2007; Bak, 2011)。PIWI亞家族的研究起步較晚，Lin等(1997)首次在果蠅()卵巢的生殖干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)基因，并證實(shí)該基因在果蠅生殖干細(xì)胞修復(fù)方面扮演重要角色，之后在小鼠() (Kuramochi-Miyagawa, 2001)、秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)()(Cox, 1998)和斑馬魚(yú)()(Tan, 2002)等模式生物中也發(fā)現(xiàn)了同源基因。小鼠中同源基因有和(Kuramochi-Miyagawa, 2001; Carmell, 2007)；秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)和兩個(gè)同源基因(Cox, 1998)；斑馬魚(yú)同源基因有和(Tan, 2002; 李丹等, 2010)。基因在生殖系細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，如原始生殖細(xì)胞(PGC)特化、生殖系細(xì)胞分化和生殖干細(xì)胞(GSC)維持(Megosh, 2006)。基因突變體果蠅表現(xiàn)為生殖干細(xì)胞分裂失調(diào)，最終導(dǎo)致不育(Hartig, 2007)；小鼠的基因分別在精子發(fā)生的不同時(shí)期表達(dá)，、和的基因突變都會(huì)導(dǎo)致雄性個(gè)體的不育(Kim, 2006)；秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中和活性的降低會(huì)導(dǎo)致其生殖細(xì)胞數(shù)目明顯減少(Cox, 1998)；斑馬魚(yú)中和兩個(gè)基因在生殖腺特異性高表達(dá)，突變體的生殖細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞調(diào)亡現(xiàn)象(Houwing, 2007)，突變體的生殖細(xì)胞不能實(shí)現(xiàn)雌雄分化(Houwing, 2014)。研究表明，基因編碼的氨基酸具有2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，分別為PAZ(Piwi Argonaute Zwille)和PIWI(Parker, 2006)。PAZ結(jié)構(gòu)域位于氨基酸鏈中間部分，包括1個(gè)寡聚核苷酸折疊區(qū)，結(jié)合PiRNAs 3￠端的核苷酸突出端；PIWI結(jié)構(gòu)域靠近氨基酸鏈的C末端，具有RNaseH活性(Simon, 2011)，PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域可能在piwi-piRNA通路中起結(jié)合piRNAs的作用。隨后，在鯉魚(yú)()(Zhou, 2012)、鯽魚(yú)()(Tao, 2018)、黃鱔()(Yi, 2014)、尼羅羅非魚(yú)()(Xiao, 2013)、牙鲆()(Wang, 2016)、半滑舌鰨()(張麗燕, 2014)和大菱鲆()(Wang, 2017)等硬骨魚(yú)類(lèi)中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)基因。大菱鲆基因的研究顯示，可能在胚胎和雌雌魚(yú)性腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用(Wang, 2017)；基因是半滑舌鰨雄性精子發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵基因，在精子發(fā)生早期，特別是精原干細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起重要作用(張麗燕, 2014)；基因不僅能決定青鳉()生殖干細(xì)胞數(shù)量，甚至能控制生殖干細(xì)胞的遷移(Li, 2012)。

圓斑星鰈()俗稱(chēng)花斑寶，是一種冷溫型的大型底棲魚(yú)類(lèi)，分布于我國(guó)北部的黃渤海和東海，具有食性范圍廣、生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、口味鮮美等特點(diǎn)，是優(yōu)良的養(yǎng)殖品種。圓斑星鰈在生長(zhǎng)過(guò)程中雌性個(gè)體的生長(zhǎng)明顯快于雄性個(gè)體，同齡雌雄個(gè)體的大小更是相差懸殊(謝忠明等, 2004)。魚(yú)類(lèi)性別決定機(jī)制研究有助于推動(dòng)單性繁育技術(shù)的深入開(kāi)展，目前，圓斑星鰈性別決定和生殖調(diào)控的分子機(jī)制仍不清楚，相關(guān)研究較少。柳學(xué)周等(2013)在圓斑星鰈腦中克隆到3種基因，認(rèn)為可能是圓斑星鰈生殖調(diào)控的關(guān)鍵類(lèi)型；張樂(lè)樂(lè)(2018)分離到2個(gè)性別相關(guān)基因(和)，基因在卵巢特異性高表達(dá)，而基因在精巢高表達(dá)，但在圓斑星鰈中尚未確定性別決定基因。在大菱鲆等鰈形目魚(yú)類(lèi)及其他模式生物中均發(fā)現(xiàn)，基因在生殖細(xì)胞系發(fā)育、胚胎發(fā)育及雌雄性腺發(fā)育等過(guò)程中起著重要的作用，這種功能上的保守性在圓斑星鰈中是否存在值得進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)RACE末端擴(kuò)增技術(shù)得到基因的全長(zhǎng)，分析其序列特征及編碼的蛋白結(jié)構(gòu)，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究基因在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的胚胎、仔稚魚(yú)及雌雄成魚(yú)不同組織的表達(dá)差異，旨在為闡明基因在性別分化和性腺發(fā)育過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

圓斑星鰈受精卵、仔稚魚(yú)和成魚(yú)均取自山東省煙臺(tái)開(kāi)發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司。收集不同發(fā)育時(shí)期的胚胎和仔稚魚(yú)若干，單細(xì)胞期(卵裂前胚盤(pán)隆起時(shí)期)(0 h)、2細(xì)胞期(4 h)、8細(xì)胞期(10 h)、16細(xì)胞期(12 h)、32細(xì)胞期(13 h)、桑椹期(18 h)、高囊胚期(20 h)、低囊胚期(26 h)、原腸早期(27 h)、原腸中期(29 h)、原腸晚期(77 h)、神經(jīng)胚期(98 h)、晶體形成期(136 h)、心跳出現(xiàn)期(163 h)、孵化前期(188 h)、脫膜孵化期(197 h)的胚胎及孵化后5、10、20、30、45、58、68、78、92 d的仔稚魚(yú)，其中，受精卵孵化水溫保持在(8.0± 0.5)℃，DO≥6 mg/L，pH為8.0左右，微量充氣。仔魚(yú)孵出后，移入水泥池培育，隨著其生長(zhǎng)發(fā)育，活動(dòng)能力不斷增強(qiáng)，充氣量也應(yīng)逐漸增大。初孵仔魚(yú)的培養(yǎng)溫度為(8.0±0.5)℃，以后逐日升高0.5℃，直至(12.0±0.5)℃穩(wěn)定培育。再分別采取雌雄成魚(yú)各3尾[體長(zhǎng)(24.0±0.5) cm，體重(330±20) g]的不同組織(腦、眼、鰓、心、肝、腸、脾、性腺、腎及肌肉)。以上樣品均迅速放入裝有RNA later試劑的離心管中，將離心管放入液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)到?80℃冰箱保存，用于總RNA的提取。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

本實(shí)驗(yàn)采用Trizol法分別提取圓斑星鰈各個(gè)發(fā)育時(shí)期的胚胎、仔魚(yú)及雌雄魚(yú)不同組織的總RNA，用紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000 Thermo Scientific)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的濃度及質(zhì)量。cDNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)合成，RACE-cDNA利用SMARTTMRACE cDNA Amplification RACE (TaKaRa)試劑盒合成。

1.3 Vvpiwil2基因全長(zhǎng)克隆

從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找比對(duì)獲得基因部分序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物-S1和-A1(表1)，對(duì)該cDNA序列進(jìn)行驗(yàn)證，以圓斑星鰈成魚(yú)性腺組織的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μl)為：Premix? (LA? Version 2.0) 10 μl、-S1(10 μmol/L) 0.8 μl、-A1(10 μmol/L) 0.8 μl、cDNA (1 μg/μl) 1 μl及ddH2O 6.4 μl。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在紫外線(xiàn)下切膠，之后，用SanPrep柱式DNA凝膠回收試劑盒、pMD18-T Vector試劑盒(TaKaRa)和DH5α進(jìn)行純化、連接與轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定后，篩選目的菌液送至華大基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原始基因cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，確定為基因的核心序列。之后根據(jù)基因的核心序列設(shè)計(jì)特異性引物3￠GSP-1、3￠GSP-2、5￠GSP-1及5￠GSP-2，利用巢式PCR反應(yīng)獲得目的片段，PCR反應(yīng)體系(20 μl)：Premix?(LA? Version 2.0) 10 μl、3￠或5￠特異性引物0.8 μl、UPM 0.8 μl、RACE- cDNA 1 μl及ddH2O 6.4 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將目的片段進(jìn)行切膠回收、純化、連接、轉(zhuǎn)化、挑取陽(yáng)性單克隆，最終將經(jīng)過(guò)菌落PCR鑒定的目的菌液送到華大基因公司測(cè)序。

表1 本研究所使用的引物

Tab.1 Nucleotide sequences of the PCR primers used in this study

1.4 Vvpiwil2基因序列分析

使用軟件Contig Express對(duì)基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接、驗(yàn)證，利用ORF Finder (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)預(yù)測(cè)基因的開(kāi)放閱讀框。利用ExPASy(https://web.expasy. org/compute_pi/)、SMART(http://smart.emblheidelberg. de/)、Signal4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線(xiàn)生物學(xué)軟件分析編碼蛋白的基本物理性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域。用NCBI搜索同源蛋白序列，并使用DNAMAN軟件對(duì)其進(jìn)行蛋白序列的多重比較，利用MEGA5.2(Tamura, 2011)軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)基因的核心序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物RT-A/S，β-actin-A/S作為內(nèi)參，以不同發(fā)育時(shí)期的胚胎、仔稚魚(yú)及雌雄成魚(yú)的不同組織的cDNA為模板，使用Applied Biosystems? 7500 Real Time PCR instrument定量?jī)x，采用2–??Ct的計(jì)算方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。20 μl反應(yīng)體系: SYBR Premix Ex(2×) 10 μl、ROX Reference Dye Ⅱ (50x) 0.4 μl、RT-piwil2-S (10 μmol/L) 0.8 μl、RT-piwil2-A (10 μmol/L) 0.8 μl、cDNA(50ng/μl) 2 μl及ddH2O 6 μl，反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理為基因相對(duì)表達(dá)量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)，生物學(xué)重復(fù)=3。使用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比較，<0.05表示差異顯著，并用OriginPro 2017軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 Vvpiwil2基因序列特征及其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)分析

克隆得到基因全長(zhǎng)為3872 bp，將其命名為，其開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)為3192 bp，編碼1063個(gè)氨基酸，5￠-UTR和3￠-UTR分別長(zhǎng)140 bp和540 bp。經(jīng)過(guò)ExPASy、SMART、Signal4.1和NCBI在線(xiàn)生物學(xué)軟件分析，推斷的1063個(gè)氨基酸分子量為118.6 kDa，理論等電點(diǎn)為9.02，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽，有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為428~473位46個(gè)氨基酸的ArgoL1結(jié)構(gòu)域、477~616位140個(gè)氨基酸的PAZ結(jié)構(gòu)域及602~1046位445個(gè)氨基酸的PIWI結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.2 Vvpiwil2基因同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究基因在胚胎發(fā)育中的表達(dá)量。結(jié)果顯示(圖4)，基因在整個(gè)胚胎發(fā)育階段都有表達(dá)，從發(fā)育早期開(kāi)始直到高囊胚期都大量表達(dá)，之后呈下降趨勢(shì)，直至孵化階段。研究基因在仔魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)量，結(jié)果顯示(圖5)，基因在68 d時(shí)的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(<0.05)。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究基因在雌雄成魚(yú)各個(gè)組織的表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖6。基因在雌雄成魚(yú)的各個(gè)組織中均有表達(dá)。在雄魚(yú)中，基因在精巢的表達(dá)量顯著高于其他組織(<0.05)；在雌魚(yú)中，基因在卵巢的表達(dá)量也顯著高于其他組織(<0.05)。雌雄成魚(yú)之間進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，基因在卵巢中的表達(dá)量顯著高于精巢(<0.05)；此外，雄性成魚(yú)的腦、眼的表達(dá)量高于雌性成魚(yú)，雌性成魚(yú)的心臟、肝的表達(dá)量高于雄性成魚(yú)。

圖1 Vvpiwil2基因cDNA序列全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列

起始密碼子ATG和終止密碼子TGA均用黑色陰影標(biāo)出，PolyA用下劃線(xiàn)標(biāo)出，ArgoL1結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域及PIWI結(jié)構(gòu)域分別用雙線(xiàn)邊框、單線(xiàn)邊框及灰色陰影標(biāo)出

Start codon (ATG) and stop codon (TGA) are marked with dark shadow, and PolyA is marked with underline. The ArgoL1, PAZ and PIWI domains are separately marked with double lines border, single line border and gray shadow

圖2 Vvpiwil2基因編碼氨基酸與其他物種piwil2基因編碼氨基酸的多序列比對(duì)

Black frame: PZA domain; Red frame: PIWI domain

黑色邊框?yàn)镻ZA結(jié)構(gòu)域，紅色邊框?yàn)镻IWI結(jié)構(gòu)域

The GenBank accession numbers ofgene are followed:(XP_019949653.1),(XP_018524808.1),(XP_023249908.1),(AQY15996.1),(XP_020445956.1),(XP_003445710.1),(NP_001281165.1)

圖3 piwil2氨基酸序列NJ進(jìn)化樹(shù)

The GenBank accession numbers ofgene are following:(XP_019949653.1),(XP_018524808.1),(XP_023249908.1),(AQY15996.1),(XP_020445956.1),(XP_003445710.1),(NP_001281165.1),(ACH96370.1),(NP_001153909.1),(NP_060538.2),(NP_067283.1),(NP_001106470.1)

圖4 Vvpiwil2基因在胚胎發(fā)育不同階段中的表達(dá)

1: 單細(xì)胞期; 2: 2細(xì)胞期; 8: 8細(xì)胞期; 16: 16細(xì)胞期; 32: 32細(xì)胞期; M: 桑椹胚期; Hb: 高囊胚期; Lb: 低囊胚期; Eg: 原腸早期; Mg: 原腸中期; Lg: 原腸晚期; N: 神經(jīng)胚期; El: 晶體形成期; Hp: 心跳出現(xiàn)期; Bh: 孵化前期; H: 脫膜孵化

不同字母間表示差異顯著(<0.05)，下同

1: 1-cell stage; 2: 2-cell stage; 8: 8-cell stage; 16: 16-cell stage; 32: 32-cell stage; M: Morula stage; Hb: High blastula; Lb: Low blastula; Eg: Early gastrula; Mg: Mid gastrula; Lg: Late gastrula; N: Neurula stage; El: Formation of eye len; Hp: Heart pulsation; Bh: Before the hatch; H: Hatching

Different letters indicate significant difference (<0.05), the same as below

圖5 Vvpiwil2基因在不同發(fā)育時(shí)期仔魚(yú)中的表達(dá)

3 討論

本研究從實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的圓斑星鰈轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找比對(duì)獲得基因部分序列，通過(guò)RACE末端擴(kuò)增技術(shù)獲得基因，將其命名為，基因全長(zhǎng)為3872 bp，ORF長(zhǎng)為3192 bp，編碼一個(gè)由1063個(gè)氨基酸組成的多肽。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，包括圓斑星鰈在內(nèi)的魚(yú)類(lèi)均含有保守的PAZ結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域，表明基因表達(dá)的蛋白具有結(jié)合小分子RNA的潛力。分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，圓斑星鰈與硬骨魚(yú)類(lèi)單獨(dú)聚成了一支，Houwing等(2014)的研究顯示，斑馬魚(yú)基因在生殖細(xì)胞分化中起重要作用，Li等(2012)研究表明，在青鳉中基因不僅能決定生殖干細(xì)胞數(shù)量，甚至能控制生殖干細(xì)胞的遷移。在進(jìn)化樹(shù)中，圓斑星鰈與鰈形目中的牙鲆、大菱鲆及半滑舌鰨關(guān)系較近，大菱鲆基因可能在胚胎和雌雄性腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而半滑舌鰨基因在雄性精子發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，特別是在精原干細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中起重要作用?；谙到y(tǒng)進(jìn)化分析，推測(cè)基因在圓斑星鰈可能具有相似的功能，即在生殖細(xì)胞系發(fā)育、胚胎發(fā)育及雌雄性腺發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖6 Vvpiwil2基因在不同組織中的表達(dá)

Br: 腦; Ey: 眼; Gi: 鰓; He: 心臟; Li: 肝臟; In: 腸; Sp: 脾; Go: 性腺; Ki: 腎; Mu: 肌肉

Br: Brain; Ey: Eye; Gi : Gill; He: Heart; Li: Liver; In: Intestines; Sp: Spleen; Go: Gonad; Ki: Kidney; Mu: Muscle

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)基因在胚胎發(fā)育不同階段的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，該基因在整個(gè)胚胎發(fā)育期間都有表達(dá)，從發(fā)育早期直到高囊胚期都呈高表達(dá)，之后開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，直至孵化階段，這一表達(dá)模式與斑馬魚(yú)(Tan, 2002)、青鳉(李名友, 2008)相似。從卵裂開(kāi)始至囊胚時(shí)期的發(fā)育階段主要受細(xì)胞質(zhì)成分引導(dǎo)，一直到卵裂較晚的原腸早期，胚胎mRNA才大量轉(zhuǎn)錄合成，實(shí)現(xiàn)由母源型向合子型的過(guò)渡，因此，認(rèn)為基因是母源性基因。研究基因在不同發(fā)育時(shí)期仔魚(yú)中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，基因在仔魚(yú)68 d時(shí)的表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育時(shí)期。張樂(lè)樂(lè)(2018)研究表明，圓斑星鰈仔魚(yú)在60日齡左右性腺開(kāi)始分化，幼魚(yú)出現(xiàn)卵巢腔，與本研究中基因表達(dá)量顯著上升的時(shí)間接近，表明基因可能在圓斑星鰈的性別分化過(guò)程中發(fā)揮功能。張麗燕(2014)研究表明，基因不是性別分化的相關(guān)基因，半滑舌鰨的基因與雄魚(yú)精子發(fā)生相關(guān)，主要作用于精子發(fā)生的早期階段，而非性別分化期，表明基因的功能存在一定的種間差異。

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)雌雄魚(yú)中基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，基因在精巢與卵巢中的表達(dá)量均顯著高于其他組織，與大菱鲆(Wang, 2017)、半滑舌鰨(張麗燕, 2014)、斑馬魚(yú)(Tan, 2003)及青鳉(Zhao, 2012)的同源基因表達(dá)相似，與人和鼠等哺乳動(dòng)物僅在精巢中特異表達(dá)不同(Zeeman, 2002; Beyret, 2011)?；蛟趫A斑星鰈卵巢中的表達(dá)量顯著高于精巢，說(shuō)明基因可能在卵巢功能的維持中發(fā)揮重要作用。這一結(jié)果與大菱鲆中的表達(dá)相似，但在半滑舌鰨、斑馬魚(yú)等研究中，基因在精巢的表達(dá)量顯著高于卵巢，再次表明基因的功能在不同種類(lèi)間存在一定差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，基因在腦、眼、鰓、心臟、肝、腸、脾、腎及肌肉組織中均有表達(dá)，并且雄魚(yú)的腦、眼的表達(dá)量高于雌魚(yú)，雌魚(yú)的心臟、肝的表達(dá)量高于雄魚(yú)。李名友(2008)研究發(fā)現(xiàn)，在青鳉中不僅在性腺組織中大量表達(dá)，在眼和腦組織中也有表達(dá)；Tao等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)和除在性腺中大量表達(dá)外，在骨骼肌中也有表達(dá)；Wang等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，在大菱鲆中還在肌肉、鰓和腎臟在內(nèi)的體細(xì)胞組織中表達(dá)，認(rèn)為Piwi蛋白不僅在生物生殖發(fā)育過(guò)程中是必需的，而且在體細(xì)胞組織中也發(fā)揮重要功能；張麗燕等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨基因在脾臟、肝臟、心肌、腸、腦、皮膚、腎臟、肌肉、鰓及血液中也有微量表達(dá)。本研究也表明，基因不僅在性別分化等生殖發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，而且在其他的生命過(guò)程中也具有重要功能。關(guān)于基因在圓斑星鰈雄魚(yú)的腦、眼的表達(dá)量高于雌魚(yú)，雌魚(yú)的心臟、肝的表達(dá)量高于雄魚(yú)這一結(jié)論，尚未在其他相關(guān)物種中發(fā)現(xiàn)相似觀點(diǎn)，仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究以圓斑星鰈性腺為模板，擴(kuò)增得到了基因全長(zhǎng)，并將其命名為。在線(xiàn)保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，基因具有PIWI亞家族典型的PAZ結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)圓斑星鰈不同發(fā)育時(shí)期胚胎、仔稚魚(yú)的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，基因?yàn)槟冈葱曰?，可能與圓斑星鰈性腺分化過(guò)程相關(guān)。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，基因在雌雄成魚(yú)性腺中的表達(dá)量顯著高于其他組織中，卵巢中的表達(dá)量顯著高于精巢，推測(cè)基因可能在卵巢功能的維持中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為解析圓斑星鰈性別決定機(jī)制提供了新的靶標(biāo)基因，為建立全雌化苗種繁育技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。

Bak CW, Yoon TK, Choi Y. Functions of PIWI proteins in spermatogenesis. Clinical and Experimental Reproductive Medicine, 2011, 38(2): 61–67

Beyret E, Lin H. Pinpointing the expression of piRNAs and function of the PIWI protein subfamily during spermatogenesis in the mouse. Developmental Biology, 2011, 355(2): 215– 226

Carmell MA, Girard A, van de Kant HJG,. MIWI2 is essential for spermatogenesis and repression of transposons in the mouse male germline. Developmental Cell, 2007, 12(4): 503–514

Cox DN, Chao A, Baker J,. A novel class of evolutionarily conserved genes defined byare essential for stem cell self-renewal. Genes and Development, 1998, 12(23): 3715– 3727

Hartig JV, Tomari Y, Frstemann K. piRNAs-the ancient hunters of genome invaders. Genes and Development, 2007, 21(14): 1707–1713

Houwing S, Kamminga LM, Berezikov E,. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in zebrafish. Cell, 2007, 129(1): 69–82

Houwing S, Berezikov E, Ketting RF. Zili is required for germ cell differentiation and meiosis in zebrafish. European Molecular Biology Organization, 2014, 27(20): 2702–2711

Kawaji H, Hayashizaki Y. Exploration of small RNAs. Public Library of Science Genetics, 2008, 4(1): 3–8

Kim VN. Small RNAs just got bigger: Piwi-interacting RNAs (piRNAs) in mammalian testes. Genes and Development, 2006, 20(15): 1993–1997

Kuramochi-Miyagawa S, Kimura T, Yomogida K,. Two mouse-related genes:and. Mechanisms of Development,2001, 108(1): 121–133

Li D, Sun HQ, Zhao J,. Initial study on zili functions to the development of the germ layers during zebrafish early embryogenesis. Journal of Sichuan University (Medical Science), 2010, 41(6): 923–926 [李丹, 孫華欽, 趙君, 等. zili在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育胚層分化中作用的初步研究. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2010, 41(6): 923–926]

Li M, Hong N, Gui J,. Medaka piwi is essential for primordial germ cell migration. Current Molecular Medicine, 2012, 12(8): 1040–1049

Li MY. Expression and functional analysis ofandin Medaka. Doctoral Dissertation of Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, 2008 [李名友. 青鳉和基因的表達(dá)模式和功能分析. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所博士研究生學(xué)位論文, 2008]

Lin H, Spradling AC. A novel group ofmutations affects the asymmetric division of germline stem cells in theovary. Development, 1997, 124(12): 2463–2476

Liu XZ, Xu YJ, Liao MJ,. Cloning and expression characteristics of gonadotropin releasing hormone genes in spotted halibut. Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(1): 12–24 [柳學(xué)周, 徐永江, 廖梅杰, 等. 圓斑星鰈促性腺激素釋放激素基因克隆及表達(dá)特性. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2013, 20(1): 12–24]

Megosh HB, Cox DN, Campbell C,. The role of PIWI and the miRNA machinery in Drosophila germline determination. Current Biology, 2006, 16(19): 1884–1894

Parker JS, Barford D. Argonaute: A scaffold for the function of short regulatory RNAs. Trends in Biochemical Sciences, 2006, 31(11): 622–630

Simon B, Kirkpatrick JP, Eckhardt S,. Recognition of 2'-O-methylated 3'-end of piRNA by the PAZ domain of a Piwi protein. Structure, 2011, 19(2): 172–180

Tamura K, Peterson D, Peterson N,. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731–2739

Tan CH, Lee TC, Weeraratne SD,., the zebrafish homologue of the Drosophila: Co-localization with vasa at the embryonic genital ridge and gonad-specific expression in the adults. Mechanisms of Development, 2002, 119(2): S221–S224

Tao M, Li S, Song C,. Elevated expression ofgene in the pituitaries of allotriploid crucian carp. Journal of the World Aquaculture Society, 2018, 49(2): 302–314

Tao W, Sun L, Chen J,. Genomic identification, rapid evolution, and expression of Argonaute genes in the tilapia,. Development Genes and Evolution, 2016, 226(5): 339–348

Wang CL, Wang ZP, Wang JQ,. Identification of candidate piRNAs in the gonads of(Japanese flounder). Zoological Research, 2016, 37(5): 301–306

Wang H, Wang B, Liu X,. Identification and expression ofin turbot, with implications of the involvement in embryonic and gonadal development. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2017, 208–209: 84–93

Xiao J, Zhou Y, Luo Y,. Suppression effect of LHRH-A and hCG on Piwi expression in testis of Nile tilapia. General and Comparative Endocrinology, 2013, 189(1): 43–50

Xie ZM, Chen SQ, Zhang Y,. Fish culture technology of flatfish sole. Beijing: Jindun Publishing House, 2004 [謝忠明, 陳四清,張巖, 等. 鰈鰨魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖技術(shù). 北京: 金盾出版社, 2004]

Yi M, Chen F, Luo M,. Rapid evolution of piRNA pathway in the teleost fish: Implication for an adaptation to transposon diversity. Genome Biology and Evolution, 2014, 6(6): 1393–1407

Zeeman AM. Molecular characterization of, a human member of thegene family whose overexpression is correlated to seminomas. Oncogene, 2002, 21(25): 3988– 3999

Zhang LL. The study of gonadal differentiation process and sex-related gene,of spotted halibut. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2018 [張樂(lè)樂(lè). 圓斑星鰈性腺分化過(guò)程及性別相關(guān)基因的研究. 上海海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2018]

Zhang LY. Molecular cloning and expression analysis ofandgene in the half-smooth tongue-sole,. Master′s Thesis of Dalian Ocean University, 2014 [張麗燕. 半滑舌鰨和基因的克隆與表達(dá)分析. 大連海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2014]

Zhao H, Duan J, Cheng N,. Specific expression ofandin medaka () germ cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 418(4): 592–597

Zhou Y, Wang F, Liu S,. Human chorionic gonadotropin suppresses expression of Piwis in common carp () ovaries. General and Comparative Endocrinology, 2012, 176(2): 126–131

Cloning and Expression of theGene in the Spotted Halibut ()

YANG Zhenzhen1,2, BIAN Li2,3, ZHANG Yan2,3, CHANG Qing2,3, CHEN Siqing2,3①, LIU Changlin2,3, GE Jianlong2,3, HU Jiancheng2,3, ZHANG Shengnong2

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

The spotted halibut () is a rare and valuable marine fish species that inhabits the coast of northern China. Mature females are much larger than males because of their faster growth rate. It will create substantial economic benefits to establish an all-female breeding technique for. A better understanding of sex-related genes will contribute to the improvement of a single-sex breeding technique. In this study, we successfully isolated thegene of, which was namedThe total length was 3872 bp, including a 3192 bp open reading frame (ORF), encoding 1063 amino acids; the 5′UTR was 140 bp and the 3′UTR was 540 bp. Based on ExPASy, SMART, Signal4.1, and the NCBI Conservative Domain Database (CDD) biological analysis, the ORF encoded a putative protein, with a predicted molecular weight of 118.6 kDa and an isoelectric point of 9.02. No transmembrane structure or signal peptide site was detected. There were three domains: the ArgoL1, PAZ, and PIWI domains. Real-time fluorescence quantitative PCR technique was used to analyze the expression patterns of thegene at different stages of embryo and larvae. The results showed that thegene was abundantly expressed from early development to the high blastocyst stage, and then declined until the hatching stage. The developmental stage of the embryo from cleavage to the blastocyst stage was mainly guided by the cytoplasmic component. The mRNAs began to be transcribed and synthesized in a large amount at the early gastrula stage, then the transition from maternal to zygote occurred. Therefore, the results indicated that thegene was a maternal gene. After hatching, the expression of thegene at 68 days post hatching was significantly higher than during other stages, which demonstrated that thegene was associated with gonadal differentiation. The expression level of thegene in gonads was significantly higher than in other tissues, and the expression level in the ovary was significantly higher than in the testis, revealing that thegene might play an important role in the maintenance of ovarian functions. The results of this study provide a potential sex determinant gene forand lay a solid theoretical foundation for the establishment of an all-female breeding technique.

;; Genecloning; Expression analysis

S917.4

A

2095-9869(2020)02-0103-10

陳四清，研究員，E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

2019-01-30,

2019-03-05

* 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022016005)資助 [This work was supported by Special Scientific Research Funds for Non-Profit Institute, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (20603022016005)]. 楊珍珍，E-mail: 1163603557@qq.com

10.19663/j.issn2095-9869.20190130001

http://www.yykxjz.cn/

楊珍珍, 邊力, 張巖, 常青, 陳四清, 劉長(zhǎng)琳, 葛建龍, 胡建成, 張盛農(nóng). 圓斑星鰈基因的克隆與表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(2): 103–112

Yang ZZ, Bian L, Zhang Y, Chang Q, Chen SQ, Liu CL, Ge JL, Hu JC, Zhang SN. Cloning and expression of thegene in the spotted halibut (). Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 103–112

CHEN Siqing, E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

(編輯 馮小花)