黎飚 李海 黃凌凌 顧建忠 楊潔 方曉燕

(右江民族醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,廣西 百色 533000)

摘除卵巢(OVX)是老年女性骨質(zhì)疏松最為經(jīng)典動(dòng)物造模。OVX影響骨組織，引起骨質(zhì)疏松，對(duì)其相關(guān)模型動(dòng)物治療研究較多，但OVX對(duì)骨組織影響同時(shí)，是否影響到骨中造血組織，從而影響到紅細(xì)胞和血紅蛋白水平，這方面研究還未見報(bào)道。研究觀察烏圓口服液及山茶籽聯(lián)合烏圓口服液對(duì)OVX大鼠骨組織及血液影響。

1 材料和方法

1.1材料和設(shè)備 選用80只5月齡雌性SPF級(jí)大鼠，用上海那艾精密NAI3537型血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)器,對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用美國(guó)DS-5糖化血紅蛋白分析儀對(duì)大鼠血液血紅蛋白測(cè)定，用南京建成生物科技有限公司生成的血磷、鈣和堿性磷酸酶試劑盒測(cè)定血清磷、鈣和堿性磷酸酶。

1.2動(dòng)物分組 按體重給大鼠進(jìn)行編號(hào)標(biāo)注，隨機(jī)取出大鼠裝入分4組飼養(yǎng)籠，同條件常規(guī)飼養(yǎng)，用不含豆粉飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.3對(duì)照組 隨機(jī)取出其中一組20只大鼠，常規(guī)消毒后，用戊巴比妥鈉晶體配制成濃度為10 g/L注射液，按3.0 mg/kg吸取注射液注入腹腔，在大鼠進(jìn)入麻醉后，從脊椎骨兩側(cè)的背部卵巢對(duì)應(yīng)部位切開進(jìn)入腹腔，勾出卵巢和其周圍脂肪墊，深顏色是卵巢，淺顏色是脂肪墊，切除一塊相當(dāng)于卵巢大小脂肪墊，注意不傷及卵巢。

1.4OVX和鉛中毒動(dòng)物模型的建立 隨機(jī)取出其中一組20只大鼠，常規(guī)消毒后，用戊巴比妥鈉晶體配制成濃度為10 g/L注射液，按3.0 mg/kg吸取注射液注入腹腔，在大鼠進(jìn)入麻醉后，從脊椎骨兩側(cè)的背部卵巢對(duì)應(yīng)部位切開進(jìn)入腹腔，勾出卵巢和其周圍脂肪墊，深顏色是卵巢，淺顏色是脂肪墊，小心分離出雙側(cè)卵巢并進(jìn)行切除，小心別劃破卵巢動(dòng)脈，縫合切除傷口后酒精消毒再涂擦三慶大注射液，避免切口感染。切下組織塊要鑒定確為卵巢組織。同樣方法再對(duì)其他兩組大鼠OVX。

1.5用藥 烏圓口服液+OVX(W+OVX)組,在去卵巢1 w后，用按6 ml/kg劑量進(jìn)行灌胃，每周用藥5 d，每天用藥1次，連續(xù)8 w。山茶籽+烏圓口服液+OVX(H+W+OVX)組,去卵巢1 w后用3 ml/kg烏圓口服液+3 ml/kg山茶籽醇提物溶液劑量的混合液進(jìn)行灌胃，每周用藥5 d，每天用藥1次，連續(xù)8 w，山茶籽醇提物3 ml/kg，相當(dāng)于5 g生藥/kg。對(duì)照組在切除脂肪墊1 w后，用按6 ml/kg劑量生理鹽水進(jìn)行灌胃，每周用藥5 d，每天用藥1次，連續(xù)8 w。

1.6檢測(cè)指標(biāo) 骨組織(鏡下骨組織結(jié)構(gòu))；血清磷、鈣和堿性磷酸酶、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和雌二醇。

1.7實(shí)驗(yàn)取材和測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第8 w后，各實(shí)驗(yàn)組在麻醉大鼠后采其心血5 ml，失血致死取后雙右股骨。吸取20 μl血測(cè)定血紅蛋白，測(cè)定方法是美國(guó)DS-5糖化血紅蛋白分析儀。2 ml用于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，用血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)器。其余血通過(guò)離心分離，取上層血清， -200℃條件下密封存放待測(cè)。血磷、鈣和血堿性磷酸酶用南京建成試劑盒進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用放射免疫化學(xué)發(fā)光方法測(cè)定雌二醇濃度。各組股骨制成骨切片染色后放大100倍觀察其鏡下組織形態(tài)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各實(shí)驗(yàn)組光鏡下骨切片組織結(jié)構(gòu) 對(duì)照組骨皮質(zhì)厚，骨小梁稀疏均勻，骨細(xì)胞大小一致，整齊排列,鈣鹽豐富，均勻沉積。OVX組骨皮質(zhì)明顯薄，骨細(xì)胞大小不等，排列參差不齊紊亂。骨小梁疏密不均、斷裂不全，沉積鈣鹽減少，顏色變淺，髓腔擴(kuò)大明顯，表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松鏡下改變。W+OVX組的光鏡下骨切片組織結(jié)構(gòu)還是有明顯骨質(zhì)疏松病理特征，與OVX組有相似病理改變，病理改善不明顯。H+W+OVX組光鏡下骨切片組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出疏松的病變明顯改善。骨皮質(zhì)厚，骨小梁稀疏均勻，骨細(xì)胞大小一致，整齊排列,鈣鹽豐富，均勻沉積。見圖1。

圖1 股骨骨組織光鏡結(jié)構(gòu)圖(HE染色，×100)

2.2各組血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血雌二醇測(cè)定比較 待結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)候，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)大鼠無(wú)一脫失，均取得相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與對(duì)照組比較，OVX組的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和雌二醇明顯降低(P<0.05)；與OVX組比較，H+OVX組和H+W+OVX組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和雌二醇明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與W+OVX組比較，H+W+OVX組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白雌二醇明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組血磷、鈣和堿性磷酸酶比較 與對(duì)照組比較，OVX組和W+OVX組血磷、鈣明顯降低(P<0.05)，血堿性磷酸酶明顯升高(P<0.05);與OVX組比較，H+W+OVX組血鈣、磷明顯升高(P<0.05)，血堿性磷酸酶明顯降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和雌二醇測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與OVX組比較:2)P<0.05,3)P<0.01；與H+OVX組比較:4)P<0.05，下表同

表2 各實(shí)驗(yàn)組血磷、鈣和堿性磷酸酶的測(cè)定結(jié)果

3 討 論

OVX使得機(jī)體主要雌激素來(lái)源去除，自然體內(nèi)(包括血液在內(nèi))雌激素急劇下降，引起一系列雌激素缺乏的病理生理的改變，比如更年期綜合征，記憶力減退，最為明顯的是老年女性骨質(zhì)疏松〔1，2〕。也有造血功能下降導(dǎo)致貧血，氣喘乏力臨床表現(xiàn)。

骨細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)雌激素提高成骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化能力，骨細(xì)胞周圍基質(zhì)增加明顯〔3,4〕。雌激素體內(nèi)水平下降引起骨質(zhì)流失和生成呈負(fù)平衡，磷、鈣降低。鈣鹽是骨的支架，也是骨堅(jiān)硬所在。血鈣升高對(duì)甲狀旁腺分泌的激素，甲狀旁腺激素(也稱升鈣素)有抑制作用。長(zhǎng)時(shí)間低鈣回引起甲狀旁腺主細(xì)胞分泌升鈣素，而升鈣素促進(jìn)進(jìn)骨質(zhì)中鈣鹽中的鈣溶解稀出，提高游離血鈣，骨磷伴隨流失。隨著低鈣的延長(zhǎng)，低鈣所致骨質(zhì)疏松日益加重。骨質(zhì)疏松引起體內(nèi)促進(jìn)骨質(zhì)合成激素增加，骨代謝顯得更加活躍，而骨代謝活躍觀察指標(biāo)就是堿性磷酸酶，所以O(shè)VX組大鼠堿性磷酸酶升高〔5〕。臨床使用雌激素類制劑和降鈣素防治骨質(zhì)流失，就是基于上述機(jī)制〔6,7〕。

雌激素缺少引起骨質(zhì)流失同時(shí)，也會(huì)影響骨髓造血功能引起紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白下降。中成藥烏圓口服液具有補(bǔ)血功能，提高骨髓造血功能，從而提高模型組的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白量，但改善貧血功能沒有H+W+OVX組明顯，說(shuō)明對(duì)于老年雌激素缺乏貧血患者，在使用補(bǔ)血藥物同時(shí)，加用雌激素類藥物，治療貧血效果更好。烏圓口服液也不能改善骨質(zhì)疏松的病理改變，而補(bǔ)血藥加上雌激素類藥物，既可以治療老年雌激素缺乏伴有貧血〔8～10〕，又可治療老年女性雌激素缺乏骨質(zhì)疏松。因?yàn)榇萍に赝ㄟ^(guò)提高護(hù)骨素，減少核因子-κB 受體活化因子配體(RANK)，活躍成骨細(xì)胞，壓抑破骨細(xì)胞，從而增加骨質(zhì)合成，抑制骨質(zhì)流失。所以山茶籽聯(lián)合烏圓口服液既護(hù)骨又補(bǔ)血雙重作用。