邱立強(qiáng)，李雯靜，夏豪，江洪，徐昌武

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人群生活方式的改變，心血管疾病發(fā)病率逐年升高，心血管疾病死亡為城鄉(xiāng)居民死亡首因[1]。當(dāng)前，介入治療手段已成為治療心血管疾病的重要方法[2-3]，然而術(shù)后新生內(nèi)膜過度增生和靶血管再狹窄的發(fā)生往往導(dǎo)致手術(shù)失敗[4-5]。研究表明，術(shù)后局部炎癥反應(yīng)在血管內(nèi)再狹窄的發(fā)生和發(fā)展中頗為關(guān)鍵[6-7]。斑蝥素是傳統(tǒng)中藥斑蝥的主要活性成分，本課題組在前期研究[8]中發(fā)現(xiàn)，斑蝥素可顯著抑制大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖和遷移，且作用機(jī)制可能與包括核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）在內(nèi)的多種信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬在這一現(xiàn)象的基礎(chǔ)上，通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)一步探討斑蝥素抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移與NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的關(guān)系，并在大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷模型中進(jìn)一步驗(yàn)證斑蝥素對(duì)損傷血管內(nèi)膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

250～300 g SD 健康雄性大鼠購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心；斑蝥素、二甲基亞砜（DMSO）和脂多糖（LPS）購自美國(guó)Sigma 公司，吡咯烷二硫代氨甲基甲酸鹽（PDTC）購自北京索萊寶生物公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）檢測(cè)試劑盒（ELISA 試劑盒）購自美國(guó)ImmunoWay 生物公司。Fogarty 球囊導(dǎo)管購自美國(guó)Edwards Lifescience公司；萊卡熒光倒置顯微鏡及拍照系統(tǒng)購自德國(guó)Lecia 公司；杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)混合物F-12（DMEM/F12）、1×磷酸鹽緩沖液（PBS，137 mmol/L 氯化鈉，2.7 nmol/L 氯化鉀和10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH：7.3～7.5）購自美國(guó)HyClone 公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司；雙抗購自杭州吉諾公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所；NF-κB p65（p65）、磷酸化NF-κB p65（p-p65）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、TNF-α 和IL-6 抗體均購自美國(guó)CST 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自美國(guó)merck-millipore。

1.2 斑蝥素對(duì)VSMC 遷移的影響

VSMC 的分離培養(yǎng)與鑒定：關(guān)于大鼠胸主動(dòng)脈VSMC 分離培養(yǎng)和細(xì)胞鑒定等具體實(shí)驗(yàn)方法可見本課題組前期研究成果[8]，本文不再贅述。

實(shí)驗(yàn)分組：（1）對(duì)照組；（2）1 μg/ml LPS 刺激組（LPS 組）；（3）LPS 刺激后加用5 μmol/L 斑蝥素組（斑蝥素組）；（4）LPS 刺激后加用80 μmol/L PDTC 處理組（PDTC 組）；（5）LPS 刺激后加用5 μmol/L 斑蝥素和80 μmol/L PDTC 處理組（斑蝥素+PDTC 組）；共5 組。

傷口愈合實(shí)驗(yàn)：如文獻(xiàn)[9]所述，將細(xì)胞按1.0×105個(gè)/孔種植于6 孔板內(nèi)。待細(xì)胞完全覆蓋6 孔板底壁后，用1 ml 槍頭在6 孔板內(nèi)劃兩條垂直直線，并用PBS 清洗以除去漂浮細(xì)胞。然后在含有LPS 的培養(yǎng)液中加入斑蝥素或PDTC 處理。在相同位置分別照取0 h 和36 h 的圖像，觀察細(xì)胞遷移情況。細(xì)胞遷移率分析使用Image J 1.51 w 軟件進(jìn)行處理，細(xì)胞遷移率=劃痕面積（0 h）-劃痕面積（36 h）/劃痕面積（0 h）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

Transwell 實(shí)驗(yàn)：如文獻(xiàn)[10]中所述，用含或不含相應(yīng)濃度斑蝥素或PDTC 的培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為5.0×105個(gè)/ml，然后每組每孔取200 μl 種植于上室，下室加入600 μl 含15% FBS 的培養(yǎng)基，添加或不添加LPS，于培養(yǎng)箱中孵育12 h 后取出；并將小室用PBS 小心沖洗3 次，用棉簽將小室內(nèi)面未穿過的細(xì)胞輕輕擦去，并用4%的多聚甲醛室溫固定20 min 后用PBS 小心沖洗3 次；然后將小室放入1 μg/ml 的DAPI 中染色2 min，用PBS 洗滌后在熒光顯微鏡200 倍下隨機(jī)選取5 個(gè)視野并拍照，最后使用Image J 1.51w 軟件（美國(guó)NIH）計(jì)算穿過小室的細(xì)胞數(shù)。

蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)：細(xì)胞總蛋白提取后，使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定其蛋白濃度，具體方法見文獻(xiàn)[11]，然后加入上樣緩沖液煮沸后備用。按每孔30 μg 總蛋白于預(yù)先配置好的12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)行蛋白分離。然后電轉(zhuǎn)至預(yù)先活化好的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。電轉(zhuǎn)完成后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。PBST（1×PBS含0.1%的吐溫-20）洗滌3 次×5 min 后，分別與p65、p-p65、MMP-9 及GAPDH 一抗4℃孵育過夜。取出PVDF 膜用PBST 洗滌3 次×5 min，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫下孵育1 h。然后用PBST 洗滌3 次×5 min。以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，用ECL 顯色法于膜上顯色后進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Image Lab Software分析目的條帶的灰度值。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來自3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3 斑蝥素對(duì)頸動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠的影響

動(dòng)物分組及給藥：采用隨機(jī)數(shù)字表法將30 只SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、損傷組和斑蝥素組，每組10 只。斑蝥素組按2 mg/kg 劑量腹腔注射斑蝥素，假手術(shù)組與損傷組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模前1 周開始給藥，每天1 次，連續(xù)給藥3 周。

大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型的建立：依據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道方法進(jìn)行。在手術(shù)前禁食12 h，采用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉，在靜脈內(nèi)注射100 U/kg 肝素鈉后暴露左側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈。使用顯微血管夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)和頸總動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，并在近心端帶線，使用眼科剪在頸外動(dòng)脈距離動(dòng)脈分叉處約2 mm 處剪一“V”型切口，并將帶導(dǎo)引導(dǎo)絲的球囊（球囊直徑1.25 mm，長(zhǎng)度15 mm）從頸外動(dòng)脈的切口處向頸總動(dòng)脈近心端傳送，當(dāng)球囊距離頸總動(dòng)脈分叉約3 cm 處時(shí)退出導(dǎo)絲，使用壓力泵向球囊注水充盈球囊貼至血管壁后，維持該壓力上下旋轉(zhuǎn)拖曳球囊3 次，然后退出球囊并結(jié)扎頸外動(dòng)脈，松開血管夾恢復(fù)頸內(nèi)動(dòng)脈血流，最后縫合皮膚。假手術(shù)組不插入球囊導(dǎo)管，其余手術(shù)操作相同。

頸總動(dòng)脈內(nèi)膜檢測(cè)：將大鼠固定在操作臺(tái)上，麻醉后暴露左側(cè)損傷頸總動(dòng)脈并將其剪下后，立即放入生理鹽水中沖去管腔中血液，然后放入4%的多聚甲醛中浸泡固定，經(jīng)石蠟包埋、切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，并通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MMP-9、p65、TNF-α 和IL-6 的表達(dá)。

血清中TNF-α 和IL-6 濃度檢測(cè)：大鼠麻醉后經(jīng)下腔靜脈取血并以2 100 g 的離心力離心15 min，收集上清液于-80℃冰箱保存，待血液標(biāo)本收集完全后按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行ELISA 法檢測(cè)血清中TNF-α 和IL-6 濃度。

圖像分析及免疫組織化學(xué)半定量分析：HE 染色和免疫組織化學(xué)染色完成后拍取照片，使用Image J 1.51w 軟件分別測(cè)量各組標(biāo)本HE 切片中大鼠頸總動(dòng)脈增生內(nèi)膜面積和中膜面積，單位用像素（Pixels）表示，并計(jì)算出增生內(nèi)膜面積與中膜面積比值。使用軟件內(nèi)免疫組化圖像處理插件測(cè)量免疫組織化學(xué)目標(biāo)蛋白的平均吸光度（MD），并應(yīng)用該數(shù)值描述目標(biāo)蛋白在增生內(nèi)膜和血管壁中的表達(dá)強(qiáng)度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：以 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或率表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 斑蝥素對(duì)VSMC 遷移的影響（表1）

傷口愈合實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組比較，LPS 組細(xì)胞遷移率增加61.3%（P＜0.01）；而斑蝥素組、PDTC組及斑蝥素+PDTC 組細(xì)胞遷移率較LPS 組均顯著減少（P 均＜0.01）；另外，與斑蝥素組比較，斑蝥素+PDTC 組細(xì)胞遷移率差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：LPS 組細(xì)胞穿過小室的數(shù)量較對(duì)照組顯著增多（P＜0.01）；而斑蝥素組、PDTC組及斑蝥素+PDTC 組，穿過小室的細(xì)胞數(shù)較LPS組均明顯減少（P 均＜0.01）；另外，與斑蝥素組比較，斑蝥素+PDTC 組穿過小室的細(xì)胞數(shù)差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 斑蝥素對(duì)各組血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響（）

表1 斑蝥素對(duì)各組血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響（）

注：LPS：脂多糖；PDTC：吡咯烷二硫代氨甲基甲酸鹽。與對(duì)照組相比**P＜0.01；與LPS 組相比ΔΔP＜0.01。傷口愈合實(shí)驗(yàn)（n=6）；Transwell實(shí)驗(yàn)（n=5）

2.2 斑蝥素對(duì)VSMC 內(nèi)蛋白表達(dá)的影響（圖1）

與對(duì)照組比較，LPS 組VSMC 內(nèi)MMP-9 和p-p65表達(dá)分別增加2.97 倍和1.24 倍（P 均＜0.05）；而與LPS 組比較，斑蝥素組MMP-9 和p-p65 表達(dá)分別減少63.4%和46.9%（P 均＜0.05）；PDTC 組MMP-9和p-p65 表達(dá)較LPS 組比較，也分別減少37.8%和25.2%（P 均＜0.05）；另外，與斑蝥素組比較，斑蝥素+PDTC 組細(xì)胞內(nèi)MMP-9 和p65 表達(dá)差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而p65 水平在各組間表達(dá)差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 斑蝥素對(duì)VSMC 內(nèi)蛋白表達(dá)的影響（n=3）

2.3 斑蝥素對(duì)損傷的大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜的影響（圖2）

HE 染色結(jié)果顯示，損傷組與假手術(shù)組比較，血管內(nèi)膜增生面積[（4.62±0.96）像素 vs（0.33±0.33）像素，P＜0.01]和內(nèi)膜/中膜面積比值[（68.21±16.11）%vs（9.39±5.80）%，P＜0.01]均顯著增加；而斑蝥素組較損傷組血管內(nèi)膜增生面積減少62.3%[（1.74±0.70）像素vs（4.62±0.96）像素，P＜0.01]，內(nèi)膜/中膜比值減少48.0%[（35.46±16.07）% vs（68.21±16.11）%，P＜0.01]。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示（表2），與損傷組比較，斑蝥素組血管內(nèi)膜中p65 表達(dá)降低38.4%（P＜0.01），TNF-α 和IL-6 的表達(dá)較損傷組分別降低56.3%和53.2%（P＜0.01）；另外，與損傷組比較，斑蝥素組血管內(nèi)膜中MMP-9 表達(dá)降低42.8%（P＜0.05）。

圖2 HE 染色檢測(cè)斑蝥素對(duì)損傷的大鼠頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生的影響（×100，n=3）

2.4 斑蝥素對(duì)大鼠血清中TNF-α 和IL-6 含量的影響（表2）

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與損傷組比較，斑蝥素組大鼠血清內(nèi)TNF-α 和IL-6 濃度明顯降低（P＜0.05）；另外與假手術(shù)組比較，損傷組大鼠血清內(nèi)TNF-α 和IL-6 濃度升高（P＜0.01）。

表2 斑蝥素對(duì)大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜和血清中炎性分子表達(dá)水平的影響（）

表2 斑蝥素對(duì)大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜和血清中炎性分子表達(dá)水平的影響（）

注：p65：核轉(zhuǎn)錄因子κB p65；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-6：白細(xì)胞介素-6；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；MD：平均吸光度。與損傷組比*P＜0.05 **P＜0.01；與假手術(shù)組比ΔΔP＜0.01

3 討論

心血管疾病是全世界因疾病造成死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅人類生命健康[13]。心血管疾病經(jīng)支架置入治療后引起的內(nèi)皮損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，是血管內(nèi)再狹窄發(fā)生的重要原因之一。因此，抑制血管炎癥反應(yīng)在治療血管再狹窄中具有重要意義。斑蝥素是傳統(tǒng)中藥斑蝥的有效提取成分，是一種選擇性蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制劑[14]。PP2A 是細(xì)胞內(nèi)最重要的磷酸酶之一，參與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)錄等在內(nèi)的多種重要的生理過程[15]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，斑蝥素顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與包括NF-κB 在內(nèi)的多條信號(hào)通路密切相關(guān)。

眾所周知，NF-κB 信號(hào)通路在炎癥相關(guān)疾病中扮演重要角色。NF-κB 由p50 和p65 兩個(gè)亞基組成[16]。Landry 等[17]發(fā)現(xiàn)，在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后p50 和p65 被激活，而其抑制性蛋白IκB-α水平顯著降低。事實(shí)上，抑制NF-κB 信號(hào)通路激活可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而減少血管損傷后新生內(nèi)膜的形成。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 可誘導(dǎo)VSMC 內(nèi)NF-κB p65 的表達(dá)，并促進(jìn)VSMC 遷移；而在LPS 刺激VSMC 的同時(shí)加用斑蝥素進(jìn)行處理后，VSMC 的遷移能力以及NF-κB p65 的表達(dá)水平均顯著降低，表明斑蝥素抑制VSMC 遷移與其抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，與PDTC 組比較，斑蝥素組VSMC 遷移能力更弱，推測(cè)斑蝥素在抑制VSMC 遷移的過程中可能還涉及NF-κB 信號(hào)通路以外的其它通路。

VSMC 遷移的前提條件是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜的降解[18]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）能特異性與ECM 相結(jié)合并降解ECM 成分，從而促進(jìn)VSMC遷移至血管內(nèi)膜[19]。MMP-9 作為MMP 家族中的重要成員，在基質(zhì)降解、VSMC 遷移等過程中起重要作用[20-21]。本研究結(jié)果顯示，含有斑蝥素的不同組別中MMP-9 的表達(dá)均有所降低，推測(cè)斑蝥素抑制VSMC 的遷移與其抑制VSMC 中MMP-9 表達(dá)有關(guān)。

總之，本研究表明，斑蝥素可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的VSMC 遷移以及球囊損傷大鼠頸總動(dòng)脈新生內(nèi)膜的過度增生；而發(fā)揮作用的機(jī)制至少與斑蝥素抑制NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)。這為進(jìn)一步研究斑蝥素對(duì)VSMC 的生物學(xué)活性作用奠定了基礎(chǔ)，為治療與VSMC 遷移功能密切相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化及血管再狹窄提供了理論基礎(chǔ)。