陳 紅，蔡真真，林麗虹，張清華，程再興

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

細(xì)胞色素P450 酶素（CYP）中的CYP3A 參與臨床約50%藥物的代謝，是最重要的P450 酶之一，同時(shí)CYP3A 被誘導(dǎo)或抑制是藥物產(chǎn)生代謝性相互作用的主要原因。 研究藥物對(duì)CYP3A 的影響，可以預(yù)測(cè)藥物間的相互作用，從而提高療效，減少不良反應(yīng)［1-2］。 巴 戟 天 為 茜 草 科 植 物 巴 戟 天（Morinda Officinalis How）的干燥根，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用，為“四大南藥”之一，臨床中除用生巴戟天飲片外，還有鹽巴戟天和制巴戟天飲片，其不同飲片的功效和臨床應(yīng)用各有側(cè)重?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天不僅具有與功效相關(guān)的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕等藥理作用外，還有抗腫瘤、抗抑郁等作用［3-5］，而巴戟天對(duì)肝藥酶的影響研究較少，本文通過(guò)采用肝微粒體體外溫孵法、定量PCR 和Western blot 技術(shù)，觀察巴戟天不同炮制品對(duì)CYP3A 活性、蛋白及mRNA 表達(dá)的影響，為巴戟天臨床配伍用藥和深入研究其炮制機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材 巴戟天產(chǎn)自福建永定，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為茜草科植物巴戟天（Morinda Officinalis How）的干燥根，符合2015 版《中國(guó)藥典》的要求。

1.3 試劑與儀器 苯甲基磺酰氟化物、二硫蘇糖醇（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；Agilent 1290 超高效液相色譜儀（UPLC，美國(guó)Agilent 公司）；Elix 超純水系統(tǒng) （美國(guó)Milipore 公司）；solutionA、B （還原型輔酶A、B 溶液，美國(guó)BD biosciences 公司）；睪酮、6β-羥基睪酮（日本nacalaitesque 公司，純度＞98%）；吉非貝齊（內(nèi)標(biāo)，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，純度＞98%）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；大鼠CYP3A 抗體一抗（兔抗鼠抗體，美國(guó)Abcam 公司）；二抗（羊抗兔抗體，美國(guó)Santa Cruz 公司）；BT25S型精密電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；CS150NX型超高速離心機(jī)（日本Hitachi 公司）；pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo 公司）；酶標(biāo)儀、垂直電泳系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD 公司）；MS3digital 型渦旋 振 蕩 器（德 國(guó)IKA 公司）；5810R 型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；ABI 7500 PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied biosystems 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試液的制備 分別稱取巴戟天不同飲片，用10 倍量水浸泡30 min 后，煎煮30 min，過(guò)濾后再加5 倍量水煎煮30 min，合并煎煮液，減壓濃縮，1 000 r／min 離心5 min，去沉淀，得濃度為0.2 g／mL（生藥重／藥液體積，下同）藥液，取部分稀釋成0.1 g／mL 和0.5 g／mL 濃度的藥液，低溫保存?zhèn)溆茫?］。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 將110 只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、苯巴比妥0.1 g／kg 劑量組和生／制／鹽巴戟天2.0、1.0、0.5 g／kg 劑量組，連續(xù)予相應(yīng)劑量的藥液灌胃給藥7 d（空白對(duì)照組給予等量蒸餾水）。

2.3 肝微粒體制備 大鼠連續(xù)給藥7 d 后，用烏拉坦（50% w／v，每只約0.6 mL）腹腔注射麻醉，用冰冷的肝臟沖洗液從肝門靜脈在體沖洗肝臟至土黃色，剪取同部位肝臟組織（5.0±0.5） g 置于沖洗液中，在4 ℃冷庫(kù)將其切碎，用冰冷的勻漿緩沖液勻漿。 勻漿液10 400 r／min 離心15 min；取上層溶液35 000 r／min 離心1 h，得肝微粒體。 所得肝微粒體均勻混懸于250 mmol／mL 蔗糖中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫?］。 肝微粒體總蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。

2.4 Ⅰ相代謝反應(yīng)體系及分析 在450 μL KPI 溶液中分別加入25 μL Solution A、5 μL Solution B 和10 μL 肝微粒體懸液，37 ℃、150 r／min 下水浴搖床預(yù)孵育5 min，再加入10 μL 睪酮（4、10、30 μmol／L）繼續(xù)孵育7／15 min，取出后立即冰浴并加入4 mL 冰冷二氯甲烷終止反應(yīng)， 加入10 μL 的2 mmol／L 吉非貝齊作為內(nèi)標(biāo)，3 000 r／min 渦旋8 min 后，1 000 r／min 離心15 min，取下層液3.5 mL，置于真空干燥箱中干燥后-20 ℃保存。 分析時(shí)加入100 μL 乙腈渦旋3 min，再加入100 μL 超純水渦旋3 min，13 000 r／min 離心30 min，取上清液10 μL，UPLC 進(jìn)樣分析，代謝速率以6β-羥基睪酮的生成量進(jìn)行計(jì)算［8］。

2.5 色譜條件 色譜系統(tǒng)：Agilent 1290 Infinity UPLC System，Agilent RRHDSB-C18 色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 m），流動(dòng)相A 乙腈，流動(dòng)相B 水（0～2.5 min，70%～10% B；2.5～4 min，10%～50% B；4～5 min，50%～70% B；5～6 min，70% B），流速0.4 mL／min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，洗脫時(shí)間6 min，進(jìn)樣體積10 μL。

2.6 Western blot 實(shí)驗(yàn) 取10 μg 肝微粒體蛋白，用10% SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)印到PVDF 膜，再用含有5%脫脂牛奶的TBST 封閉2 h。 漂洗后將膜與CYP3A 一抗（1∶3 000）置于4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST清洗膜3 次，每次5 min，加入二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h。 采用ECL 試劑使膜發(fā)光，并通過(guò)Quantity One（Bio-Rad）對(duì)蛋白條帶進(jìn)行熒光定量，結(jié)果采用灰度值進(jìn)行分析。

2.7 PCR 實(shí)驗(yàn) 肝臟組織中總RNA 采用TRIzol提取法進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，于PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。 擴(kuò)增中所需CYP3A引物按照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行設(shè)計(jì)，CYP3A1：forward primer 5′-GGAAATTCGATGTGGAGTGC-3′，reverse primer 3′-AGGTTTGCCTTTCTCTTGCC-5′；CYP3A2：forward primer 5′-AGTAGTGACGATTCCAACATAT-3′，reverse primer 3′-TCAGAGGTATCTGTGTTTCCT-5′；GAPDH：forward primer 5′-CTGTGGTCATGAGCCCC TCC-3′，reverse primer 3′-CGCTGGTGCTGAGTATG TCG-5′。 結(jié)果采用2-ΔΔCT值進(jìn)行分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 巴戟天不同炮制品對(duì)CYP3A 酶活性的影響見表1。

表1 巴戟天不同炮制品對(duì)大鼠肝微粒體Ⅰ相代謝體系中6β-羥基睪酮生成速率影響的比較（±s，n＝3）nmol／（mg·min）

表1 巴戟天不同炮制品對(duì)大鼠肝微粒體Ⅰ相代謝體系中6β-羥基睪酮生成速率影響的比較（±s，n＝3）nmol／（mg·min）

注：與空白對(duì)照組比較，1） P＜0.05；與相應(yīng)劑量及底物濃度的生巴戟天組比較，2） P＜0.05。

組別空白對(duì)照組苯巴比妥組生巴戟天組制巴戟天組鹽巴戟天組劑量／（g／kg）—0.1 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 4 μmol／L 1.52±0.02 2.49±0.451）2.32±0.311）2.46±0.581）1.70±0.11 2.57±0.091）2.67±0.311）3.40±0.201）2）2.48±0.141）3.31±0.231）2）2.59±0.171）2）睪酮濃度10 μmol／L 2.23±0.13 3.68±0.101）3.29±0.221）3.28±0.181）2.38±0.16 3.58±0.121）3.75±0.441）2）5.01±0.391）2）3.62±0.081）5.02±0.221）2）3.96±0.161）2）30 μmol／L 3.07±0.12 5.38±0.161）4.54±0.171）4.74±0.551）3.37±0.16 4.95±0.371）4.62±0.831）7.26±0.281）2）4.48±0.181）6.59±0.371）2）5.40±0.501）2）

3.2 巴戟天不同炮制品對(duì)CYP3A 酶蛋白和mRNA表達(dá)的影響 見表2。

4 討 論

P450 酶的被誘導(dǎo)或抑制與藥物間產(chǎn)生的代謝性相互作用密切相關(guān)，當(dāng)P450 酶被抑制時(shí)會(huì)導(dǎo)致共服藥物代謝減慢，血藥濃度出現(xiàn)不可預(yù)期的升高，引發(fā)副作用甚至引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，當(dāng)被誘導(dǎo)時(shí)又可導(dǎo)致共服藥物代謝加快而使藥效降低。 P450 蛋白和mRNA 表達(dá)水平的變化是引起酶活性變化的主要機(jī)制。 在大鼠肝臟中CYP3A 主要包括CYP3A1、CYP3A2 和CYP3A23 等 亞 型，其 中CYP3A1 和CYP3A2是最主要的亞型，參與多數(shù)臨床用藥的代謝過(guò)程［1-2，10］。

表2 巴戟天不同炮制品對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A 蛋白和肝組織CYP3A mRNA 表達(dá)水平影響的比較（±s，n＝3）

表2 巴戟天不同炮制品對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A 蛋白和肝組織CYP3A mRNA 表達(dá)水平影響的比較（±s，n＝3）

注：與空白對(duì)照組比較，1） P＜0.05；與相應(yīng)劑量及底物濃度的生巴戟天組比較，2） P＜0.05。

組別空白對(duì)照組苯巴比妥組生巴戟天組制巴戟天組鹽巴戟天組劑量／（g／kg）—0.1 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0蛋白表達(dá)水平1.00±0.00 3.44±0.121）3.15±0.081）3.57±0.581）2.30±0.041）2.19±0.351）1.94±0.172）2.66±0.171）2.30±0.361）2.57±0.881）4.03±1.591）2）mRNA 表達(dá)水平CYP3A1 1.00±0.00 3.82±0.211）3.14±0.081）3.57±0.561）2.31±0.041）2.30±0.361）2.57±0.881）4.03±1.591）2）2.19±0.351）1.94±0.172）2.66±0.211）CYP3A2 1.00±0.00 2.98±0.091）2.20±0.021）1.69±0.01 1.96±0.011）2.11±0.081）2.11±0.031）2）2.11±0.021）2.14±0.081）3.29±1.141）2.15±0.931）

中藥在采用藥汁或輔料炮制后可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)P450 增強(qiáng)或減弱的作用，從而改變組方用藥后的效果，同時(shí)也可能會(huì)導(dǎo)致自身某些成分代謝的加快或減慢而改變藥理作用。 巴戟天主要含有水晶蘭苷等環(huán)烯醚萜類、甲基異茜草素等蒽醌類和巴戟天多糖及揮發(fā)油等，通過(guò)鹽和甘草汁制后環(huán)烯醚萜類和蒽醌類等成分都會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致生、鹽、制巴戟天功效發(fā)生變化［11-15］。

本文研究結(jié)果表明，生巴戟天在《中國(guó)藥典》規(guī)定的3～10 g（人用量，下同）劑量范圍內(nèi)對(duì)大鼠肝藥酶CYP3A 活性有誘導(dǎo)作用，當(dāng)達(dá)到20 g 的劑量時(shí)對(duì)CYP3A 不具有誘導(dǎo)作用，而制巴戟天和鹽巴戟天在5 g、10 g 和20 g 的劑量下對(duì)CYP3A 均有誘導(dǎo)作用，其中制巴戟天隨著劑量的增加誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，而鹽巴戟天在10 g 劑量下的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。 生巴戟天經(jīng)過(guò)甘草汁制后， 在5 g 和10 g 劑量下對(duì)CYP3A的誘導(dǎo)作用未發(fā)生明顯變化，在20 g 的劑量下誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)；經(jīng)用鹽炮制后，在5 g 劑量下誘導(dǎo)作用也未發(fā)生明顯變化，在10 g 和20 g 的劑量下誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)。 巴戟天各種炮制品均可誘導(dǎo)CYP3A 蛋白和CYP3A1、CYP3A2 mRNA 的表達(dá)增加。

以上結(jié)果說(shuō)明巴戟天在炮制前后對(duì)CYP3A 均有一定的誘導(dǎo)作用，用甘草汁和鹽炮制后誘導(dǎo)作用進(jìn)一步增強(qiáng)，尤其是甘草汁制巴戟天隨著用藥量的增加，誘導(dǎo)作用也隨之增強(qiáng)，主要機(jī)理可能與其可誘導(dǎo)CYP3A 蛋白及CYP3A1、CYP3A2 mRNA 的表達(dá)增加有關(guān)。 炮制后誘導(dǎo)作用的增強(qiáng)將會(huì)進(jìn)一步加速某些成分在體內(nèi)的代謝，巴戟天炮制后抗炎鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)濕作用減弱，而補(bǔ)腎助陽(yáng)作用突顯，這可能與相關(guān)成分的代謝增加有一定的關(guān)系。 由于中藥成分體系的復(fù)雜性，還需要進(jìn)一步明確巴戟天不同功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)及其體內(nèi)過(guò)程等相關(guān)內(nèi)容，才能更進(jìn)一步地揭示巴戟天采用鹽和甘草汁炮制的機(jī)理。