羅小軍，喬麟軼，李 欣，郭慧娟，閻曉濤，張樹(shù)偉，常利芳，閆金龍，暢志堅(jiān)，張曉軍

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西省主要農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點(diǎn)科技創(chuàng)新平臺(tái)，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所，山西長(zhǎng)治046011）

中間偃麥草（Thinopyrum intermedium，2n＝42）是禾本科多年生植物，是普通小麥近緣物種之一，它根系發(fā)達(dá)，耐寒性極強(qiáng)，免疫白粉、條銹、葉銹、稈銹等多種病害，并且有較強(qiáng)的耐鹽堿、耐旱和耐低溫性，再生性好、適應(yīng)性廣等特性，是小麥遺傳改良中重要的三級(jí)基因源[1-3]。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)將中間偃麥草中優(yōu)良基因?qū)胄←溁蚪M中，選育和創(chuàng)造出人類(lèi)需要的種質(zhì)資源，同時(shí)對(duì)小麥優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病、抗逆等遺傳改良將起到積極的促進(jìn)作用[3]。孫善澄[4]采用有性雜交、連續(xù)回交和后代定向選擇的方法，利用小麥和中間偃麥草選育出了中1、中2、中3、中4、中5 等5 個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的八倍體小偃麥新物種小麥-中間偃麥草部分雙二倍體，具有高抗條銹、葉銹、稈銹等優(yōu)良性狀，其中，中4、中5 高抗小麥黃矮病。BAO 等[5]從普通小麥與中間偃麥草雜種后代中選育出了TE253 和TE257 等10 個(gè)TE系列，可能攜帶有不同的優(yōu)良基因八倍體小偃麥。區(qū)別于親本，八倍體小偃麥表現(xiàn)出莖稈粗壯，穗長(zhǎng)優(yōu)于主栽品種，結(jié)實(shí)率高、穗粒數(shù)多等優(yōu)良農(nóng)藝性狀。培育小麥-中間偃麥草的雙二倍體及部分雙二倍體，并以這些雙二倍體為橋梁創(chuàng)制與小麥親緣關(guān)系更近的異附加系、異代換系和易位系等，是克服直接遠(yuǎn)緣雜交困難、雜種不育和雜種后代瘋狂分離的有效手段。CHANG 等[6]利用普通小麥與中間偃麥草雜交獲得了TAI7044、TAI7045、TAI7047、TAI8335 等多個(gè)八倍體小偃麥，并用這些八倍體小偃麥作為橋梁親本，繼續(xù)與小麥進(jìn)行雜交、回交，選育出了CHadd7001、CHadd7002，豐富了小麥的遺傳資源，也是中間偃麥草有用基因向小麥轉(zhuǎn)移的重要載體。

本研究以八倍體小偃麥TAI7047 作為母本與普通小麥雜交，回交育成的高代新品系CH188 進(jìn)行農(nóng)藝性狀、細(xì)胞學(xué)和分子標(biāo)記綜合鑒定，確定其優(yōu)良農(nóng)藝性狀以及導(dǎo)入小麥基因組中的外源染色體，為后續(xù)鑒定染色體組成、抗病性、抗逆性，利用該小麥近緣種質(zhì)資源提供重要信息。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

TAI7047、CH188 由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所選育。TAI7047 由暢志堅(jiān)等育成，源于普通小麥與中間偃麥草雜交后代的八倍體小偃麥新類(lèi)型，TAI7047 的系譜為太原768/中間偃麥草//系76（64）。CH188 為普通小麥晉太170 與TAI7047 雜交，回交后選育的高代穩(wěn)定品系。晉太170 為國(guó)審優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種，由溫輝芹等[7]提供。中國(guó)春為分子標(biāo)記的對(duì)照組。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查 2018—2019 年將TAI7047、CH188、晉太170 和中間偃麥草在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所創(chuàng)新基地日光溫室進(jìn)行播種，每份種3 行，行長(zhǎng)150 cm，行寬20 cm，每行20 粒，待材料成熟后進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀的調(diào)查，從每份材料中抽取10 個(gè)單株，測(cè)量株高、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、小穗數(shù)、千粒質(zhì)量。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)鑒定 根尖有絲分裂中期染色體制備參考文獻(xiàn)[8]。將10 株小麥-中間偃麥草異代換系CH188 材料，編號(hào)為1～10，每單株選取10 粒種子進(jìn)行根尖細(xì)胞有絲分裂染色體中期數(shù)目的觀察，步驟如下：將5 粒種子放在蘸有水的濾紙上，在24 ℃下發(fā)根，等種子露白在4 ℃冰箱處理24 h 后置于24 ℃，發(fā)育到根尖長(zhǎng)到1.0～1.5 cm，剪取1 cm長(zhǎng)根尖，放在管壁噴有水的離心管中，并置于冰中，然后在0.9 MPa N2O 中處理2 h 后，把根尖放在90%冰醋酸（保證整個(gè)根尖浸沒(méi)其中）10 min 后，用蒸餾水洗滌3 次，吸水紙吸干根尖后，把根尖放在果膠酶和纖維素酶中，37 ℃酶解50～60 min，然后用70%酒精洗滌2 次，無(wú)水酒精洗滌1次，用解剖針把根尖搗碎，用移液槍混勻并吸取6.5 μL 于載玻片上方滴片，15 min 后在在相差顯微鏡鏡下觀察中期染色體分裂相，選擇細(xì)胞染色體完整且分散均勻的片子，記錄染色體的分散情況和數(shù)目。

1.2.3 分子標(biāo)記 試驗(yàn)材料剪根后栽種于花盆內(nèi)，生長(zhǎng)至三葉期時(shí)取其細(xì)嫩的葉片，利用CTAB 法[9]提取CH188、中間偃麥草、中國(guó)春總DNA。利用CTAB法提取總DNA。作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)中間偃麥草的Contig 序列，開(kāi)發(fā)并篩選出了160 對(duì)中間偃麥草第六同源群特異STS 標(biāo)記[10]，以中間偃麥草、中國(guó)春（中國(guó)春為對(duì)照）、CH188 為DNA 模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為15 μL，包括7.5 μL Taq PCR Mix 預(yù)混液（生工生物工程（上海）股份有限公司，Order NO.B639295），2 μL 模板DNA（50 ng/μL），1.8 μLPrimers（50 ng/μL，生工生物工程（上海）股份有限公司合成），3.7 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55～65 ℃（不同Primers 略有不同）退火30 s，72 ℃延伸25 s，共34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳條件為恒壓220 V，50 min，硝酸銀染色后顯色照相并觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥-中間偃麥草代換系CH188 的主要農(nóng)藝性狀

由表1 可知，代換系CH188 株高為70.60 cm，穗長(zhǎng)為14.60 cm，小穗數(shù)和穗粒數(shù)分別為28.30 個(gè)和55.4 粒，明顯優(yōu)于親本晉太170 和TAI7047，經(jīng)幾年的種植鑒定，CH188 農(nóng)藝性狀比較穩(wěn)定，較好的結(jié)合了親本的優(yōu)良性狀。

表1 CH188、中間偃麥草、TAI7047、晉太170 主要農(nóng)藝性狀比較

2.2 小麥-中間偃麥草代換系CH188 的細(xì)胞學(xué)鑒定

對(duì)小麥-中間偃麥草代換系CH188 材料進(jìn)行根尖細(xì)胞有絲分裂染色體中期數(shù)目的觀察發(fā)現(xiàn)（圖1、表2），每1 株小麥-中間偃麥草代換系CH188材料根尖細(xì)胞染色體數(shù)目平均數(shù)接近42 條，預(yù)測(cè)CH188 染色體數(shù)目恒定，為小麥-中間偃麥草代換系，結(jié)合CH188 有穩(wěn)定的農(nóng)藝性狀，可以推測(cè)出CH188 屬于穩(wěn)定材料。

表2 CH188 材料根尖有絲分裂中期染色體的分散情況與數(shù)目

2.3 小麥-中間偃麥草代換系CH188 的分子標(biāo)記

中間偃麥草第6 同源群Contig 序列開(kāi)發(fā)了160個(gè)STS 標(biāo)記，位于G6-Chr1、G6-Chr2、G6-Chr3染色體的STS 標(biāo)記分別為58、59、43 個(gè)。利用這些STS標(biāo)記對(duì)中間偃麥草、中國(guó)春、CH188 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示（圖2），只有G6-Chr2 染色體的STS標(biāo)記在中間偃麥草、CH188中均擴(kuò)增出與目標(biāo)片段一致的條帶，而在中國(guó)春中未擴(kuò)增出該條帶。位于G6-Chr2 染色體STS標(biāo)記擴(kuò)增出特異性條帶的8個(gè)標(biāo)記分別被命名為L(zhǎng)D17-22、LD17-32、LD17-72、LD17-100、LD17-102、LD17-114、LD17-150、LD17-171。G6-Chr2 已被證實(shí)為中間偃麥草的6St 染色體[10]，結(jié)合田間農(nóng)藝性狀、細(xì)胞學(xué)鑒定的結(jié)果，可以推測(cè)小麥-中間偃麥草代換系CH188 為小麥的一對(duì)染色體被中間偃麥草6St 染色體替代。

3 結(jié)論與討論

中間偃麥草是小麥外源基因利用較早，也較成功的物種之一，其染色體中優(yōu)良基因一直是人們研究的重點(diǎn)。通過(guò)農(nóng)藝性狀調(diào)查可知，CH188 表現(xiàn)出的莖稈粗壯，小穗數(shù)、每穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量都優(yōu)于主栽品種，后續(xù)經(jīng)幾年的種植鑒定，CH188 農(nóng)藝性狀比較穩(wěn)定，較好地結(jié)合了親本的優(yōu)良性狀。結(jié)合100 份CH188 材料觀察根尖細(xì)胞有絲分裂中期數(shù)目為42 條，說(shuō)明CH188 具有與普通小麥一致的染色體數(shù)目,細(xì)胞學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)。

形態(tài)學(xué)具有鑒定操作簡(jiǎn)單、直觀等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)，科研工作者把形態(tài)學(xué)方法作為鑒定和篩選新品種的首選方法[11-13]，但是形態(tài)學(xué)鑒定易受環(huán)境條件的影響，主觀判斷依賴(lài)于豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為其新種質(zhì)材料的鑒定提供了新的發(fā)展方向，但迄今為止，中間偃麥草的全基因組數(shù)據(jù)尚未公布，其特異分子標(biāo)記的篩選主要來(lái)自二倍體長(zhǎng)穗偃麥草和擬鵝冠草[14-15]，以及部分利用PLUG 標(biāo)記轉(zhuǎn)化的EST-STS 或SCAR 標(biāo)記[16-17]，對(duì)鑒定材料中中間偃麥草染色體片段存在較大的局限性。本研究基于中間偃麥草第六同源群Contig 序列開(kāi)發(fā)的160 個(gè)STS 標(biāo)記，其中，位于G6-Chr1、G6-Chr2、G6-Chr3 染色體的STS 標(biāo)記分別為58、59、43 個(gè)[10]，利用這些標(biāo)記在中間偃麥草、中國(guó)春、CH188 中擴(kuò)增，只有G6-Chr2 染色體的STS 標(biāo)記在中間偃麥草、CH188 中均擴(kuò)增出與目標(biāo)片段一致的條帶，而在中國(guó)春中未擴(kuò)增出該條帶。在相關(guān)文獻(xiàn)中也證實(shí)了G6-Chr2 為中間偃麥草的6St 染色體[8]，推測(cè)CH188是小麥中的一對(duì)染色體被中間偃麥草中的6St 替代的異代換系。小麥-中間偃麥草CH188 優(yōu)良的農(nóng)藝性狀可以作為小麥遺傳改良的優(yōu)良資源加以利用，同時(shí)為下一步原位雜交技術(shù)驗(yàn)證確定染色體構(gòu)成，深度分析鑒定抗病性、抗逆性提供有利資源。